李 勛， 湯 地， 周 奇， 王寰昱， 陳健聰， 朱曉旭， 殷曉煜， 梁力建

(中山大學附屬第一醫(yī)院肝膽外科，廣東 廣州 510080)

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骨形成蛋白3在肝門部膽管癌組織中的表達及其臨床意義*

李 勛， 湯 地△， 周 奇， 王寰昱， 陳健聰， 朱曉旭， 殷曉煜， 梁力建

(中山大學附屬第一醫(yī)院肝膽外科，廣東 廣州 510080)

目的： 探討肝門部膽管癌組織中骨形成蛋白3(BMP3)的表達情況及其臨床意義。方法：收集30例肝門部膽管癌的臨床標本，應用real-time PCR和Western blot檢測BMP3 mRNA 和蛋白在癌組織和癌旁組織的相對表達情況。收集103例肝門部膽管癌石蠟標本，免疫組織化學法檢測腫瘤組織中BMP3蛋白的表達，并分析其與臨床病理的關系。結果：全組30例肝門部膽管癌組織中，22例癌組織BMP3蛋白和mRNA的表達水平較癌旁組織明顯下降。免疫組織化學方法顯示103例肝門部膽管癌組織中，87例陰性，16例弱陽性，BMP3蛋白的表達與腫瘤TNM分期、淋巴結轉移、腫瘤的分化程度密切相關(P<0.05)。結論：肝門部膽管癌組織中BMP3基因處于抑制狀態(tài)，其表達的下調可能與肝門部膽管癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關。

肝門部膽管癌； 骨形成蛋白3

骨形成蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)是從骨基質分離提純的一類具有高效誘導骨、骨軟骨形成的酸性糖蛋白。除 BMP1 外其余均屬于轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族[1]。既往研究表明 BMPs 蛋白參與體內多種重要的生物學過程，BMP 蛋白的表達與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[2-3]。雖然已有大量研究探討了 BMP 家族成員在腫瘤形成中的作用，如 BMP2、BMP4和BMP7等[3-5]，但是BMP3在癌癥中作用的研究仍然很少。本研究旨在檢測BMP3在肝門部膽管癌組織中的表達，并探討其臨床意義。

材 料 和 方 法

1 一般資料

選取中山大學附屬第一醫(yī)院2013年1月～2014年8月期間手術切除的肝門部膽管癌組織及其癌旁組織標本30例，其中男性18例，女性12例，年齡32～81歲，平均年齡58.2歲。所有標本均于離體30 min內切成0.5 cm ×0.5 cm ×0.5 cm大小，并置于液氮中迅速冷凍，后于-80 ℃保存。癌旁組織取距離腫瘤邊緣1 cm處的膽管組織。收集中山大學附屬第一醫(yī)院2003年1月～2013年1月期間手術切除的肝門部膽管癌石蠟標本103例，其中男性63例，女性40例，年齡36～75歲，平均年齡56.7歲。腫瘤直徑為1～5 cm，平均為2.43 cm，有淋巴結轉移36例，全組無遠處轉移。Bismuth-Corlette分期為Ⅰ期10例，Ⅱ期25例，ⅢA期24例，ⅢB期23例，Ⅳ期21例。MSKCC分期為T1期65例，T2期25例，T3期13例。AJCC-7版腫瘤TNM分期為Ⅰ期10例，Ⅱ期55例，ⅢA期2例，ⅢB期21例，Ⅳ期15例。所有病例均經過術后病理證實，且術前未進行放、化療。

2 方法

2.1 Real-time PCR實驗 將30例新鮮手術標本組織剪成小塊，在液氮中磨成粉末，稱取100 mg組織加入1 mL Trizol(Invitrogen)，根據(jù)說明抽提總RNA。用NanoDrop 2000(Thermo)測定RNA濃度，RNA純度為1.8～2.0時，采用TOYOBO ReverTra Ace qPCR RT Master Mix試劑盒(TOYOBO)逆轉錄cDNA。實時定量PCR采用Applied Biosystems power SYBR Green PCR Master Mix 試劑盒(Life Technologies)，根據(jù)說明在ABI 7500中操作完成。反應條件為95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。BMP3的上游引物序列為5’-CCCAAGTCCTTTGATGCCTA-3’，下游引物序列為5’-TGGTACACAGCAAGGCTCAG-3’；β-actin 的上游引物序列為5’-ACAATGTGGCCGAGGACTTT-3’，下游引物序列為5’-GGAGAGGACTGGGCCATTCT-3’。結果以β-actin為內參照。BMP3的mRNA表達量以2-ΔΔCt值計算。BMP3的ΔCt值=BMP3 Ct值-β-actin Ct值；BMP3的ΔΔCt值=腫瘤BMP3的ΔCt值-癌旁BMP3的ΔCt值。

2.2 Western blot實驗 將30例新鮮手術標本組織剪碎液氮中研磨，加入RIPA裂解液(含1% PMSF)(中國鼎國生物技術有限公司)提取腫瘤組織和癌旁組織的總蛋白，BCA試劑盒(中國鼎國生物科技有限公司)檢測蛋白濃度，取40 μg的蛋白上樣量通過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，以25 mV、0.4 mA、45 min的半干轉條件將目的蛋白轉移至0.45 nm的NC膜(PALL)，用5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入BMP3抗體(1∶200稀釋，Abcam)和β-actin抗體(1∶10 000稀釋，中國武漢三鷹生物技術有限公司)，4 ℃冰上搖床過夜。TBST洗膜3次后，予以熒光兔抗和鼠抗(1∶10 000，LI-COR)室溫避光孵育1 h。TBST洗膜3次后，于Oddesy雙色紅外激光成像系統(tǒng)(LI-COR)掃膜成像。

2.3 免疫組織化學實驗 將石蠟標本以4 μm厚切片，經過二甲苯、梯度乙醇脫蠟脫水后，于檸檬酸鹽緩沖液中行微波抗原修復20 min。待冷卻至室溫后，予以3%雙氧水封閉內源性過氧化物酶30 min。山羊血清封閉30 min后滴加BMP3抗體(1∶50稀釋)覆蓋組織，濕盒內放置4 ℃過夜。37 ℃復溫1h，滴加 II 抗(鼠/兔通用型 II 抗，Dako)30 min，顯微鏡下DAB顯色(1∶50稀釋，Dako)，蘇木素復染1 min，流水沖洗10 min，梯度乙醇二甲苯脫水后，中性樹膠封片。結果評定根據(jù)染色強度：0分(陰性)，1分(弱陽性)，2分(中等陽性)，3分(強陽性)；陽性細胞百分比：0分(≤5%)，1分(6%～25%)，2分(26%～50%)，3分(51%～75%)，4分(76%～100%)。染色強度得分乘以陽性細胞的得分為每張切片的免疫反應評分，0～1分為陰性，2～4分為弱陽性，5～7分為強陽性。每例標本由兩位病理學專家分別評定后再進行討論，直到達成一致。

3 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗，計數(shù)資料的比較采用2檢驗或Fisher確切概率法。

結 果

1 BMP3的mRNA在癌組織和癌旁組織中的表達

Real-time PCR檢測結果顯示，30例樣本中，有22例癌組織的BMP3表達明顯低于癌旁組織，3例癌組織與癌旁組織的差異不明顯，5例癌組織中BMP3的表達高于癌旁組織。其中癌組織中BMP3的mRNA平均相對表達量為0.58±0.29，癌旁組織中BMP3的mRNA平均相對表達量為0.99±0.04，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The mRNA expression of BMP3 in the tumor and para-cancerous tissues. The expression level of BMP3 mRNA in the tumor tissues was significantly lower than that in the parcancerous tissues (P<0.01). The mRNA levels were normalized to β-actin.

圖1 BMP3 mRNA 在腫瘤組織和癌旁組織中的相對表達情況

2 BMP3蛋白在癌組織和癌旁組織中的表達情況

Western blot檢測結果顯示，30例樣本中，22例患者腫瘤中的BMP3蛋白的表達水平較癌旁組織明顯降低，其表達情況與BMP3的mRNA表達一致。8例患者腫瘤中BMP3蛋白的表達水平與癌旁組織差異不明顯,見圖2。

Figure 2.The protein expression of BMP3 in the tumor and para-cancerous tissues. A: representative Western blots showing that BMP3 protein expression in the tumor tissues was significantly lower than that in the paracan-cerous tissues (n=22); B: representative Western blots showing that BMP3 protein expression in tumor and parcancerous tissues had no significant difference (n=8). T: tumor tissues; P: parcancerous tissues.

圖2 BMP3蛋白在腫瘤組織和癌旁組織中的表達情況

3 BMP3蛋白表達水平與臨床病理的關系

對103例肝門部膽管癌樣本進行免疫組織化學染色，結果顯示全組腫瘤組織中BMP3蛋白均無強陽性表達，16例弱陽性表達，87例陰性表達(圖3)。

BMP3蛋白的表達與腫瘤TNM分期、淋巴結轉移、腫瘤的分化程度密切相關(P<0.05)，見表1。在淋巴結轉移的患者中BMP3蛋白的表達明顯低于無淋巴結轉移者，AJCC-7版腫瘤TNM分期中Ⅲ期和Ⅳ期患者的BMP3蛋白的表達水平明顯低于Ⅰ期和Ⅱ期的患者。且腫瘤的惡性程度越高，分化程度越低，BMP3蛋白的表達量越低。而BMP3蛋白的表達與腫瘤Bismuth-Corlette分期、MSKCC分期、患者的年齡、性別、腫瘤直徑、血清中CA199、CA125和CEA的表達水平無關。

Figure 3.Representative immunohistochemical photomicrographs showing the expression of BMP3 in the tumor tissues and the para-cancerous tissues (×400). A: adjacent normal liver tissue (strong positive); B: poorly differentiated tumor tissue (negative); C: moderately differentiated tumor tissue (negative); D: well-differentiated tumor tissue (weak positive).

圖3 BMP3蛋白在肝門部膽管癌組織和癌旁組織中的表達情況

討 論

膽管癌是膽道系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，是第二大原發(fā)性肝臟腫瘤，占肝臟惡性腫瘤的5%～30%，僅次于肝細胞癌[6]。近年來的臨床流行病學調查結果顯示，膽管癌的發(fā)病率呈逐年增加的趨勢，其增長速度已經超過了肝細胞癌[7]。大量臨床研究表明：膽管癌惡性程度高，病死率高，姑息性治療患者的中位生存時間僅為6個月，手術治療能延長術后中位生存時間至2年，但5年生存率仍較低，約20%[8]。因此，深入了解膽管癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，探討新的可能治療的靶點和新的診斷指標十分必要。

BMP家族成員是一類在體內發(fā)生發(fā)展過程中起著重要生物學作用的蛋白家族[2]。近年的研究表明BMP蛋白的表達與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，但BMP家族在腫瘤中扮演的角色卻是多重的。BMP多數(shù)情況下可以抑制腫瘤的發(fā)生，但在少數(shù)的癌癥中其發(fā)揮促進癌癥形成的作用，盡管同一基因在不同的腫瘤的發(fā)生發(fā)展中亦可能發(fā)揮截然相反的作用。已有的研究證實BMP2可以通過抑制Smad通路從而抑制胃癌的生長[3]，但也有研究表明BMP2可以促進肺癌細胞在小鼠體內的生長和乳腺癌細胞骨轉移[9-10]。另外，BMP通路在結直腸癌中處于失活的狀態(tài)，卻在癌前腺瘤中保持活躍[11]。雖然已有大量的研究探討了 BMP 家族成員在腫瘤形成中的作用，如 BMP2、BMP4和BMP7等[3-4]，但是BMP3在癌癥中作用的研究仍然很少。

表1 BMP3蛋白表達與肝門部膽管癌臨床病理指標的關系

Table 1.The relationship between the expression of BMP3 and clinicopathological factors in the patients with hilar cholangiocarcinoma

IndexnBMP3expressionNegative(n=87)Weakpositive(n=16)PAge(years)10354.33±11.9757.50±12.24>0.05Gender>0.05 Male635211 Female40355Sizeoftumor(cm)1032.41±0.732.45±0.84>0.05Bismuth-Corlettestage>0.05 Ⅰ+Ⅱ35287 Ⅲ+Ⅳ68599MSKCCstage>0.05 T1655114 T225241 T313121TNMstage<0.05 Ⅰ+Ⅱ655114 Ⅲ+Ⅳ38362Lymphaticmetastasis<0.05 Negative675314 Positive36342Differentiation<0.01 Well311813 Moderate-poor72693CA199(×103U/L)>0.05 <3534277 ≥3569609CA125(×103U/L)>0.05 <35594712 ≥3544404CEA(μg/L)>0.05 <561529 ≥542357

Thet-test was used for the measurement data; the Chi-square test or analysis of Fisher exact propability was conducted for the count data.

BMP3基因位于人類4號染色體長臂上(4q21.21)，其編碼的BMP3具有472個氨基酸，是分泌型糖蛋白。近期的研究表明BMP3基因在結直腸癌和胃癌的發(fā)生發(fā)展中很有可能起著抑癌基因的作用[12-13]。BMP3基因在結直腸癌和胃癌中發(fā)生較高頻率的甲基化，而在正常的組織中則較低[13-14]，甲基化導致了BMP3基因在結腸癌和胃癌中沉默，但BMP3基因在肝門部膽管癌組織中的作用機制研究仍未見報道。本研究結果顯示BMP3蛋白在肝門部膽管癌組織中表達降低，在癌旁組織中表達較高，且BMP3的mRNA水平與蛋白的表達水平一致，這提示BMP3在肝門部膽管癌組織轉錄前后表達量均有所下降，這表明BMP3基因在肝門部膽管癌組織中處于抑制狀態(tài)。進一步分析BMP3蛋白的表達與臨床病理的關系，我們發(fā)現(xiàn)BMP3蛋白的表達與腫瘤TNM分期、淋巴結轉移、腫瘤的分化程度密切相關。TNM分期中Ⅲ期和Ⅳ期患者的BMP3蛋白的表達水平明顯低于Ⅰ期和Ⅱ期的患者，且在淋巴結轉移的患者中BMP3蛋白的表達明顯低于無淋巴結轉移者，腫瘤的分化程度越低，BMP3蛋白的表達量越低。這些均提示，BMP3基因表達的下調與肝門部膽管癌的發(fā)生發(fā)展密切相關，BMP3基因的下調與膽管癌的侵襲、轉移、腫瘤的惡性程度密切相關。但肝門部膽管癌中BMP3基因表達的下調是否與基因發(fā)生甲基化相關仍需要進一步的驗證。

本研究首次揭示了BMP3基因表達與肝門部膽管癌臨床病理的關系。本研究表明隨著腫瘤分期的加重和惡性程度的增加，BMP3蛋白的表達降低。這不僅說明BMP3基因在肝門部膽管癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，更提示BMP3基因有可能成為一個新的診斷和潛在的治療靶點，進一步研究BMP3基因的作用機制將有利于肝門部膽管癌的靶向治療。

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Expression and clinical significance of bone morphogenetic protein 3 in hilar cholangiocarcinoma tissues

LI Xun, TANG Di, ZHOU Qi, WANG Huan-yu, CHEN Jian-cong, ZHU Xiao-xu, YIN Xiao-yu, LIANG Li-jian

(DepartmentofHepatobiliarySurgery,TheFirstAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:tangdi@126.com)

AIM: To investigate the expression and clinical significance of bone morphogenetic protein 3 (BMP3) in hilar cholangiocarcinoma tissues. METHODS: Thirty cases of hilar cholangiocarcinoma specimens were collected. The expression of BMP3 at mRNA and protein levels in the tumor tissues and paracancerous tissues was detected by real-time PCR and Western blot. The hilar cholangiocarcinoma paraffin-embedded specimens (n=103) were collected. The protein expression of BMP3 was determined by immunohistochemical method, and the relationship of BMP3 protein expression with clinical pathological characteristics was evaluated. RESULTS: In the 30 patients with hilar cholangiocarcinoma, the expressions of BMP3 protein and mRNA in 22 cases of tumor tissues were significantly decreased compared with the adjacent normal tissues. The results of immunohistochemistry showed that 87 cases were negative and 16 cases were weakly positive in all 103 cases of hilar cholangiocarcinoma. The expression of BMP3 protein was associated with the tumor TNM staging, lymph node metastasis and tumor differentiation (P<0.05). CONCLUSION:BMP3 gene might be inhibited in human hilar cholangiocarcinoma. The down-regulation ofBMP3 gene might be associated with the carcinogenesis and development of hilar cholangiocarcinoma.

Hilar cholangiocarcinoma; Bone morphogenetic protein 3

1000- 4718(2015)04- 0615- 05

2014- 11- 24

2015- 01- 23

廣東省科技計劃(No.2012B061700105);廣州市科技計劃(No.201300000187)

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.04.007

△通訊作者 Tel: 020-87755766； E-mail：tangdi@126.com