劉寶龍， 吳斌文， 黃素軍， 李東風(fēng)

(1南方醫(yī)科大學(xué)，廣東 廣州 510515； 2廣東省人民醫(yī)院，廣東省老年醫(yī)學(xué)研究所，廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東 廣州 510080； 3廣州市紅十字會(huì)醫(yī)院，廣東 廣州 510220)

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miR-375對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116活性、細(xì)胞周期及凋亡的影響*

劉寶龍1,2， 吳斌文2△， 黃素軍3， 李東風(fēng)2

(1南方醫(yī)科大學(xué)，廣東 廣州 510515；2廣東省人民醫(yī)院，廣東省老年醫(yī)學(xué)研究所，廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東 廣州 510080；3廣州市紅十字會(huì)醫(yī)院，廣東 廣州 510220)

目的： 探討微小RNA-375(microRNA-375，miR-375)對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116活性、細(xì)胞周期及凋亡的影響。方法: Real-time PCR檢測(cè)不同結(jié)直腸癌細(xì)胞中miR-375的表達(dá)情況。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將miR-375模擬物(mimics)轉(zhuǎn)入HCT116細(xì)胞，用real-time PCR法檢測(cè)miR-375及AEG-1 mRNA的表達(dá)情況；MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性的改變情況；流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)miR-375對(duì)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響。結(jié)果: Real-time PCR結(jié)果顯示HCT116在4個(gè)結(jié)直腸癌細(xì)胞株中miR-375的表達(dá)量最低；miR-375 mimics組中miR-375表達(dá)量較對(duì)照組明顯上調(diào)；miR-375高表達(dá)可以顯著抑制AEG-1 mRNA的表達(dá)水平。miR-375 mimics組細(xì)胞活性明顯受到抑制，同時(shí)細(xì)胞凋亡率明顯增加，G1期所占細(xì)胞數(shù)增加，而S期所占細(xì)胞數(shù)減少。結(jié)論: miR-375可以抑制結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞的活性，介導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯并促進(jìn)其凋亡。miR-375作為一種抑癌因子，在結(jié)腸癌中可能通過抑制AEG-1發(fā)揮抑癌作用。

結(jié)直腸癌； 微小RNA-375； 細(xì)胞活性； 細(xì)胞周期; 細(xì)胞凋亡

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是最常見的消化道惡性腫瘤之一，在世界多數(shù)國(guó)家的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，據(jù)統(tǒng)計(jì)，美國(guó)每年有近14萬(wàn)新診斷CRC病例[1]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長(zhǎng)20～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性單鏈非編碼小RNA。miR-375是miRNA家族中的一員，目前已證實(shí)與多種惡性腫瘤相關(guān)，可通過調(diào)節(jié)多種靶基因的表達(dá)，發(fā)揮抑癌或促癌作用。研究發(fā)現(xiàn)，miR-375可通過靶向調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞升高基因1(astrocyte elevated gene-1，AEG-1)/異黏蛋白(metadherin，MTDH)基因的表達(dá)，從而參與肝癌和頭頸部鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展過程[2-3]，但miR-375與AEG-1的關(guān)系尚未在結(jié)直腸癌中得到證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)通過研究miR-375對(duì)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，旨在為結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 主要材料

人結(jié)腸癌細(xì)胞株Caco-2、HCT-116、SW-480和SW-620均購(gòu)自CTCC；DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清均購(gòu)自Gibco；0.25%胰蛋白酶購(gòu)自杭州吉諾生物有限公司；miR-375 mimics和negative control轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司；LipofectamineTM2000及TRIzol試劑均購(gòu)自Invitrogen；噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自廣州威佳公司；二甲基亞砜購(gòu)自Sigma；細(xì)胞周期及凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自Fermentas；SYBR Premix Ex TaqⅡ(Tli RNaseH Plus)為TaKaRa產(chǎn)品。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) Caco-2和HCT-116細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，SW-480和SW-620細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況每1～2 d換液1次，當(dāng)細(xì)胞覆蓋瓶底壁大部分表面時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞傳代或收集細(xì)胞。

2.2 Real-time PCR檢測(cè)不同結(jié)腸癌細(xì)胞中miR-375的表達(dá)情況 收集細(xì)胞，按照TRIzol試劑說明書抽提結(jié)直腸癌細(xì)胞株Caco-2、HCT-116、SW-620和SW-480中的總RNA，-80 ℃凍存?zhèn)溆?。采用real-time PCR檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞中miR-375的表達(dá)，以U6作為內(nèi)參照，引物均購(gòu)自廣州銳博公司。結(jié)果采用2-ΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，ΔCt=目的基因平均Ct值-內(nèi)參照基因平均Ct值。

2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1 d，將適量(約4×104～5×104)生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定的HCT-116細(xì)胞接種在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，每孔加入不含抗生素的細(xì)胞培養(yǎng)液400 μL。密切觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到 30%～50%時(shí)，開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)組(miR-375 mimics)和對(duì)照組(negative control，NC)的轉(zhuǎn)染。用50 μL不含血清的培養(yǎng)基Opti-MEM對(duì)5 μL濃度為20 μmol/L的miR-375 mimics和negative control進(jìn)行稀釋，輕輕振蕩混勻，室溫下溫育5 min。用50 μL的不含血清培養(yǎng)基Opti-MEM對(duì)1.5 μL LipofectamineTM2000進(jìn)行稀釋，輕輕振蕩混勻，室溫下溫育5 min。將稀釋好的miR-375 mimics和negative control與LipofectamineTM2000混合，輕柔混勻，室溫下溫育20 min，以形成混合物。100 μL混合物加到培養(yǎng)板的孔中，輕輕搖晃細(xì)胞培養(yǎng)板使其與培養(yǎng)液混勻。將細(xì)胞培養(yǎng)板置于5% CO2的培養(yǎng)箱中，在37 ℃下培養(yǎng)6 h后，移除每孔中含有混合物的培養(yǎng)液，更換新的培養(yǎng)液。繼續(xù)在37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行轉(zhuǎn)染后的其它實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

2.4 Real-time PCR檢測(cè)各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中miR-375和AEG-1 mRNA的表達(dá)情況 轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，按照TRIzol說明書抽提細(xì)胞中的總RNA，-80 ℃凍存?zhèn)溆?。采用real-time PCR檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞中miR-375的表達(dá)，以U6作為內(nèi)參照，引物購(gòu)自廣州銳博公司。real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞中AEG-1 mRNA的表達(dá)情況，以GAPDH作為內(nèi)參照，引物購(gòu)自TaKaRa。AEG-1的上游引物序列為5’-TCGATGATGAATGGTCTGGGTTA-3’，下游引物為5’-AGGAATTGGTTCCTGGGACTTTAG-3’； GAPDH的上游引物序列為 5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，下游引物為5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’。結(jié)果采用2-ΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，ΔCt=目的基因平均Ct值-內(nèi)參照基因平均Ct值。

2.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況 將轉(zhuǎn)染后的實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組細(xì)胞分別接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔接種細(xì)胞3 000個(gè)(每孔加培養(yǎng)液100 μL)，置于37 ℃、5% CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)4 h、24 h、48 h和72 h后加入MTT工作液，每孔加入0.5% MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，輕輕吸出孔內(nèi)液體，然后在每孔中加入二甲基亞砜150 μL，應(yīng)用全自動(dòng)酶標(biāo)儀，檢測(cè)波長(zhǎng)490 nm下的吸光度(A)值。以時(shí)間作為橫坐標(biāo)，計(jì)算所得A值的均數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 轉(zhuǎn)染48 h后消化收集細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，然后1 200 r/min離心5 min，棄上清。預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2次，PI細(xì)胞染色，即加入1 000 μL staining buffer(A)及10 μL reagent B染色，混勻后室溫避光孵育30 min，立即上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 轉(zhuǎn)染48 h后消化收集細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，然后1 200 r/min離心5 min，棄上清。預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2次，用500 μL 1×binding buffer重懸細(xì)胞，加入5 μL FITC標(biāo)記的Annexin V，加入10 μL的PI?；靹蚝笫覝乇芄夥跤? min，立即上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，符合正態(tài)分布且方差齊者采用t檢驗(yàn)或者單因素方差分析檢驗(yàn)，方差不齊采用Dunnett T3校正，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 miR-375在結(jié)腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況

4種人結(jié)直腸癌細(xì)胞系Caco-2、HCT-116、SW-620和SW-480中miR-375相對(duì)表達(dá)量分別為0.002 024±0.000 104、0.000 687±0.000 111、0.007 543±0.002 696和0.004 935±0.000 619。其中以HCT116細(xì)胞中miR-375的表達(dá)水平最低，因此選取HCT116細(xì)胞系作為我們進(jìn)一步研究的對(duì)象。

2 miR-375 mimics對(duì)HCT 116細(xì)胞中miR-375和AEG-1 mRNA表達(dá)的影響

miR-375 mimics瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞48 h后，采用real-time PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后實(shí)驗(yàn)組及陰性對(duì)照組HCT116細(xì)胞中miR-375和AEG-1 mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-375 mimic后miR-375的表達(dá)水平明顯上調(diào)，其表達(dá)水平約是陰性對(duì)照組2 000倍(P<0.01)，同時(shí)miR-375的高表達(dá)導(dǎo)致AEG-1 mRNA表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。以上結(jié)果提示，miR-375 mimics可上調(diào)miR-375的表達(dá)，同時(shí)過表達(dá)miR-375可抑制AEG-1 mRNA的表達(dá)，見圖1。

Figure 1.The expression levels of miR-375 and AEG-1 mRNA in human colon cancer HCT116 cells after transfection detected by real-time PCR. U6 or GAPDH served as an internal standard. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsnegative control.

圖1 miR-375 mimics對(duì)HCT 116細(xì)胞中miR-375和AEG-1 mRNA表達(dá)的影響

3 miR-375過表達(dá)對(duì)HCT116細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-375 mimics組細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h、48 h和72 h時(shí)的A值均低于陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。miR-375過表達(dá)對(duì)HCT116細(xì)胞的活力具有明顯抑制作用，見圖2。

4 miR-375過表達(dá)對(duì)HCT116細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染48 h后各組細(xì)胞的周期分布，結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組與miR-375 mimics組比較，miR-375 mimics組G1期細(xì)胞所占比例明顯增多(P<0.01)，S期細(xì)胞所占比例明顯減少(P<0.05)，見圖3、表1。

5 miR-375過表達(dá)對(duì)HCT116細(xì)胞凋亡率的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染48 h后各組細(xì)胞的凋亡率，結(jié)果顯示，miR-375 mimics組和陰性對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率分別為(8.47±1.55)%和(6.25±1.20)%，陰性對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率明顯低于miR-375 mimics組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

Figure 2.The effect of miR-375 over-expression on the viability of HCT116 cells detected by MTT assay. Mean±SD.n=4.**P<0.01vsnegative control.

圖2 MTT法檢測(cè)miR-375過表達(dá)對(duì)HCT116細(xì)胞活力的影響

Figure 3.The cell cycle distribution of HCT116 cells 48 h after transfection detected by flow cytometry.

圖3 miR-375過表達(dá)對(duì)HCT116細(xì)胞周期分布的影響

表1 miR-375過表達(dá)對(duì)HCT116細(xì)胞細(xì)胞周期分布的影響

*P<0.05,**P<0.01vsnegative control.

Figure 4.The effect of miR-375 over-expression on the apoptosis of HCT116 cells detected by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnegative control.

圖4 miR-375過表達(dá)對(duì)HCT116細(xì)胞凋亡率的影響

討 論

miRNA是重要基因調(diào)節(jié)因子，它在細(xì)胞內(nèi)具有多種重要的調(diào)節(jié)作用，包括細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、凋亡和代謝等，并參與腫瘤的形成和發(fā)展等眾多病理過程。miRNA主要是通過與靶mRNA上的3’非翻譯區(qū)域(untranslated region，UTR)的特異序列結(jié)合，于轉(zhuǎn)錄后水平促進(jìn)靶mRNA的降解和(或)抑制翻譯過程而參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展的，每個(gè)miRNA可以有多個(gè)靶基因，調(diào)節(jié)多種蛋白水平，同樣，幾個(gè)miRNAs也可以調(diào)節(jié)同一個(gè)基因，在調(diào)控過程中，多條信號(hào)通路交叉形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)[4]。miRNA在腫瘤中的作用是多樣性的，同一種miRNA也可能同時(shí)扮演致癌因子和抑癌因子的角色，但從整體效應(yīng)來(lái)看，在腫瘤中高表達(dá)的miRNA多表現(xiàn)為致癌作用，而低表達(dá)的miRNA多表現(xiàn)為抑癌作用。

近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，miR-375在多種惡性腫瘤中均有異常表達(dá)，但其在不同腫瘤中的表達(dá)情況卻不盡相同，具有一定的腫瘤特異性。Simonini等[5]研究發(fā)現(xiàn)在雌激素受體α(estrogen receptor α，ERα)陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞株中miR-375高表達(dá)，并可通過負(fù)調(diào)控靶基因地塞米松誘導(dǎo)的Ras相關(guān)蛋白1(dexamethasone-induced Ras-related protein 1，RASD1)，參與了ERα陽(yáng)性乳腺癌的形成過程。Szczyrba等[6]研究發(fā)現(xiàn)miR-375在前列腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，通過檢測(cè)腫瘤組織miR-375的表達(dá)水平，有利于判斷前列腺癌的進(jìn)程和預(yù)后。然而，另外一些學(xué)者報(bào)道，miR-375在腫瘤中呈低表達(dá)，如在胃癌[7-8]、肝癌[2]、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌[3]、黑素細(xì)胞痣[9]、宮頸癌[10]、結(jié)直腸癌[11]等中。有多項(xiàng)研究表明miR-375作為抑癌因子可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。有學(xué)者研究表明胃癌細(xì)胞中，miR-375低表達(dá)，并通過靶向調(diào)節(jié)3-磷酸肌醇依懶性蛋白激酶1(3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1，PDK1)、抗凋亡基因14-3-3zeta以及Janus激酶2(Janus kinase 2，JAK2)的表達(dá)，抑制胃癌細(xì)胞的增殖，發(fā)揮抑癌基因的作用[7-8]。Mazar等[9]研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-375的表達(dá)水平，能明顯抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲。Wang等[10]在對(duì)宮頸鱗癌的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-375以轉(zhuǎn)錄因子特異蛋白1(specificity protein-1，SP1)為靶基因起抑癌基因的作用，參與了宮頸癌的發(fā)生過程。Dai等[11]利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-375在95對(duì)結(jié)直腸癌和癌旁正常組織中及3株人結(jié)直腸癌細(xì)胞株(HT29、HCT116和SW620)和人正常結(jié)腸黏膜組織中的表達(dá)，結(jié)果均提示miR-375表達(dá)量顯著降低。為了深入了解miR-375在結(jié)腸癌發(fā)病過程中的作用及其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，本研究使用化學(xué)合成的miR-375模擬物轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞，上調(diào)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞中miR-375的表達(dá)，通過MTT檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布和細(xì)胞凋亡情況來(lái)初步探討miR-375在結(jié)直腸癌發(fā)生中的作用。結(jié)果顯示結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞miR-375 mimics組與negative control組相比，各個(gè)時(shí)點(diǎn)細(xì)胞生長(zhǎng)活力均顯著降低，表明上調(diào)miR-375的表達(dá)能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的細(xì)胞活性。我們發(fā)現(xiàn)與negative control組相比，miR-375 mimics組中G1期細(xì)胞所占比例明顯增多，S期細(xì)胞所占比例明顯減少，提示miR-375 過表達(dá)能夠使更多的細(xì)胞阻滯在G0/G1期。同時(shí)，上調(diào)miR-375的表達(dá)能增加細(xì)胞的凋亡率，說明miR-375在促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的過程中起了重要作用。由此筆者推測(cè)，miR-375可能是通過抑制了某些癌基因的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)活性，介導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)為抑癌基因的功能。

AEG-1位于人染色體8q22，是重要的促癌基因，目前已被證實(shí)在包括宮頸癌[12]、結(jié)直腸癌[13]、神經(jīng)母細(xì)胞瘤[14]等在內(nèi)的多種惡性腫瘤中高表達(dá)，通過影響細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲及血管生成等過程，參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。秦瑞英等[12]研究發(fā)現(xiàn)AEG-1在宮頸癌中高表達(dá)可能與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其表達(dá)下調(diào)介導(dǎo)的細(xì)胞周期靜止和侵襲能力降低可能與細(xì)胞周期相關(guān)蛋白細(xì)胞周期素D1(cyclin D1)、細(xì)胞周期素依賴性激酶2(cyclin-dependent kinase 2，CDK2)及基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)蛋白表達(dá)下調(diào)密切相關(guān)。Huang等[15]研究發(fā)現(xiàn)AEG-1在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，抑制AEG-1的表達(dá)可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、克隆形成和侵襲能力，誘導(dǎo)凋亡，并可增加腫瘤細(xì)胞對(duì)5-Fu的敏感性。我們?cè)谶M(jìn)一步的研究中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-375 mimics后，miR-375的表達(dá)明顯增加，同時(shí)發(fā)現(xiàn)miR-375的高表達(dá)顯著抑制了AEG-1的轉(zhuǎn)錄。我們推測(cè)miR-375可能通過調(diào)控癌基因AEG-1的表達(dá)而發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)活性、介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，這與其在肝癌、頭頸部腫瘤等的研究結(jié)論一致。

總之，miR-375可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的細(xì)胞活性，介導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯并誘導(dǎo)其凋亡，提示miR-375在結(jié)直腸癌的發(fā)生中發(fā)揮重要作用，同時(shí)證實(shí)了miR-375與AEG-1的關(guān)系，進(jìn)一步探討二者的相互關(guān)系，可為闡明miR-375的抑癌機(jī)制提供一條新的思路。

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源于人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞并表達(dá)腦啡肽酶2的巨噬細(xì)胞可降解β淀粉樣蛋白

近日，日本科學(xué)家發(fā)現(xiàn)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)衍生的巨噬細(xì)胞在阿爾茨海默病(AD)的治療中具有應(yīng)用前景。在前期研究中，他們建立了從人iPS細(xì)胞生成具有增殖活性的巨噬細(xì)胞樣髓系細(xì)胞(iPS-ML)的技術(shù)，并發(fā)現(xiàn)iPS-ML能降低加入到培養(yǎng)基中的Aβ水平，且iPS-ML的培養(yǎng)上清液能減輕Aβ的神經(jīng)毒性。在該研究中，他們又構(gòu)建了表達(dá)Aβ特異性單鏈抗體Fc受體融合形式(anti-Aβ scFv)的iPS-ML；此外，還讓iPS-ML表達(dá)腦啡肽酶2(NEP2；一種能夠降解Aβ的蛋白酶)。在體外，NEP2而非anti-Aβ scFv的表達(dá)可以增強(qiáng)iPS-ML降解培養(yǎng)基中可溶性Aβ寡聚體并減輕Aβ神經(jīng)毒性的能力。將表達(dá)NEP2的iPS-ML(iPS-ML/NEP2)注入5XFAD小鼠(AD小鼠模型)腦內(nèi)，可見有iPS-ML/NEP2注入的腦組織液中Aβ的水平顯著降低。這些結(jié)果表明，iPS-ML/NEP2可能成為治療AD的一種有效藥物。

Stem Cell Res, 2014, 13(3 Pt A): 442-453(黃翠芹)

Effect of miR-375 on viability, cell cycle and apoptosis of colon cancer HCT116 cells

LIU Bao-long1, 2, WU Bin-wen2, HUANG Su-jun3, LI Dong-feng2

(1SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China;2GuangdongGeneralHospital,GuangdongProvincialInstituteofGeriatrics,GuangdongAcademyofMedicalSciences,Guangzhou510080,China;3GuangzhouRedCrossHospital,Guangzhou510220,China.E-mail:wubinwengd@aliyun.com)

AIM: To investigate the effect of microRNA-375 (miR-375) on the viability, cell cycle and apoptosis of HCT116 cells. METHODS: The expression of miR-375 in different colorectal cancer cell lines was detected by real-time PCR. The miR-375 mimics was transfected into HCT116 cells by LipofectamineTM2000. The mRNA expression of miR-375 and AEG-1 was detected by real-time PCR. The HCT116 cell viability was detected by MTT assay. The changes of apoptosis and cell cycle distribution were analyzed by flow cytometry. RESULTS: Real-time PCR showed that miR-375 expression was the lowest in HCT116 among 4 colorectal cancer cell lines. The expression level of miR-375 significantly increased in miR-375 mimics group compared with that in the negative control group. The high expression level of miR-375 significantly inhibited the mRNA expression of AEG-1. After transfection with miR-375 mimics, the cell viability was inhibited, the apoptotic rate was increased, the proportion of G1-stage cells was increased, and the proportion of S-stage cells was decreased. CONCLUSION: miR-375 inhibits the viability, mediates the cell cycle arrest and promotes the apoptosis of colon cancer HCT116 cells. miR-375 may act as a tumor suppressor in colorectal cancer by inhibiting AEG-1.

Colorectal cancer; MicroRNA-375; Cell viability; Cell cycle; Apoptosis

1000- 4718(2015)04- 0609- 06

2014- 11- 30

2015- 02- 10

廣東省科技計(jì)劃(No. 2011B031800001)

R735.3; R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.04.006

△通訊作者 Tel: 020-83827812; E-mail: wubinwengd@aliyun.com