曹劼

（福建省　將樂縣　林業(yè)局　353300）

蘭科植物離體培養(yǎng)的研究進(jìn)展

曹劼

（福建省將樂縣林業(yè)局353300）

本文綜述了近幾年來蘭科植物離體培養(yǎng)的研究現(xiàn)狀，分析了目前存在的問題，并對蘭科植物離體培養(yǎng)的前景進(jìn)行展望。

蘭科植物；離體培養(yǎng)；展望

1　蘭科植物離體培養(yǎng)的研究現(xiàn)狀

以下從蘭科植物離體培養(yǎng)的外植體選取、培養(yǎng)基、植物激素、有機(jī)添加劑以及環(huán)境條件如溫度、濕度、光照、酸堿度等方面進(jìn)行綜述：

1.1外植體選取

1.1.1莖尖

莖尖是植物細(xì)胞分裂最活躍的部位，也是較容易誘導(dǎo)和培育成功率較高的部位，是最早用于蘭科植物快速繁殖的外植體。春蘭、建蘭、墨蘭等均可用莖尖誘導(dǎo)出大量的類原球莖，然后類原球莖發(fā)育成根狀莖后進(jìn)一步成長為幼苗。研究表明，莖尖作為外植體更適合文心蘭、大花蕙蘭等復(fù)軸生長類型的蘭花。李曉青等采用莖尖誘導(dǎo)原球莖的方法對大花蕙蘭“瀑布”進(jìn)行了初代離體培養(yǎng)，成功地誘導(dǎo)出原球莖并增殖分化出幼苗。

1.1.2種子

蘭科植物的種子細(xì)小如粉，數(shù)量極多，其微小的種子本身不含胚乳和子葉，只有發(fā)育不完全的胚，儲存在胚中的營養(yǎng)成分無法提供種子萌發(fā)所需要的有機(jī)養(yǎng)分，因而在自然條件下，種子萌發(fā)率很低。Link早在1824年就觀察到自然條件下蘭花種子萌發(fā)伴隨著真菌感染的現(xiàn)象。1899年Bemard首次分離出蘭花的根菌，并用其感染蘭花的種子進(jìn)行萌發(fā)試驗，從而創(chuàng)立了共生萌發(fā)法。研究表明，大部分蘭花種子都可以實現(xiàn)非共生萌發(fā)，即不需要任何真菌浸染就完成在人工培養(yǎng)基上萌發(fā)。隨后，研究者用非共生萌發(fā)也對石斛蘭、文心蘭、蝴蝶蘭等的種子進(jìn)行萌發(fā)研究，取得了成功。之后，非共生萌發(fā)逐步代替了共生萌發(fā)，成為蘭科植物組織培養(yǎng)的熱點，蘭科植物種子用于組織培養(yǎng)極富有前景。

1.1.3花梗

花梗在單莖性蘭花組織培養(yǎng)中應(yīng)用較多。以花梗作為蘭花的外植體的最大優(yōu)點在于獲取原材料容易，消毒滅菌容易，也能保護(hù)母株免受更多的傷害，且能獲得與母株優(yōu)良性狀一致的再生苗，但其也有不足之久，就是取材受到開花季節(jié)的限制。近幾年來，關(guān)于利用蝴蝶蘭花梗來誘導(dǎo)芽苗或類原球莖的增殖方式的研究較多。魯雪華等的研究發(fā)現(xiàn)用蝴蝶蘭花梗節(jié)間切段誘導(dǎo)頻率比莖尖、根尖要高得多；李軍等對蝴蝶蘭組織培養(yǎng)的工廠化生產(chǎn)技術(shù)研究也是利用蝴蝶蘭的花梗作為外植體的。卜朝陽等以蝴蝶蘭花梗為外植體，誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)并成功獲得無菌苗。

1.1.4葉片

葉片是較為理想的外植體材料，既可以減少對母株的傷害，取材又不受到花季限制。其中試管苗的幼葉作為外植體進(jìn)行培養(yǎng)效果最好。Kuo等利用蝴蝶蘭試管苗研究了離體葉片誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生的過程，并通過類原球莖再生成苗。以試管苗幼葉為外植體經(jīng)體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑再生成苗試驗的成功，不僅為蘭科植物優(yōu)良種苗的快速繁殖提供了有效途徑，也為蘭科植物轉(zhuǎn)基因研究提供了很好的技術(shù)平臺。

1.2培養(yǎng)基

植物培養(yǎng)基作為植物離體培養(yǎng)的核心技術(shù)，主要包括碳源、維生素、無機(jī)鹽、生長調(diào)節(jié)劑、有機(jī)添加物構(gòu)成，它供給和保障植物組織離體狀態(tài)下良好生長的必要營養(yǎng)。在蘭科植物離體培養(yǎng)中，最常用是MS、KC、VW、N6、White和他們的改良型。不同植物材料生長分化所需的營養(yǎng)條件各不相同，甚至同一植物不同部位的生長分化要求也各不同，因此在選用基本培養(yǎng)基時可根據(jù)不同品種和培養(yǎng)階段加以修改。羅吉鳳等比較了MS、1/2MS、1/ 2N6、White等培養(yǎng)基對鐵皮石斛種子萌發(fā)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，30d種子發(fā)芽率均達(dá)到95％，但是原球莖的直徑存在差異，1/2MS培養(yǎng)基上所萌發(fā)的原球莖最大，說明1/2MS更利于種子萌發(fā)。江建銘等以金線蓮的莖節(jié)段作為外植體，選用了MS、1/2MS、VW、B5和KC等5種培養(yǎng)基進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，經(jīng)60d的培養(yǎng)，MS、B5培養(yǎng)基中不定芽增殖率明顯高于其它三種，結(jié)果表明MS、B5培養(yǎng)基更適合金線蓮莖段不定芽誘導(dǎo)的基本培養(yǎng)基。

1.3植物激素

植物激素是影響植物離體形態(tài)發(fā)生的關(guān)鍵因素，控制著細(xì)胞生長、分化、發(fā)育等生理變化和形態(tài)形成，對誘導(dǎo)蘭花原球莖、新植株體形成和蘭花品種種子發(fā)芽至關(guān)重要。目前常使用的植物激素主要是IAA、NAA和2，4-D等生長素類和KT、ZT和BA等細(xì)胞分裂素類，適當(dāng)濃度的生長素和細(xì)胞分裂素對愈傷組織的形成和芽的分化有促進(jìn)作用。對不同的蘭科植物來說，在不同的生長發(fā)育階段所需激素的量及種類都不盡相同。在金線蓮壯苗培養(yǎng)中，NAA對促進(jìn)幼苗生長的影響比6-BA更為明顯。鄭亞琴[31]研究了植物激素對大花蕙蘭繁殖系數(shù)的影響，發(fā)現(xiàn)繁殖系數(shù)不僅取決于激素的濃度，還取決于激素之間的比例，當(dāng)NAA0.2mg/L、BA0.8-1.2mg/L時，大花蕙蘭繁殖系數(shù)較高。

1.4有機(jī)添加物

有機(jī)添加物由于含有許多復(fù)雜、有效的成分而廣泛應(yīng)用于蘭科植物的離體培養(yǎng)。離體培養(yǎng)中常用的有機(jī)添加物有椰子汁、香蕉、土豆和馬鈴薯等。李蕤等在研究香蕉泥、蘋果汁、椰子汁3種添加物對霍山石斛幼芽生長影響的實驗中發(fā)現(xiàn)，這3種添加物都能促進(jìn)幼芽的生長，其中香蕉泥的效果最為明顯。實驗進(jìn)一步研究了香蕉泥的添加量對幼芽生長的影響，結(jié)果表明香蕉泥對幼芽的誘導(dǎo)表現(xiàn)出添加量的臨界點，超過臨界量后不利于霍山石斛幼芽的生長。何松林等比較了蛋白胨、胰蛋白胨、蘋果汁、番茄汁、椰子汁對文心蘭原球莖增殖的影響，結(jié)果表明蛋白胨對文心蘭原球莖的增殖效果最為顯著，而胰蛋白胨、蘋果汁和椰子汁對文心蘭的幼苗分化影響較大。

1.5環(huán)境條件

光照強度對外植體的生長有一定的影響。蘭花在接種初期根據(jù)不同種類大多維持黑暗或200～600lx的弱光，到類原球莖階段后給予1000～2000lx的強度，長根壯苗階段以2000～3000lx為好。大花蕙蘭、金線蓮等關(guān)于光照的研究都證明了這一點。Gow等的研究發(fā)現(xiàn)，光照時間越長，外植體褐變率越大，體細(xì)胞胚胎的發(fā)生率越低。培養(yǎng)基的pH值直接影響到培養(yǎng)物對離子的吸收，過酸或過堿都對植物材料生長有影響。蘭花所用的培養(yǎng)基一般呈弱酸性，pH值在5.0～6.0，不同的種類對pH值的要求不同。蝴蝶蘭原球莖在pH值5.0～5.4的環(huán)境中生長最好，叢生芽的誘導(dǎo)和增殖在pH值為5.6～5.8時較好。在pH值5.2～5.8范圍內(nèi)，霍山石斛有較高的出芽率，尤其是pH值為5.8時。

2　蘭科植物離體培養(yǎng)過程中存在的問題

2.1污染的發(fā)生

污染主要有細(xì)菌性污染和真菌性污染兩類，細(xì)菌性污染的表征為菌斑呈粘液狀物，在接種1～2d即可發(fā)現(xiàn)，造成的原因一般由于材料帶菌、培養(yǎng)基滅菌不徹底、操作人員的不當(dāng)?shù)?。真菌性污染是指培養(yǎng)基表面貨材料表面出現(xiàn)菌絲，繼而很快形成不同顏色的霉菌，接種3～10d后才發(fā)現(xiàn)，多為周圍環(huán)境的不清潔、培養(yǎng)用具的口徑過大、超凈工作臺的過濾裝置失效等造成。在蘭科植物離體培養(yǎng)過程中，控制污染是關(guān)鍵，尤其在高溫高濕的夏季污染相當(dāng)高，可能會影響當(dāng)季的生產(chǎn)計劃，甚至造成品種的丟失。因此在離體培養(yǎng)過程中，盡量將有菌的物體經(jīng)處理轉(zhuǎn)化為無菌的物體，這是離體培養(yǎng)的關(guān)鍵所在。可以從外植體處理、培養(yǎng)基的滅菌、接種操作、接種室及培養(yǎng)室消毒等方面進(jìn)行污染的控制。

2.2玻璃化現(xiàn)象

玻璃化是植物離體培養(yǎng)過程中的一種生理失調(diào)或生理病變，導(dǎo)致玻璃化苗的產(chǎn)生。在蘭科植物離體培養(yǎng)中，玻璃化現(xiàn)象表現(xiàn)為原球莖透明，含水量高、分化能力降低，試管苗出現(xiàn)莖節(jié)多、根多、葉片厚而脆、組織畸形、生長緩慢、移栽成活率低等問題。朱晉云等對大花蕙蘭離體培養(yǎng)兩年多的研究工作證實了這一點。鄧小果等在文心蘭的組織培養(yǎng)過程中也發(fā)現(xiàn)了玻璃化現(xiàn)象。植物試管苗玻璃化是組培過程中的三大難題之一，給科研和生產(chǎn)造成極大損失。因此，在實際生產(chǎn)過程中必需采取降低蘭科植物試管苗的玻璃化現(xiàn)象，直至消除玻璃化現(xiàn)象。

2.3褐化現(xiàn)象

克服外植體褐化的措施主要從這幾個方面入手。但是對于不同的蘭科植物材料，降低和防止褐化現(xiàn)象的具體方法有所不同。在對秦嶺野生春蘭組織培養(yǎng)過程中的褐化控制研究中發(fā)現(xiàn)，以1/2MS為基本培養(yǎng)基，加入活性炭1g/L，PVP5g/L，pH5.4，在外植體接種初期暗培養(yǎng)10d對減輕外植體褐化最為有效。為減少石斛蘭的褐化現(xiàn)象，陳亞鴻等采取了提高培養(yǎng)基的pH值，添加活性炭以及胰蛋白胨等措施，取得了不錯的成果。尤海波等對解決蝴蝶蘭外植體褐化問題的研究表明，采用帶腋芽的、抽4節(jié)的花梗為外植體，用表面活性劑（Tweens20）20×10-6處理10min、70％酒精浸泡30s、0.5％的次氯酸鈉溶液浸泡5min的方法消毒外植體減輕褐化的效果最佳；培養(yǎng)基中添加10mg/LAA和1000mg/L PVP抗褐化效果較好，在誘導(dǎo)階段采用低濃度蔗糖誘導(dǎo)可減少褐化現(xiàn)象的發(fā)生。

2.4遺傳變異

植物離體培養(yǎng)的重要目的在于保存種質(zhì)資源，避免基因的丟失和毀滅，快速繁殖具有價值的花卉苗木。大多數(shù)蘭科植物是珍稀瀕危植物，具有很高的觀賞價值、藥用價值和科研價值，如果培養(yǎng)過程中遺傳變異率太高，不僅不能為保存資源和培育優(yōu)良的品種提供基礎(chǔ)保障，還會嚴(yán)重影響到工廠化生產(chǎn)。蘭科植物的遺傳變異是一個非常復(fù)雜的問題，引起遺傳變異的因素相當(dāng)多，主要是植株體的基因型、培養(yǎng)環(huán)境以及繼代次數(shù)。因此，在蘭科植物離體培養(yǎng)過程中，應(yīng)盡量選擇遺傳穩(wěn)定性好的基因型；協(xié)調(diào)好培養(yǎng)基中的營養(yǎng)元素；選用適合的激素種類和濃度，減少或不使用易引起誘變的物質(zhì)；控制好培養(yǎng)溫度、濕度和光照；減少繼代次數(shù)以降低遺傳變異現(xiàn)象的發(fā)生率。

2.5成本高

蘭科植物離體培養(yǎng)過程，不僅繼代增殖次數(shù)多，而且周期長，消耗了大量的人力、物力和原材料，生產(chǎn)成本相對較高。成本直接影響商品的競爭力，所以只有降低成本，離體培養(yǎng)才有生命力。因此，在離體培養(yǎng)過程中應(yīng)在保證苗的質(zhì)量的情況下盡量降低成本。在培養(yǎng)基方面，可用低成本物質(zhì)代替一些高成本的物質(zhì)，比如用白砂糖代替蔗糖等。同時，減少培養(yǎng)過程中的損失，如玻璃化現(xiàn)象、污染、褐化現(xiàn)象等，都可以有效降低成本。另外多查閱相關(guān)文獻(xiàn)，參考前人的經(jīng)驗，可以少走彎路，減少資源的浪費。

3　展望

目前，蘭科植物的離體培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)取得較大進(jìn)展，但仍有很多技術(shù)急需改進(jìn)和發(fā)展。如試管苗移栽后生長緩慢和開花遲的瓶頸研究，可采用人工改造生長環(huán)境的方法研究光照強度、溫濕度、栽培基質(zhì)等長生因子對國蘭生長發(fā)育的影響；可以提取藥用成分為研究目的，通過優(yōu)化培養(yǎng)基成分和生長條件，以提高次生代謝物的含量，尋找最優(yōu)的培養(yǎng)條件，由離體培養(yǎng)組織到直接生產(chǎn)藥用活性成分；可借助于其它栽培繁育手段結(jié)合離體培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行多方位育種，研究如何提高離體培養(yǎng)苗的移栽成活率；同時也可將離體培養(yǎng)技術(shù)與物理誘導(dǎo)、化學(xué)誘導(dǎo)、基因轉(zhuǎn)化等技術(shù)結(jié)合相融合，為培育符合大眾審美觀的蘭花新品種奠定理論和技術(shù)基礎(chǔ)。特別是野生珍稀蘭科植物要重點保護(hù)，禁止濫采，這樣才能保證蘭科植物種質(zhì)資源的可持續(xù)發(fā)展。

S682.31

A

1673-0038（2015）27-0251-02

2015-6-10