武 菲 程葆華 綜述 陳 京 白 波 審校

（濟寧醫(yī)學院神經生物學研究所，山東 濟寧，272067）

細胞凋亡是細胞程序性死亡的一種，其過程涉及Caspases對胞內多種蛋白的裂解作用［1］。細胞內數以百萬計的可逆性磷酸化是維持細胞穩(wěn)態(tài)所必需的，使得細胞能迅速適應內外環(huán)境變化，其中Caspases與蛋白激酶的雙向通信是細胞內重要的磷酸化反應。蛋白激酶信號通路與Caspases通路有交互聯系［2］，一方面蛋白激酶可以激活或抑制Caspases，另一方面活化的Caspases可裂解蛋白激酶，改變下游信號。另外，多種Caspases底物蛋白被蛋白激酶磷酸化后對Caspases裂解作用的敏感性改變。本文將綜述蛋白激酶對Caspases及其底物的磷酸化作用，Caspases對蛋白激酶的裂解作用，以及Caspases和蛋白激酶兩大類信號分子如何相互協調、調制細胞存活與凋亡。

1 蛋白激酶對Caspases的磷酸化作用

Caspases是細胞凋亡通路的重要組成部分，最初以惰性的酶原形式存在，在受到外源刺激如死亡受體配體或者內源性刺激如胞內成分損傷后，啟動型Caspases首先被激活（Caspase－2、－8、－9、－10），進而水解并激活執(zhí)行型（或稱效應器）Caspases（Caspase－3、－6、－7），誘發(fā)大量底物的裂解［3］，引起細胞形態(tài)、代謝的改變，最終誘發(fā)凋亡，清除細胞。Caspases的活化受到多個水平的調節(jié)，如銜接蛋白介導的活化作用、翻譯后修飾（包括磷酸化、亞硝基化、泛素化等）［4］。多種磷酸化現象起著調制Caspases信號通路的直接作用，其中包括蛋白激酶介導的磷酸化。

1．1 Caspase－9磷酸化

Cardone等首次報道Akt（protein kinase B，PKB／Akt）對 Caspase－9 的 磷 酸 化 作 用［5］。Akt（protein kinase B，PKB／Akt）磷酸化并抑制 Capase－9的活性，磷酸化位點為絲氨酸196（S196）［5］。但S196在物種間不夠保守，未能發(fā)現小鼠 Akt磷酸化Caspase－9［6］。后來報道Caspase－9更可靠的磷酸化位點為蘇氨酸125（T125），細胞外調節(jié)蛋白激酶（extracellular signal－regulated kinase，ERK）及細胞周期素依賴性激酶1（cyclin－dependent kinase 1，Cdk1）均可磷酸化T125并抑制Caspase－9激活［7］。雙特異性酪氨酸磷酸化調節(jié)激酶1A（dual－specificity tyrosine－（Y）－phosphorylation－regulated kinase A1，DYRK1A）與p38絲裂原活化 蛋 白激 酶 （p38mitogen－activated protein kinase，p38MAPK）同樣磷酸化 T125［8］。在神經發(fā)育過程中DYRK1A可保護視網膜細胞，抑制凋亡［8］。Caspase－9的其他磷酸化位點有酪氨酸153（Y153）、絲氨酸144（S144）、絲氨酸348（S348）。PKCζ磷酸化 Y153可增強 Caspase－9活性［4］。

1．2 Caspase－2磷酸化

在進化中高度保守的Caspase－2，是酪蛋白激酶2（casein kinase，CK2）、鈣調素依賴性蛋白激酶II（calmodulin－dependent protein kinase type II，CaMKII）以及 DNA 依賴性蛋白激酶（DNA－dependent protein kinase，DNA－PK）的底物。CK2作為一個組成型激活的激酶，可以磷酸化Caspase－2的S157位點，這一位點位于Caspase招募結構域與大亞基的連接區(qū)域，從而阻止Caspase－2的二聚化以及二聚化后的活化［9］。若S157磷酸化作用缺失，Caspase－2可通過非依賴p53可誘導的死亡區(qū) 域 蛋 白 （p53－induced protein with a death domain，PIDD）結構域的方式實現自體活化，這提示CK2可持續(xù)抑制Caspase－2活化［9］。Nutt等以非洲爪蟾卵細胞提取物為實驗對象，發(fā)現CaMKII磷酸化 Caspase－2的 S135，從而抑制其激活［10］。隨著卵細胞提取物逐漸耗盡儲備的營養(yǎng)物質，S135的磷酸化也逐漸減弱，最終Caspase－2激活并進入凋亡程序，細胞色素C由線粒體釋放，Caspase－3激活。這些細胞凋亡的生物化學反應可由磷酸戊糖途徑或者添加磷酸戊糖途徑產物之一NADPH來阻止，這表明CaMKII介導的S135磷酸化與新陳代謝相關［10］。Caspase－2S135的同源區(qū)域以及它的側鏈殘基在哺乳動物中保守，因此，Caspase－2的磷酸化作用可能是一種生物進化中保留的方式，聯系細胞代謝狀態(tài)與細胞凋亡途徑。但也有研究表明，在亞致死性DNA損傷的情況下，Caspase－2的S122位點（據Caspase－2的最新氨基酸序列應為S139）可被DNA－PK磷酸化而激活，誘發(fā)細胞周期停滯，而非導致細胞凋亡［11］。

1．3 Caspase－8磷酸化

已證實，Caspase－8通過酪氨酸磷酸化來進行活性調控，而非絲／蘇氨酸磷酸化。Src家族的酪氨酸激酶Src、Fyn、Lyn磷酸化Caspase－8的Y380位點并抑制其活性。Y380磷酸化可抑制Fas誘導的Caspase－8激活，并調節(jié)抗凋亡信號。Lyn除了磷酸化Caspase－8的Y380，還可磷酸化Y465，同樣抑制其活性［12］。Caspase－8除了參與細胞凋亡，也參與調控細胞遷移與黏附，Caspase－8若表達缺失將導致細胞移動性減弱［13］。Caspase－8Y380磷酸化不僅可以抑制凋亡，促進細胞遷移，還可調節(jié)胚胎發(fā)育以及腫瘤發(fā)展。

1．4 Caspase－3磷酸化

蛋白激酶既可以作用于啟動型Caspases調控凋亡啟動，還可以通過直接作用于執(zhí)行型Caspases調制凋亡信號。如Caspase－3的磷酸化位點為S150，表達于其大亞基，并且在其他啟動型與執(zhí)行型 Caspases中 高度保守（Caspase－1、－2、－4、－5、－7、－8、－9）。P38MAPK 可磷酸化 Caspase－3S150并抑制其活性，還可磷酸化Caspase－8S364。而蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）結合Caspase－3可以抵消p38MAPK的磷酸化作用，使S150去磷酸化［14］。PKCδ也可以磷酸化Caspase－3，增強其活性，但磷酸化位點尚不明確［15］。值得注意的是，PP2AAα亞基以及PKCδ同時又是Caspase－3的底物，Caspase－3可以水解這些酶，從而增強兩者活性，形成正反饋放大Caspase－3的作用，放大凋亡信號。

1．5 其他凋亡調節(jié)子磷酸化

蛋白激酶還可以通過作用于Caspase結合蛋白等其他凋亡調節(jié)子，間接調節(jié)Caspases活性。如p53腫瘤抑制因子可通過多個通路被多種蛋白激酶磷酸化從而改變功能性質。促凋亡蛋白Bad同樣也可被多種蛋白激酶磷酸化［16］，依據蛋白激酶及磷酸化位點的不同，磷酸化可促進或者抑制其促凋亡效應。

2 Caspases對蛋白激酶的作用

有些蛋白激酶本身即Caspases的底物，Caspases被激活后可進一步作用于蛋白激酶，引起下游信號的改變，從而發(fā)揮生物學效應。多種蛋白激酶如PKCδ，可被Caspases裂解激活，從而加快凋亡進程。蛋白激酶的激活機制包括催化結構域與抑制結構域因裂解而分離，裂解產物的重分布，及裂解后底物親和性改變。但是首要的，Caspases裂解蛋白激酶的產物必須能正確折疊為活化形式，具有穩(wěn)定的催化功能，并且耐受進一步的降解。Dix等［17］報道，約35%的裂解產物具有顯著的穩(wěn)定性。如細胞周期素25A（cell division cycle 25A，CDC 25A）被Caspase裂解后的產物比其原長片段蛋白更穩(wěn)定，并且蛋白激酶的Caspase裂解位點位于兩結構域的鏈接區(qū)。因此，仍可得到近乎完整的結構域片段［17］，這可能是裂解產物在功能上高度穩(wěn)定的原因之一。

以PKC為例，Caspase－3可裂解PKC的δ、ε、ζ、θ、η、μ幾個亞型，分離酶結構域與自抑結構域，從而產生組成型激活酶蛋白片段。如PKCδ具有N端膜靶向結構域、C端核定位信號（nuclear localization signal，NLS），經Caspase裂解后的片段可以定位于細胞核，并磷酸化多種蛋白如核纖層蛋白B（lamin B）、DNA－PK、p53、p73β、細胞周期調控蛋白9（cell cycle checkpoint control protein 9，Rad9）［18］，PKCδ的核 內積聚對誘發(fā)凋亡至關 重要。Caspase裂解PKCδ的產物同樣可以移位于線粒體，磷酸化抗凋亡Bcl－2家族成員髓樣細胞白血病－1蛋白（myeloid cell leukemia－1，Mcl－1）［19］。

PKCδ等蛋白激酶經Caspases水解后可以增強其促凋亡活性，幫助執(zhí)行程序性細胞死亡。Caspase介導的水解同樣可能使激酶失活，從而終止存活信號，如黏附激酶（focal adhesion kinase，FAK）以及Akt。Bachelder等發(fā)現，過表達的野生型Akt可以由Caspases裂解失活，而Akt突變型蛋白不能被Caspases裂解，因而明顯減弱或延遲細胞凋亡［20］。核轉錄因子 NF－κB信號通路中的多種成分均為Caspases的靶點，Caspases可使NF－κB信號通路失活，阻斷存活信號［21］。另外，Caspase裂解激活 NF－κB抑制因子（inhibitor of NF－κB，IκBα），進一步阻斷存活信號［21］。上述研究結果提示Caspase介導的促存活蛋白激酶失活對凋亡起著重要作用。

3 蛋白激酶對Caspase底物的磷酸化作用

蛋白激酶與Caspases的相互作用遠遠超出其各自單獨作用，蛋白激酶除了磷酸化Caspases，還可直接磷酸化Caspases的底物，明顯改變底物對Caspases裂解的敏感性。如Akt可磷酸化MST1（mammalian sterile20－like kinase 1）的 T387 位點，從而抑制MST1被Caspases水解［22］。蛋白激酶CK1、CK2磷酸化Bid的 T58、S61、S64 3個位點，與Caspases的裂解位點相鄰，保護Bid免于Caspase－8裂解［23］。腫瘤抑制因子 PTEN（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten）可由CK2磷酸化而免受Caspase－3裂解。磷脂酶 C－γ1（phospholipase C－γ1，PLCγ1）為Caspase－3與Caspase－7的底物，其磷酸化位點酪氨酸771（Y771）與Caspases裂解位點相鄰，PLCγ1磷酸化后對Caspases裂解作用的敏感性將減弱。另 有 Presenilin－2、Max、Connexin 45．6、Nogo－B等Caspases的底物，在Caspases裂解位點的臨近殘基被磷酸化后可阻斷Caspases裂解，從而參與調制細胞存活或凋亡。

磷酸化除了可以抑制Caspase介導的底物水解，同樣可以增強Caspases的作用，最終抑制或者促進凋亡，取決于底物的性質。如激酶Src磷酸化Caspase－3酪氨酸332（Y332）位點后可以增強Caspase－3對PKCδ的裂解［24］。C－Jun氨基末端激酶（c－Jun N－terminal kinase，JNK）磷酸化 Bcl－2家族蛋白BimEL后，BimEL對Caspase－3裂解的敏感性增強［25］。

4 應用

在蛋白激酶與Caspases交互作用的情況下，分別檢測蛋白激酶家族的共有識別序列以及Caspases家族的共有識別序列，結果提示兩者共有識別序列可能存在重疊，并且多種蛋白磷酸化的位點臨近Caspases的裂解位點。因為天冬氨酸為Caspases的裂解位點，這一點提示蛋白激酶與Caspases的識別序列如確有重疊，其主要特異性識別序列可能為酸性氨基酸殘基，可能包括嗜酸性蛋白激酶（如蛋白激酶CK1、CK2）的識別序列。

CK2是蛋白激酶網絡中的一個組成部分，已發(fā)現CK2可以通過磷酸化機制保護多種胞內蛋白質。CK2 可磷酸化 Bid、Max、PTEN、Caspase－9等，使其免于其他Caspases的裂解。既然CK2可保護某些蛋白免于Caspases裂解，那么增高的CK2可能會促進細胞存活；CK2水平降低將致細胞對凋亡刺激更敏感。Guo等報道CK2表達升高明顯增強凋亡刺激后前列腺癌細胞的存活［26］。另有大量報道腫瘤細胞的存活必需CK2。而用抑制劑抑制CK2活性或用siRNA／RNAi抑制其表達，都會使細胞對多種凋亡刺激更敏感。

多種腫瘤包括乳腺癌、膀胱癌、肺癌、白血病等，CK2活性異常增高。采用基因表達連續(xù)分析（serial analysis of gene expression，SAGE）的方法檢測在轉移性腫瘤組織中表達上調的基因，結果顯示多種組織來源的腫瘤均有CK2表達異常增高。雖然目前CK2的胞內調節(jié)機制尚未完全闡明，但有相當多的證據表明，CK2為組成型激活。某些蛋白激酶需要磷酸化等刺激才可活化，而CK2表達時其催化亞基即具有催化活性，不需要額外的刺激。因此，可以推測在白血病細胞等腫瘤細胞中CK2的異常增高，會導致生理性CK2底物超磷酸化。另外，異常過表達的CK2若同時伴隨其亞細胞分布的變化，出現在生理情況下本不表達的區(qū)域，CK2將磷酸化非典型底物，即正常CK2水平不會磷酸化的蛋白將被磷酸化。因此，不論CK2水平的異常增高磷酸化的是生理性底物或病理性底物，都可能導致對凋亡刺激的反應降低及細胞存活增強。上述研究結果指示CK2有潛力成為分子治療靶點。

5 小結與展望

已證實多種疾病都與蛋白激酶及其調制的信號轉導有關，蛋白激酶已經成為一大類潛在的治療靶點。例如，蛋白激酶抑制劑伊馬替尼可特異的抑制BCR－ABL蛋白激酶，目前已成功地應用于慢性髓細胞性白血病的治療。雖然有多種蛋白激酶抑制劑具有應用于分子靶向治療的潛力，但是困難同樣存在。首先，需要克服蛋白激酶抑制劑的靶點外效應。靶點外效應可能是因為靶向蛋白激酶與其超家族其他成員甚至其他類激酶具有結構或者功能上的共同點，因此造成某一激酶抑制劑的作用牽涉到其他酶類。例如，有一類蛋白激酶抑制劑是靶向于激酶的催化位點，競爭性抑制與ATP的結合，因此，靶點外效應可能源自抑制劑對其他ATP結合蛋白的交叉作用。其次，磷酸化作為一種基礎調節(jié)機制無處不在，許多蛋白激酶具有多效性，并參與多種生理病理反應，包括正常細胞生理穩(wěn)態(tài)的維持。因此，盡管已經發(fā)現多種蛋白激酶在某些疾病狀態(tài)下功能紊亂，具有成為治療靶點的潛力，仍需要首先明確抑制這些酶類對正常細胞功能有怎樣的影響。

除蛋白激酶外，細胞內另有Caspases網絡參與凋亡的起始與執(zhí)行，調節(jié)細胞存活，Caspases網絡的紊亂可誘發(fā)細胞存活狀況的改變。但是以Caspases為治療靶點也有困難，因為Caspases家族成員也有結構和功能上的共性，因此難以選擇性的靶向某一特異的Caspase成員。除了參與凋亡，Caspases同樣參與分化等非細胞死亡或凋亡的過程，提示我們需要區(qū)分Caspases在生理穩(wěn)態(tài)以及疾病狀態(tài)時的作用。

Caspases與蛋白激酶存在交互作用，磷酸化可以保護Caspases及其底物免于裂解，致使細胞對凋亡刺激反應減弱、細胞存活增強。一方面，CK2等蛋白激酶表達增高或活性增強，使Caspases及其底物裂解減少，細胞對凋亡刺激敏感性下降，這可能是腫瘤發(fā)生的機制之一；另一方面，腦缺血等病理情況可能誘發(fā)CK2等蛋白激酶活性減弱、表達下調，使細胞對凋亡刺激反應增強。因此，明確蛋白激酶網絡與Caspases網絡的交互作用，兩者在生理與病理情況下的調節(jié)機制具有至關重要的意義。

［1］ Sun L，Wang X．A new kind of cell suicide：mechanisms and functions of programmed necrosis［J］．Trends Biochem Sci，2014，39（12）：587－593．

［2］ Cho Y S．Perspectives on the therapeutic modulation of an alternative cell death，programmed necrosis［J］．Int J Mol Med，2014，33（6）：1401－1406．

［3］ Almagro M C，Vucic D．Necroptosis：Pathway diversity and characteristics［J］．Semin Cell Dev Biol，2015，39：56－62．

［4］ Fiandalo M V，Kyprianou N．Caspase control：protagonists of cancer cell apoptosis［J］．Exp Oncol，2012，34（3）：165－175．

［5］ Cardone M H，Roy N，Stennicke H R，et al．Regulation of cell death protease Caspase－9by phosphorylation［J］．Science，1998，282（5392）：1318－1321．

［6］ Fujita E，Jinbo A，Matuzaki H，et al．Akt phosphorylation site found in human Caspase－9is absent in mouse Caspase－9［J］．Biochem Biophys Res Commun，1999，264（2）：550－555．

［7］ Wu W，Ye H，Wan L，et al．Millepachine，a novel chalcone，induces G2／M arrest by inhibiting CDK1activity and causing apoptosis via ROS－mitochondrial apoptotic pathway in human hepatocarcinoma cells in vitro and in vivo［J］．Carcinogenesis，2013，34（7）：1636－1643．

［8］ Mavropoulos A，Orfanidou T，Liaskos C，et al．p38MAPK Signaling in Pemphigus：Implications for Skin Autoimmunity［J］．Autoimmune Dis，2013，2013：728529．

［9］ Wu L，Xi Z，Guo R，et al．Exogenous ARC down－regulates caspase－3expression and inhibits apoptosis of broiler chicken cardiomyocytes exposed to hydrogen peroxide［J］．Avian Pathol，2013，42（1）：32－37．

［10］McCoy F，Darbandi R，Chen S I，et al．Metabolic regulation of CaMKII protein and caspases in Xenopus laevis egg extracts［J］．J Biol Chem，2013，288（13）：8838－8848．

［11］Shi M，Vivian C J，Lee K J，et al．DNA－PKcs－PIDDosome：a nuclear Caspase－2－activating complex with role in G2／M checkpoint maintenance［J］．Cell，2009，136（3）：508－520．

［12］Pozzesi N，Fierabracci A，Thuy T T，et al．Pharmacological modulation of caspase－8in thymus－related medical conditions［J］．J Pharmacol Exp Ther，2014，351（1）：18－24．

［13］Salvesen G S，Walsh C M．Functions of caspase 8：the identified and the mysterious［J］．Semin Immunol，2014，26（3）：246－252．

［14］Alvarado－Kristensson M，Andersson T．Protein phosphatase 2Aregulates apoptosis in neutrophils by dephosphorylating both p38MAPK and its substrate Caspase 3［J］．J Biol Chem，2005，280（7）：6238－6244．

［15］Webster C R，Johnston A N，Anwer M S．Protein kinase Cδ protects against bile acid apoptosis by suppressing proapoptotic JNK and BIM pathways in human and rat hepatocytes［J］．Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2014，307（12）：G1207－1215．

［16］Winter P S，Sarosiek K A，Lin K H，et al．RAS signaling promotes resistance to JAK inhibitors by suppressing BAD－mediated apoptosis［J］．Sci Signal，2014，7（357）：ra122．

［17］Chondrogianni N，Petropoulos I，Grimm S，et al．Protein damage，repair and proteolysis［J］．Mol Aspects Med，2014，35：1－71．

［18］Iitaka D，Moodley S，Shimizu H，et al．PKCδ－iPLA2－PGE2－PPARγsignaling cascade mediates TNF－αinduced Claudin 1 expression in human lung carcinoma cells［J］．Cell Signal，2015，27（3）：568－577．

［19］Morales－Cano D，Calvi?o E，Rubio V，et al．Apoptosis induced by paclitaxel via Bcl－2，Bax and caspases 3and 9activation in NB4human leukaemia cells is not modulated by ERK inhibition［J］．Exp Toxicol Pathol，2013，65（7－8）：1101－1108．

［20］Bachelder R E，Wendt M A，Fujita N，et al．The cleavage of Akt／protein kinase B by death receptor signaling is an important event in detachment－induced apoptosis［J］．J Biol Chem，2001，276（37）：34702－34707．

［21］Hussain A R，Ahmed S O，Ahmed M，et al．Cross－talk between NFkB and the PI3－kinase／AKT pathway can be targeted in primary effusion lymphoma（PEL）cell lines for efficient apoptosis［J］．PLoS One，2012，7（6）：e39945．

［22］Du X，Shi H，Li J，et al．Mst1／Mst2regulate development and function of regulatory T cells through modulation of Foxo1／Foxo3stability in autoimmune disease［J］．J Immunol，2014，192（4）：1525－1535．

［23］Koch S，Capaldo C T，Hilgarth R S，et al．Protein kinase CK2 is a critical regulator of epithelial homeostasis in chronic intestinal inflammation［J］．Mucosal Immunol，2013，6（1）：136－145．

［24］Lu W，Lee H K，Xiang C，et al．The phosphorylation of tyrosine 332is necessary for the Caspase 3－dependent cleavage of PKCδand the regulation of cell apoptosis［J］．Cell Signal，2007，19（10）：2165－2173．

［25］Wiens O，Xia D，von Schubert C，et al．Cell cycle－dependent phosphorylation of Theileria annulata schizont surface proteins［J］．PLoS One，2014，9（7）：e103821．

［26］Guo C，Yu S，Davis A T，et al．A potential role of nuclear matrix－associated protein kinase CK2in protection against druginduced apoptosis in cancer cells［J］．J Biol Chem，2001，276（8）：5992－5999．