齊恩芳，王一航，文國(guó)宏，賈小霞

（甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所，甘肅 蘭州 730 0 70)

離體條件下誘導(dǎo)形成的試管薯不僅具有試管苗的所有優(yōu)點(diǎn)，而且體積小、重量輕，繁殖期間杜絕了外來病菌的再次侵染，便于貯藏、運(yùn)輸和種植。馬鈴薯試管薯的誘導(dǎo)與生產(chǎn)，對(duì)于馬鈴薯種質(zhì)保存、種子交換、脫毒薯生產(chǎn)及在馬鈴薯基因工程研究中作為基因轉(zhuǎn)移的受體等方面都有重要意義。試管薯的形成受諸多因素的影響，如基因型、試管苗的健壯程度、礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)、碳源、外源激素、植物生長(zhǎng)延緩劑以及環(huán)境因素（溫度、光照）[1-3]等，關(guān)于試管薯誘導(dǎo)已有很多成功的實(shí)例，但對(duì)于自然條件下馬鈴薯試管結(jié)薯的研究還未見報(bào)道，利用自然光培養(yǎng)室生產(chǎn)試管薯，設(shè)備簡(jiǎn)單，節(jié)約成本，可充分利用自然空間工廠化批量生產(chǎn)試管薯。

本試驗(yàn)以‘隴薯3號(hào)’和‘隴薯7號(hào)’為材料，研究了自然光照、溫度、培養(yǎng)基等試管薯生產(chǎn)關(guān)鍵條件的誘導(dǎo)效果，進(jìn)一步探索高效優(yōu)質(zhì)低成本規(guī)?；a(chǎn)試管薯的新途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所保存的‘隴薯3號(hào)’和‘隴薯7號(hào)’脫毒試管苗。

1.2 試驗(yàn)地點(diǎn)及時(shí)間

試驗(yàn)在甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所脫毒中心進(jìn)行，試驗(yàn)時(shí)間在冬季（11月至次年2月），該時(shí)期晝夜溫差大，日照時(shí)間8 h左右。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試管苗培養(yǎng)

在無菌條件下，將試管苗切成帶1個(gè)葉節(jié)的莖段，接種于裝有40 mL MS固體培養(yǎng)基和25 mL MS液體培養(yǎng)基（脫脂棉支撐）的250 mL消毒果醬瓶中，每瓶15株，在自然光培養(yǎng)室培養(yǎng)21 d，長(zhǎng)成壯苗后用于試管薯誘導(dǎo)試驗(yàn)。

1.3.2 試管薯誘導(dǎo)

采用兩因素三水平隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共9個(gè)處理（表1）。A為光溫條件，A1：自然光照室溫培養(yǎng)，A2：自然光照室溫培養(yǎng)7 d轉(zhuǎn)黑暗恒溫培養(yǎng)，A3：黑暗恒溫培養(yǎng)。B為培養(yǎng)基類型，B1：“液體+液體”培養(yǎng)基，B2：“液體+固體”培養(yǎng)基，B3：固體培養(yǎng)基。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Experimental design

上述光溫條件中，自然光照室溫培養(yǎng)在自然光照培養(yǎng)室進(jìn)行，晝夜溫度范圍為5～22℃，光照時(shí)間8 h左右，試驗(yàn)材料置于培養(yǎng)架最下層，光照強(qiáng)度約1 000～4 000 lx；黑暗恒溫培養(yǎng)在暗室（空調(diào)控溫）進(jìn)行，溫度17±1℃。3種培養(yǎng)基類型為：將液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS+8%白糖+5 mg/L 6-BA）分裝入500 mL三角瓶中，滅菌后按每瓶40 mL直接倒入液體培養(yǎng)的試管苗培養(yǎng)瓶誘導(dǎo)試管薯，簡(jiǎn)稱“液體+液體”；倒入固體培養(yǎng)的試管苗培養(yǎng)瓶誘導(dǎo)試管薯，簡(jiǎn)稱“固體+液體”；將固體培養(yǎng)的試管苗切段轉(zhuǎn)接入裝有40 mL固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS+4.5 g/L瓊脂+8%白糖+5 mg/L 6-BA）的培養(yǎng)瓶中，簡(jiǎn)稱“固體”。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及數(shù)據(jù)處理

培養(yǎng)期間記錄結(jié)薯時(shí)間及薯塊膨大相關(guān)數(shù)據(jù)，于誘導(dǎo)培養(yǎng)56 d后測(cè)定薯塊直徑（mm）、單瓶結(jié)薯數(shù)（d＞3 mm)、單瓶薯重（g/瓶）、單薯重（g/個(gè)）、成薯指數(shù)（結(jié)薯數(shù)/接種株數(shù)）、大薯數(shù)（d＞5 mm）和大薯率。

數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行二因素方差分析（LSD法）。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)條件對(duì)‘隴薯3號(hào)’試管薯誘導(dǎo)效果的影響

從表2分析的結(jié)果可知，A因子對(duì)‘隴薯3號(hào)’試管結(jié)薯的各項(xiàng)指標(biāo)均無顯著影響；B因子對(duì)單瓶薯重、平均單薯重、薯塊平均直徑、大薯數(shù)及大薯率有影響，B1處理的單瓶薯重、平均單薯重及薯塊平均直徑極顯著高于B2、B3；大薯數(shù)及大薯率極顯著高于B3，與B2差異不顯著。

A×B交互作用對(duì)單瓶薯數(shù)和成薯指數(shù)無顯著影響，但對(duì)單瓶薯重、平均單薯重及薯塊平均直徑影響顯著（P＜0.05）（表2）。其中A1B1（“液體+液體”培養(yǎng)基，自然光照室溫培養(yǎng)）為最優(yōu)條件，A1B1條件下平均單薯重0.30 g，顯著高于A1B2、A1B3、A2B3和A3B3；薯塊平均直徑為7.83 mm，顯著高于A1B2、A1B3、A2B1、A2B3、A3B2和A3B3；在A2B1、A2B2和A3B2培養(yǎng)條件下的平均單薯重均顯著高于A1B3、A2B3和A3B3；在A2B2培養(yǎng)條件下的薯塊平均直徑也顯著高于A1B3、A2B3和A3B3?！]薯3號(hào)’試管結(jié)薯情況見圖1A。

2.2 培養(yǎng)條件對(duì)‘隴薯7號(hào)’試管薯誘導(dǎo)效果的影響

從表3分析的結(jié)果可知，A因子對(duì)‘隴薯7號(hào)’試管薯的單瓶薯數(shù)、成薯指數(shù)、單瓶薯重及大薯數(shù)有影響，A1處理極顯著高于A2、A3處理。B因子對(duì)單瓶薯重、平均單薯重、薯塊平均直徑、大薯數(shù)及大薯率均有影響，以B1最優(yōu)，與B3間差異極顯著。B1與B2之間，薯塊平均直徑差異極顯著，平均單薯重差異顯著，其余指標(biāo)差異不顯著。B2與B3間，薯塊平均直徑、大薯率差異極顯著；單瓶薯重、平均單薯重及大薯數(shù)差異顯著。

A×B交互作用對(duì)單瓶薯數(shù)、成薯指數(shù)、平均單薯重、薯塊平均直徑、大薯數(shù)及大薯率均無顯著

影響，但對(duì)單瓶薯重影響顯著。其中A1B1（“液體+液體”培養(yǎng)基，自然光照室溫培養(yǎng)）條件下‘隴薯7號(hào)’試管薯單瓶薯重為6.74 g，與A1B2差異不顯著，但顯著高于其他處理；A1B2處理也顯著高于A2B3、A3B1、A3B2和A3B3?！]薯7號(hào)’試管結(jié)薯情況見圖1B。

表2 不同培養(yǎng)條件對(duì)‘隴薯3號(hào)’試管薯誘導(dǎo)與發(fā)育的影響Table 2 Effects of different cultural conditions on induction and development of'Longshu 3'microtuber

表3 不同培養(yǎng)條件對(duì)‘隴薯7號(hào)’試管薯誘導(dǎo)與發(fā)育的影響Tab 3 Effect of different cultural conditions on induction and development of'Longshu 7'microtuber

圖1 ‘隴薯3號(hào)’（A）和‘隴薯7號(hào)’（B）誘導(dǎo)試管薯Figure 1 'Longshu 3'(A)and'Longshu 7'(B)microtuber induction

3 討論

光周期是馬鈴薯結(jié)薯的主要誘導(dǎo)因子。無光條件可促進(jìn)光合產(chǎn)物向塊莖中分配，減少光合產(chǎn)物在地上莖中的分配，但黑暗處理時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)造成植株生活力下降，從而影響營(yíng)養(yǎng)的吸收和轉(zhuǎn)化，最終降低結(jié)薯能力，故光周期必須適宜，才能誘導(dǎo)試管結(jié)薯。在該領(lǐng)域已有較多的研究[4-7]，認(rèn)為誘導(dǎo)期間進(jìn)行一定階段光照處理有利于試管薯的形成，柳俊和謝從華[8]也認(rèn)為，黑暗處理和短日照條件對(duì)試管塊莖的形成是有利的，黑暗處理有利于匍匐莖的發(fā)生，短日照有利于試管薯的膨大。劉夢(mèng)蕓等[9]研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)時(shí)間的暗處理使塊莖形成顯著提早，但結(jié)薯數(shù)少，植株莖葉生長(zhǎng)受阻，塊莖淀粉含量降低。沈清景等[10]研究表明，全黑暗條件對(duì)試管薯形成、結(jié)薯數(shù)量和平均鮮重具有極顯著的促進(jìn)作用。Gopal等[11]研究認(rèn)為，較短光周期，較低光照強(qiáng)度對(duì)不同基因型的品種的適應(yīng)性較好，能獲得較多的試管薯個(gè)數(shù)和較高的產(chǎn)量。以上研究中的短日照處理均是在室內(nèi)日光燈補(bǔ)充光照，利用日光作為光源補(bǔ)充誘導(dǎo)結(jié)薯的研究未見報(bào)道。本試驗(yàn)利用自然光照作試管薯誘導(dǎo)中光照處理，研究發(fā)現(xiàn)，短日照條件與全黑暗均能誘導(dǎo)2品種結(jié)薯，而且塊莖形成對(duì)發(fā)育階段無特殊要求，剛剛生長(zhǎng)1片葉的植株就能形成塊莖（圖1A和1B）。就本試驗(yàn)而言，從結(jié)薯數(shù)與結(jié)薯大小來看，自然光照室溫條件更有利于‘隴薯7號(hào)’試管薯的形成，其產(chǎn)量還高于黑暗培養(yǎng)。這可能是由于本試驗(yàn)在冬季進(jìn)行，屬短日照期，且自然光培養(yǎng)室光照弱，整體環(huán)境適于試管薯的誘導(dǎo)。

溫度影響試管薯形成。低溫可誘導(dǎo)馬鈴薯塊莖形成，高溫則可以完全抑制[12]。田間試驗(yàn)證明，馬鈴薯塊莖田間形成的適宜溫度為15.6～18.3℃，高于21.1℃，塊莖生長(zhǎng)速度下降[13]。馬鈴薯試管薯是在試管微環(huán)境條件下生長(zhǎng)發(fā)育的，對(duì)溫度條件的要求更嚴(yán)格，連勇等[14]認(rèn)為，對(duì)試管薯形成大小及薯重而言，溫度效應(yīng)高于外源誘導(dǎo)劑，溫度對(duì)平均單瓶結(jié)薯數(shù)影響不顯著。他還認(rèn)為，在全黑暗誘導(dǎo)條件下，‘中薯3號(hào)’試管薯形成的最適溫度為15～20℃，劉志云[15]研究發(fā)現(xiàn)，低溫可誘導(dǎo)馬鈴薯塊莖形成，溫度增至32℃不產(chǎn)生塊莖，對(duì)于‘克山予64’，最適宜的溫度為18℃，適宜范圍為18～22℃。本試驗(yàn)中，自然光培養(yǎng)室有日夜溫差，在變溫5～22℃與恒溫17℃2種溫度條件下，‘隴薯3號(hào)’與‘隴薯7號(hào)’均能結(jié)薯。

培養(yǎng)基對(duì)試管薯形成有明顯的影響。本研究認(rèn)為，無論是試管苗的增殖生長(zhǎng)還是試管薯的誘導(dǎo)發(fā)育，液體培養(yǎng)基一般優(yōu)于固體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)可復(fù)壯試管苗，提高其增殖率，促進(jìn)試管薯提早結(jié)薯與增加薯重等[10,16]。本試驗(yàn)采用3種培養(yǎng)基方式誘導(dǎo)結(jié)薯，結(jié)果表明，“液體+液體”誘導(dǎo)培養(yǎng)，試管薯大薯多、產(chǎn)量高，‘隴薯3號(hào)’試管薯單薯重達(dá)到0.26 g，平均直徑7.15 mm，大薯率（d＞5 mm）達(dá)到90.06%；‘隴薯7號(hào)’試管薯單薯重達(dá)到0.24 g，平均直徑6.54 mm，大薯率（d＞5 mm）達(dá)到91.18%，“液體+液體”培養(yǎng)基處理下2個(gè)品種單瓶薯重、平均單薯重、薯塊平均直徑、大薯數(shù)和大薯率均極顯著高于“固體+液體”和“固體”培養(yǎng)基，“固體+液體”培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)，程序簡(jiǎn)便，試管薯產(chǎn)量較高，固體培養(yǎng)基直接誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)薯時(shí)間短，試管薯之間差異小，成熟整齊一致。此外，黑暗恒溫培養(yǎng)條件下，“液體+液體”、“固體+液體”和“固體”3種培養(yǎng)基在結(jié)薯時(shí)間上也有差異，‘隴薯3號(hào)’初始結(jié)薯時(shí)間分別為12，15和22 d，‘隴薯7號(hào)’初始結(jié)薯時(shí)間分別為15，19和21 d，表明“液體+液體”培養(yǎng)基方式下結(jié)薯時(shí)間早。至于基因型對(duì)結(jié)薯時(shí)間的影響，有人認(rèn)為，早熟品種試管薯誘導(dǎo)結(jié)薯早，結(jié)薯能力強(qiáng)[17]，本試驗(yàn)中兩供試品種均為中晚熟品種，在結(jié)薯時(shí)間上沒有品種差異。

通過試驗(yàn)可以得到如下結(jié)論。試驗(yàn)在自然光照培養(yǎng)室進(jìn)行，自然光照條件誘導(dǎo)結(jié)薯不受空間限制，且節(jié)約能源，光照條件提高了試管苗的生活力，利于試管薯的膨大，對(duì)于工廠化規(guī)模生產(chǎn)試管薯具有很好的指導(dǎo)作用。因該試驗(yàn)在冬季進(jìn)行，日照時(shí)間短，自然光培養(yǎng)室光照弱，晝夜溫差大，可能正好具備試管薯誘導(dǎo)的光溫條件，在其他季節(jié)，自然光誘導(dǎo)的效果如何，還需要進(jìn)行更深入的研究。試管薯發(fā)育具有基因型差異，試管薯在誘導(dǎo)過程中，對(duì)光溫條件的敏感程度因品種而異。試驗(yàn)中，‘隴薯3號(hào)’對(duì)光照、溫度及黑暗處理時(shí)間的反應(yīng)均不敏感；但光溫對(duì)‘隴薯7號(hào)’試管薯發(fā)育影響明顯，自然光照利于其試管薯的形成?！耙后w+液體”培養(yǎng)基處理結(jié)薯時(shí)間早，數(shù)量多，大薯率高，而且不使用瓊脂，相對(duì)節(jié)約成本，可作為試管薯生產(chǎn)的主要方式。

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