牛艷君，李 瑩，白仲添，呂青芳，嚴 祥*

(蘭州大學 第一醫(yī)院 1.老年病科; 2.甘肅省生物治療與再生醫(yī)學重點實驗室; 3.腫瘤內科, 甘肅 蘭州 740000)

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短篇綜述

干細胞標記及示蹤技術的應用研究

牛艷君1，李 瑩2，白仲添2，呂青芳3，嚴 祥1*

(蘭州大學 第一醫(yī)院 1.老年病科; 2.甘肅省生物治療與再生醫(yī)學重點實驗室; 3.腫瘤內科, 甘肅 蘭州 740000)

在基礎研究及臨床應用中，對干細胞遷徙路徑的標記及在靶病灶的作用研究已成為重點。采用創(chuàng)新性、突破性的干細胞標記及示蹤技術，了解干細胞在機體內的遷徙途徑，監(jiān)測和追蹤干細胞移植治療后的效果，對其在動物實驗和臨床應用方面都起到良好的促進作用。

干細胞標記；示蹤；遷徙途徑

近年來，隨著醫(yī)學的發(fā)展，人們發(fā)現傳統方法只能使許多器官損傷疾病減輕其并發(fā)癥，不能從根本上解決疾病的根本問題，患者的健康水平和生活質量、精神狀態(tài)都遭受嚴重的威脅。醫(yī)學的進步需要研究新的臨床治療手段，干細胞應用于疾病的治療研究，為臨床事業(yè)帶來良好的應用前景，并且得到了越來越多研究的證實，動物實驗及臨床試驗已取得令人鼓舞的研究成果。但是，干細胞在疾病治療用途中真正起作用的機制至今不明，干細胞的標記方法及示蹤技術沒有明顯的突破性是其原因之一，為了更好地了解干細胞在機體內的遷徙途徑，本文對國內外干細胞的發(fā)展、標記及示蹤技術進行了回顧和總結，為干細胞的基礎研究及作用機制的揭示起一定的支撐作用。

1 干細胞的標記及示蹤技術

1.1 基因轉染標記法

在干細胞上標記轉染基因，檢測干細胞移植后的生物學特性。綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)標記干細胞在實驗中尤為常見。GFP不需要與其他物質合作，只需要用藍光照射，就能自我發(fā)光。GFP的熒光穩(wěn)定，易于構建載體、可進行活細胞定時定位觀察、在許多動植物中都能夠表達成功并發(fā)出熒光，可用顯微鏡呈像技術方便地在活細胞中檢測，適用與其他熒光試劑同時進行雙標實驗。GFP對干細胞進行標記最明顯的優(yōu)勢是無需底物或輔因子參與，即可在活細胞或動物中進行有效地標記，GFP已成功地靶入了大部分細胞器中[1]。目前，GFP的具體半衰期還未知，不利于在實驗中對時間的掌控，并且一些物理因素如高溫等；化學因素有強酸等可以破壞它水化層或雙電層，對其進行降解。

1.2 熒光染料標記法

干細胞移植前，使用熒光素進行預先標記，移植后利用熒光顯微鏡觀察熒光標記的干細胞的遷徙情況，目前以Dil的衍生物CM-Dil的標記更為高效。CM-Dil通過與膜結構的脂質分子結合而標記細胞，有著強而穩(wěn)定的紅色熒光，它容易嵌進生物質膜內并在膜內做定向擴散運動從而標記整個細胞，是目前最好的熒光染料[2]。CM-Dil標記細胞后再進行各種操作都不會影響其熒光，是免疫熒光組化和原位雜交中理想的細胞熒光標記染料。CM-Dil標記后熒光在胞內表達穩(wěn)定，陽性標記率高，標記細胞形態(tài)良好，能有效地觀察細胞在體外的誘導分化情況[3]。但是，CM-Dil是通過細胞膜進行標記，隨著細胞的分裂增殖造成熒光的指數級衰減，使其很難維持長時間的高標記率。

1.3 熒光原位雜交標記法

熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)方法，即制備DNA或RNA 探針，通過原位雜交的方法，使特定的DNA或RNA序列在細胞或染色體上顯示出來，使用熒光顯微鏡檢測，最后對其結果進行分析。FISH技術[4]使用經濟、增強了安全性，簡化操作流程、效率高和定位準確。多色FISH通過在同一個核中顯示不同的顏色可同時檢測多種序列，既可以在載玻片上顯示中期染色體數量或結構的變化，也可以在懸液中顯示間期染色體DNA的結構。熒光原位雜交技術對即時發(fā)現腫瘤和預后都有良好的指導作用。但是，該方法不能達到100%雜交，特別是在應用較短的cDNA探針時效率明顯下降。

1.4 核酸標記法

5-溴脫氧尿嘧啶核苷(Brdu)是一種嘧啶類似物，與內源性胸腺嘧啶核苷競爭插入DNA中，經過免疫組化染色，跟隨標記細胞增殖傳代，反映細胞增殖并且跟蹤檢測移植細胞動態(tài)變化[5]。核素標記法避免了放射性污染, 安全性高，并且Brdu抗體不與胸腺嘧啶發(fā)生交叉反應，對活體動物進行標記時，無任何不良反應。在研究干細胞體內移植后的分化時, 更可采用雙標法顯示干細胞的其他特性。但是，Brdu標記存在著標記率不穩(wěn)定的特點，隨著標記時間的增長，細胞的凋亡，吞噬細胞的吞噬作用，周圍細胞也可能會被Brdu標記，移植細胞標記強度降低或丟失，從而很難測定出真正需要檢測觀察的干細胞。

1.5 磁共振成像技術

磁共振(Nuclear Magnetic Resonance, NMR)活體示蹤SPIO細胞已經成為新的研究熱點。在體外使用SPIO對干細胞進行標記，經過轉染劑修飾后進一步提高細胞的有效磁標記率，含鐵顆粒即可進入移植細胞內，標記率可達到99%[6]。在一定的濃度范圍內，鐵顆粒對細胞的活性沒有明顯的影響，然后利用磁共振成像對干細胞進行追蹤，根據其位置的改變和信號的衰減從而判斷干細胞的增殖、移行和空間分布情況，SPIO納米顆粒標記技術逐漸成熟[7]。但是，實驗過程中，細胞增生分裂死亡，氧化鐵微粒會殘留在死亡的組織內或者被巨噬細胞吞噬，會導致標記敏感性下降，造成假陽性結果，同時，需要考慮氧化鐵造影劑顆粒對機體所產生的長期影響。

1.6 近紅外熒光成像技術

半導體量子點(Quantum Dots, QDS)為現在廣泛使用的近紅外熒光材料，QDS具有寬而連續(xù)的吸收譜，光漂白性小，可進行活體內示蹤成像和長時間觀察；同時，觀察標記的干細胞不需要注入其他的試劑或酶等，相對要方便許多。采用深紅色熒光(DiR)對移植入動物體內干細胞的狀況進行評估，清楚地看到干細胞從動物的脾臟移行到肝臟[8]。近紅外熒光成像技術生物穿透能力強、光子量探測域值低、檢測靈敏度高，在干細胞示蹤標記中展現出巨大的應用潛力。但是半導體量子點等無機染料對人類有一定不良反應，如何在不降低量子點分辨率的前提下，降低不良反應是近紅外熒光成像技術開發(fā)研究的重點。

1.7 Y染色體標記示蹤

Y染色體是屬于XY性別決定系統雄性個體的特異性基因結構，穩(wěn)定而持久存在，針對Y染色體上特異的基因序列進行標記，制備探針，可以對標記的干細胞進行長久的示蹤，移植入雌性動物體內，利用性別的差異對干細胞進行識別,隨后若檢測雌性受體動物靶區(qū)域含有Y染色體，則證明該細胞為移植進來的外源性供體細胞，不需要對干細胞進行額外的實驗處理，優(yōu)勢明顯。但Y染色體的穩(wěn)定性和靈敏度還需要進一步實驗的研究和驗證。

1.8 常染色體標記示蹤

標記染色體是在腫瘤細胞內常見到結構異常的染色體，具有有特殊的形態(tài)，且便于識別。將干細胞某一性狀定位于動物染色體的一特定區(qū)域，根據標記染色體的特異性去檢測干細胞。這種方法尚未在干細胞移植的動物實驗和臨床研究中使用，還需要完善的理論和大量的實驗進行證實。

1.9 循環(huán)細胞(CellSearch)標記示蹤

CellSearch系統[9]是目前自動化程度最高的CTCs檢測技術，受人為因素影響較小，該系統集免疫磁珠富集技術和免疫熒光技術于一體，具有較高的特異性和可重復性，能夠實時反應腫瘤的生物狀態(tài)，動態(tài)識別腫瘤分子靶點，為患者個體化治療提供可靠的理論基礎和臨床證據[10]。如果使用這項技術，能夠對標記干細胞進行動態(tài)示蹤，就能夠實時檢測干細胞，干細胞標記及示蹤的研究將會出現新的領域。

2 干細胞標記及示蹤技術的總結與展望

研究創(chuàng)新性、突破性的干細胞標記示蹤技術，有助于進一步了解干細胞發(fā)揮功能的機制，從而使其轉化為有效的臨床應用治療。理想的干細胞標記方法應具有簡單易行、特異性強、靈敏度高、無明顯毒性、受外界干擾因素小和假陽性率低等特點。當前，成熟的干細胞標記示蹤技術方法眾多，但每一種方法都有其優(yōu)缺點，干細胞移植后，難以對移植后細胞的功效做客觀準確的評價。目前，一些特異性和標志性的標記及示蹤技術需要進一步深入研究，這將有助于了解干細胞在機體的遷徙途徑、存活時間、相互作用以及改善組織微環(huán)境的影響因子。

[1] Tang L, Chang J. Effect of GFP-containing lentivirus infection on the expression of octamer transcription factor 4 in human umbilical cord mesenchymal stem cells [J]. Cell Mol Biol, 2013, 29: 292- 296.

[2] Golab K, Kizilel S, Bal T,etal. Improved coating of pancreatic islets with regulatory T cells to create local immunosuppression by using the biotin-polyethylene glycol-succinimidyl valeric acid ester molecule [J]. Transpl Proc, 2014, 46: 1967- 1971.

[3] Li CZ, Xiao JM, Chen LX,etal. Isolation, culture and CM-Dil labeling of rat mesenchymal stem cellsinvitro[J]. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu, 2014, 18: 39- 44.

[4] Terai M, Izumiyama-Shimomura N, Aida J,elal. Arm-specific telomere dynamics of each individual chromosome in induced pluripotent stem cells revealed by quantitative fluorescence in situ hybridization [J]. Tissue Cell, 2014, 46: 470- 476.

[5] Sauerzweig S, Baldauf K, Braun H,etal. Time-dependent segmentation of BrdU-signal leads to late detection problems in studies using BrdU as cell label or proliferation marker [J]. J Neurosci Methods, 2009, 177: 149- 159.

[6] Chickera S, Willert C, Mallet C,etal. Cellular MRI as a suitable, sensitive non-invasive modality for correlatinginvitromigratory efficiencies of different dendritic cell populations with subsequent immunological outcomes [J]. Int Immunol, 2012, 24: 29- 41.

[7] Struys T, Ketkar-Atre A, Gervois P,etal. Magnetic resonance imaging of human dental pulp stem cellsinvitroandinvitro[J]. Cell Transplant, 2013, 22: 1813- 1829.

[8] Ezzat T, Dhar DK, Malago M,etal. Dynamic tracking of stem cells in an acute liver failure model [J]. World J Gastroenterol, 2012, 18: 507- 516.

[9] Sastre J, Maestro ML, Gomez-Espana A,etal. Circulating tumor cell count is a prognostic factor in metastatic colorectal cancer patients receiving first-line chemotherapy plus bevacizumab: a spanish cooperative group for the treatment of digestive tumors study [J]. Oneologist, 2012, 17: 947- 955.

[10] Broersen LH, van Pelt GW, Tollenaar RA,etal.Clinical application of circulating tumor cells in breast cancer [J]. Cell Oncol (Dordr), 2014, 37: 9- 15.

Application research on stem cell marker and cell tracing

NIU Yan-jun1, LI Ying2, BAI Zhong-tian2, Lü Qing-fang3, YAN Xiang1*

(1.Dept. of Geriatrics; 2.Key Laboratory of Biotherapy and Regenerative Medicine; 3.Dept. of Oncology, the First Hospital of Lanzhou University, Lanzhou 740000, China)

In the basic and clinical researches, the tracing methods and its effects of stem cells is targets have been of the focusing issue. Hence, it’s critical to create innovative and breakthrough methods for stem cell marker and cell tracing, to explore the migration routes and its reciprocity with microenvironment targets in the body, to monitor and track the outcome after stem cell transplantation therapy, it will play a good role in promoting animal experiment and clinical applications.

stem cells marker; cell tracing; migratory pathways

2014- 11- 06

2014- 12- 29

甘肅省科技重大專項(2013GS08977)；甘肅省自然科學研究基金(1208RJZA219)；中央高校自由探索面上項目(lzujbky- 2012- 167)

1001-6325(2015)04-0528-03

R- 331

A

*通信作者(corresponding author)：yanxiang528@suhu.com