王 虎，袁建枚，全嬋娟，楊新懷

(中山市小欖人民醫(yī)院眼科，廣東 中山 528415)

BBG染色兔眼內(nèi)界膜效果分析

王 虎，袁建枚，全嬋娟，楊新懷

(中山市小欖人民醫(yī)院眼科，廣東 中山 528415)

目的 探討不同染色時(shí)間及不同染色劑濃度的亮藍(lán)G(Brilliant blue G，BBG)對(duì)內(nèi)界膜染色的效果差異。方法用12只新西蘭白兔按照隨機(jī)化原則分為四組，行常規(guī)23G玻璃體切割術(shù)，氣液交換后1組給予0.125 mg/ml BBG染色15 s，2組給予0.125 mg/ml BBG染色120 s，3組給予0.25 mg/ml BBG染色15 s，4組給予0.25 mg/ml BBG染色120 s，染色后BSS沖洗干凈，手術(shù)顯微鏡下觀察染色效果。結(jié)果1組完全染色1眼，不完全染色1眼，未見(jiàn)染色4眼；2組完全染色5眼，不完全染色1眼；3組完全染色1眼，不完全染色3眼，未見(jiàn)染色2眼；4組完全染色5眼，不完全染色1眼。染色結(jié)果四組間差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.008)，根據(jù)平均秩次推斷第2組與第4組染色效果好于第3組，第1組染色效果最差。結(jié)論BBG染色兔眼內(nèi)界膜效果與染色時(shí)間相關(guān)，時(shí)間越長(zhǎng)，染色效果越好，與染色劑濃度相關(guān)性不高。

BBG；內(nèi)界膜；兔

Brilliant blue G(以下簡(jiǎn)稱(chēng)BBG)因其特殊的染色效果，很早就應(yīng)用于各種蛋白質(zhì)的染色。Enaida等[1]在其實(shí)驗(yàn)研究中指出，BBG具有良好的染色特性，實(shí)驗(yàn)條件下，它可以在0.25 mg/ml的濃度下10～15 s染色內(nèi)界膜，因此它對(duì)于玻璃體視網(wǎng)膜手術(shù)可能是一種理想的染色材料[2]。

1 材料與方法

1.1 材料 將BBG(德國(guó)Fluoron GmbH)以孔徑0.2 μm的濾器過(guò)濾，一半為0.25 mg/ml的BBG溶液，另一半加以眼內(nèi)灌注液(BSS Alcon Lab)1:1配制成0.125 mg/ml BBG溶液。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康成年新西蘭白兔12只(廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體重1.8～2.2kg，雌雄不限，排除眼部疾患者。隨機(jī)分為四組，每組3只。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 制作動(dòng)物模型 復(fù)方托品酰胺擴(kuò)瞳，苯巴比妥8 mg/kg和氯丙嗪12.5 mg/kg腹腔注射麻醉動(dòng)物，輔以愛(ài)爾凱因滴眼液表面麻醉。行23G標(biāo)準(zhǔn)玻璃體切除術(shù)，切除中軸部位玻璃體后，波切頭吸引人工造成玻璃體后脫離，然后將殘余玻璃體切除干凈，氣液交換將玻璃體腔內(nèi)灌注液置換干凈，分別于兔眼黃斑處滴染色劑，范圍黃斑周?chē)?PD，每組染色相應(yīng)時(shí)間后，玻璃體腔重新灌入眼內(nèi)灌注液，置換染色劑干凈后，手術(shù)顯微鏡最大放大倍率下觀察染色效果。

1.3.2 染色效果 根據(jù)術(shù)中染色范圍內(nèi)，內(nèi)界膜染色的情況，將染色效果分為完全染色(均一淡藍(lán)色)，部分染色(斑駁樣著色)，未見(jiàn)染色(無(wú)明顯可見(jiàn)著色)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。各組染色效果的比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，組間效果通過(guò)秩次(Mean Rank)推斷，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 染色效果 1組6眼完全染色1眼，不完全染色1眼，未見(jiàn)染色4眼；2組完全染色5眼，不完全染色1眼；3組6眼完全染色1眼，不完全染色3眼，未見(jiàn)染色2眼；4組完全染色5眼，不完全染色1眼。染色結(jié)果四組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.784，ν=3，P= 0.008)，根據(jù)平均秩次推斷第2組和第4組染色效果好于第3組，第1組染色效果最差，見(jiàn)表1、圖1。

圖1 染色情況

表1 各組染色效果分析（眼）

2.2 真菌性眼內(nèi)炎 結(jié)果顯示所有實(shí)驗(yàn)眼均未發(fā)生眼內(nèi)炎。

3 討 論

黃斑裂孔(Macular hole)是嚴(yán)重影響視力的眼科疾病之一，早在1880年即為人們所認(rèn)識(shí)[3]，但一直缺乏有效的治療手段，直到Gass發(fā)現(xiàn)黃斑中央凹前的玻璃體切線方向牽拉是特發(fā)性黃斑裂孔形成的主要原因，并將黃斑裂孔分為4期[4]。在黃斑裂孔四個(gè)期的自然病程中，玻璃體后界膜、視網(wǎng)膜前膜、內(nèi)界膜都是切線牽拉力的來(lái)源，OCT的出現(xiàn)為此理論提供了有力的論據(jù)。因此，黃斑裂孔手術(shù)最關(guān)鍵的不是想辦法粘合裂孔，而是從根本上解除切線方向的牽拉。Lam等[5]的實(shí)驗(yàn)研究表明，黃斑裂孔性視網(wǎng)膜脫離患者中，行內(nèi)界膜剝離組的黃斑裂孔閉合率較未行剝離組高，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.013)。

但是，內(nèi)界膜(Internal limiting membrane，ILM)作為視網(wǎng)膜最內(nèi)層，是一層厚度僅約1 μm的無(wú)色透明膜，它由Muller細(xì)胞的基底膜、少量膠質(zhì)細(xì)胞及玻璃體纖維共同組成，手術(shù)中難于辨認(rèn)，難以剝除，強(qiáng)行剝除往往會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜損傷甚至穿孔。Shimada等[6]的研究表明術(shù)中直接剝除內(nèi)界膜，即使是最有經(jīng)驗(yàn)的玻璃體視網(wǎng)膜疾病醫(yī)師，70%左右會(huì)有內(nèi)界膜的殘留。

為了解決內(nèi)界膜透明、無(wú)法直視的狀態(tài)，研究者們先后應(yīng)用臺(tái)盼藍(lán)(Typan blue，TB)、吲哚青綠(Indocyaninegreen，ICG)、溴酚藍(lán)(Bromphenol blue，BPB)、曲安奈德(Triamcinolone acctonide，TA)進(jìn)行內(nèi)界膜染色，但是卻因?yàn)閷?duì)視網(wǎng)膜、視神經(jīng)的毒性，或染色效果不佳而逐漸少應(yīng)用于臨床[7]。

亮藍(lán)，分子式為C47H48N3O7S2Na，顏色指數(shù)為42 655，分子量為854，最早應(yīng)用于蛋白質(zhì)的染色。它的染色特性使它能夠在低濃度的狀態(tài)下快速染色蛋白質(zhì)，而Rodrigues等[8]的研究表明，染色劑的濃度和染色時(shí)間是影響其視網(wǎng)膜毒性的兩大因素。

國(guó)外大量研究均應(yīng)用0.25 mg/ml BBG染色I(xiàn)LM 120 s，作為常規(guī)的染色濃度與染色時(shí)間，先前實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明這是染色達(dá)到較好效果的最佳的染色濃度與時(shí)間。但是我們的研究表明，0.125 mg/ml BBG染色I(xiàn)LM 120 s，可以達(dá)到同樣的染色效果，兩組的染色效果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但是染色濃度的下降，會(huì)進(jìn)一步降低染色劑對(duì)視網(wǎng)膜功能的損害。實(shí)驗(yàn)研究表明，高濃度的BBG可以導(dǎo)致視網(wǎng)膜內(nèi)核層細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變，但未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡，ERG無(wú)明顯下降[9]。

由于國(guó)外有應(yīng)用BBG染色后誘發(fā)真菌性眼內(nèi)炎的報(bào)道，本研究在抽取染色劑時(shí)，應(yīng)用孔徑0.2 μm的濾器過(guò)濾，全部實(shí)驗(yàn)眼未見(jiàn)眼內(nèi)炎改變，而其對(duì)染色效果并無(wú)明顯影響。

Totan等[10]的研究表明，在氣泡下注入相同濃度的染色劑，相同的時(shí)間下，內(nèi)界膜染色效果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此在我們的實(shí)驗(yàn)中，采用氣液交換后再染色的方法，降低了玻璃體腔液體對(duì)染色劑的稀釋作用，從而得到更準(zhǔn)確的結(jié)果。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)不同濃度的BBG對(duì)內(nèi)界膜染色不同時(shí)間，得出染色效果與染色時(shí)間與染色劑濃度相關(guān)性不高的結(jié)論。染色時(shí)間越長(zhǎng)，染色效果越好。在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中，筆者將進(jìn)一步對(duì)BBG對(duì)視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)及功能的影響進(jìn)行研究。

[1]Enaida H,Hisatomi T,Goto Y,et al.Preclinical investigation of internal limiting membrane staining and peeling using intravitreal brilliant blue G[J].Retina,2006,26:623-630.

[2]Enaida H,Hisatomi T,Hata Y,et al.Brilliant blue G selectively stains the internal limiting membrane:brilliant blue G-assisted membrane peeling[J].Retina,2006,26:631-636.

[3]Sjaarda RN.Macular hole[J].Chin Ophthalmol Nor Am,1995,35 (4):105-122.

[4]Gass JD.Idiopathic senile macuar hole:its early stages and pathogenesis[J].Arch Ophthalmol,1988,106(5):629-639.

[5]Lam RF,Lai WW,Cheung BT,et al.Pars plana vitrectomy and perfluoropropane(C3F8)tamponade for retinal detachment due to myopic macular hole:a prognostic factor analysis[J].Am J Ophthalmol,2006,142(6):938-944.

[6]Shimada H,Nakashizuka H,Hattori T,et al.Double staining with brilliant blue G and double peeling for epiretinal membranes[J]. Ophthalmology,2009,116(7):1370-1376.

[7]Schumann RG,Gandorfer A,Priglinger SG,et al.Vital dyes for macular surgery:a comparative electron microscopy study of the internal limiting membrane[J].Retina,2009,29(5):669-676.

[8]Rodrigues EB,Meyer CH,Mennel S,et al.Mechanisms of intravitreal toxicity of indocyanine green dye:implications for chromovitrectomy[J].Retina,2007,27(7):958-970.

[9]Lüke M,Januschowski K,Beutel J,et al.Electrophysiological effects of brilliant b lue G in the modle of the isolated perfused vertebrate retina[J].Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol,2008,246(6): 817-822.

[10]Totan Y,Güler E,Güra?a? FB,et al.Brilliant blue G assisted macular surgery:the effect of air infusion on contrast recognisability in internal limiting membrane peeling[J].Br J Ophthalmol,2015,99 (1):75-80.

Dyeing effect of brilliant blue G on internal limiting membrane in rabbits.

WANG Hu,YUAN Jian-mei,QUAN Chan-juan,YANG Xin-huai.Department of Ophthalmology,Xiaolan People's Hospital of Zhongshan,Zhongshan 528415,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo analyze the dyeing effect of brilliant blue G(BBG)on internal limiting membrane (ILM)at different time and different concentration.MethodsConventional 23-G pars plana vitrectomy was performed in the eyes of 12 New Zealand white rabbits and the experiment eyes were randomized into four groups.After Gas-fluid exchanged,four groups were given different concentrations of BBG solution to dye the ILM for different time:group 1(0.125 mg/ml BBG for 15 s);group 2(0.125 mg/ml BBG for 120 s);group 3(0.125 mg/ml BBG for 15 s); group 4(0.125 mg/ml BBG for 120 s).Then BBG was cleaned up by BSS.The results were observed by the operation microscope.ResultsGroup 1:complete dyeing 1 eye;incomplete dyeing 1 eye;not dyeing 4 eyes.Group 2:complete dyeing 5 eyes;incomplete dyeing 1 eye;not dyeing 0 eyes.Group 3:complete dyeing 1 eye;incomplete dyeing 3 eyes;not dyeing 2 eyes.Group 4:complete dyeing 5 eyes;incomplete dyeing 1 eye;not dyeing 0 eyes. The dyeing effect of four groups had statistically significant differences(P=0.008).Based on the average rank inference,the second and the forth group were better than the third group,and dyeing effect of the first group was the worst.ConclusionThe dye effect is correlated with the dyeing time and the concentration is not as important as it.

Brilliant blue G(BBG);Internal limiting membrane(ILM);Rabbits

R-332

A

1003—6350（2015）04—0478—03

2014-09-11)

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.04.0175

廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金（編號(hào)：A829）

王 虎。E-mail：wh20005@163.com