趙曉靜，王萍，李秀璋，古麗君，李春杰(草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅蘭州730020)

前植物生產(chǎn)層

內(nèi)生真菌在禾草體內(nèi)的分布特征

趙曉靜，王萍，李秀璋，古麗君，李春杰
(草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅蘭州730020)

以醉馬草(Achnatherum inebrians)、中華羊茅(Festuca sinensis)、野大麥(Hordeum brevisubulatum)及披堿草(Elymus dahuricus)為研究材料，通過光學(xué)顯微鏡和透射電子顯微鏡對植株莖節(jié)間、葉鞘、葉片及種子進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)Epichloё內(nèi)生真菌普遍存在于莖節(jié)間、葉鞘、葉片及種子中。菌絲體在4種禾草體內(nèi)分布特點較為相似，莖節(jié)間菌絲體分布密集，葉鞘次之，葉片中則分布較為稀疏，均沿細(xì)胞伸長方向縱向生長，呈直線或彎曲狀，細(xì)長無分支;對種子的觀察發(fā)現(xiàn)，除在醉馬草糊粉層內(nèi)很難觀察到菌絲體外，Epichloё內(nèi)生真菌普遍存在于中華羊茅、野大麥及披堿草的糊粉層中，4種禾草的種皮及胚中均明顯的觀察到了菌絲體的存在。

醉馬草;中華羊茅;野大麥;披堿草;菌絲體

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醉馬草(Achnatherum inebrians)為禾本科芨芨草屬多年生草本植物，多生長于高海拔半干旱及干旱天然草地，主要分布在內(nèi)蒙古、寧夏、甘肅、青海、新疆、四川等省(區(qū))，是我國北方天然草原上主要的烈性毒草之一。醉馬草生命力和繁殖力極強(qiáng)，有超強(qiáng)的耐旱力，能夠在土壤貧瘠等條件惡劣的地區(qū)生長，起到保持水土、防風(fēng)固沙的作用［1］。中華羊茅(Festuca sinensis)為禾本科羊茅屬多年生疏叢型草本植物，是我國西北、華北、東北和青藏高原等地的常見優(yōu)良牧草，具有較強(qiáng)的耐寒性。中華羊茅耐放牧，可刈割，莖葉柔嫩，營養(yǎng)豐富，適口性好，是高寒牧區(qū)草地生產(chǎn)建設(shè)的優(yōu)良栽培牧草［2］。野大麥(Hordeum brevisubulatum)屬多年生草本，分布于我國東北、華北及新疆等地低濕草地上，表現(xiàn)為生長期短、適口性好、耐鹽堿［3］、草質(zhì)柔軟、生產(chǎn)性能良好［4］，是一種良好的放牧―刈割兼用的多年生禾本科牧草。披堿草(Elymus dahuricus)為禾本科披堿草屬多年生草本植物，廣泛分布在我國東北、內(nèi)蒙古、河北、陜西、甘肅、寧夏、青海等省(區(qū))。是一種抗寒、抗旱性強(qiáng)并且經(jīng)濟(jì)價值較高的優(yōu)良牧草［5］。

禾草內(nèi)生真菌(Endophyte)是指在禾草中渡過全部或大部分生命周期，而在禾草上不表現(xiàn)癥狀的一類真菌［6］。主要存在于禾草植物的葉鞘、種子、花序、莖稈、葉片和根等中，但不侵入植物細(xì)胞中［7-8］。禾草內(nèi)生真菌具有一定的組織專一性，即菌絲體只存在于植株的一定部位，并且在不同部位的菌絲體的形狀也有一定差異［9］。在禾草的營養(yǎng)器官中，存在于近地面的莖基部的分生組織中的菌絲體密度最高，然后是葉鞘［6］，而葉片和根中的含量極少;在禾草的生殖器官中，種子中的內(nèi)生真菌菌絲體密度最高［10］，主要分布在糊粉層中。在莖稈中，菌絲多存在于中心的髓質(zhì)中;葉鞘中，則多存在于氣腔或維管束;葉片中，菌絲體多存在于葉肉組織中。菌絲體分布于細(xì)胞間隙，沿葉脈平行排列，分生組織和幼嫩部分的菌絲密度高于成熟組織，隨著組織的逐漸成熟，菌絲的密度明顯減小［11］。部分內(nèi)生真菌在不同株齡和組織上的分布和豐度明顯不同，有的內(nèi)生真菌的種類在每種禾草或每個部位分離機(jī)率較高，有的可能是該植株或該組織的專性內(nèi)生真菌。如:在高羊茅(Festuca elata)和多年生黑麥草(Lolium perenne)種子中，內(nèi)生真菌大多存在于種子的糊粉層中［12］;而醉馬草種子的內(nèi)生真菌主要集中在種子的內(nèi)表皮下，糊粉層中極少［13］。

目前，國內(nèi)外有關(guān)禾草內(nèi)生真菌的顯微觀察研究主要有3種:光學(xué)顯微鏡法、電子顯微鏡法和共聚焦顯微法［14-15］。目前相關(guān)研究方法主要集中在利用光學(xué)顯微鏡法［16-17］，通過在不同放大倍數(shù)下對菌絲體的形狀、大小以及菌絲體與植物細(xì)胞的分布情況進(jìn)行觀察，說明內(nèi)生真菌與植物之間的密切關(guān)系。本研究以醉馬草、中華羊茅、野大麥、披堿草為試驗材料，通過對不同禾草體內(nèi)不同部位Epichloё內(nèi)生真菌菌絲的檢測及形態(tài)特征觀察，明確Epichloё內(nèi)生真菌的分布特征。由于根中內(nèi)生真菌含量甚微，因此未對4種禾草的根進(jìn)行顯微觀察。本研究首次采用透射電子顯微鏡對禾草體內(nèi)的內(nèi)生真菌分布情況進(jìn)行觀察研究，為光鏡下植物地上部分和種子中菌絲體的形態(tài)以及分布情況做以補(bǔ)充。

1　材料與方法

1.1試驗材料

醉馬草和中華羊茅的樣品于2010年9月采自甘肅省夏河縣?？撇菰?98°23' E，34°23' N，海拔3 000 m)，野大麥樣品于2010年9月采自甘肅省河西走廊的蘭州大學(xué)臨澤試驗站(100°06' 04″E，39°11'07″N，海拔1 783 m)，披堿草樣品于2010年9月采自甘肅省蘭州市榆中縣牡丹園(103°58'557″E，35°59'028″N，海拔2 000 m)。參照李春杰等［18］的方法檢測內(nèi)生真菌，2011年收集帶菌種子，置于5℃下保存?zhèn)溆谩７謩e將醉馬草、中華羊茅、野大麥、披堿草帶菌種子播種于裝有相同質(zhì)量滅菌土壤的花盆中，在溫室20℃下生長8周左右得到成株。將帶菌的醉馬草、中華羊茅、野大麥、披堿草的種子和植株的葉鞘、葉片和莖髓，參照李春杰等［18］的方法進(jìn)行檢測，進(jìn)一步驗證種子和植株攜帶內(nèi)生真菌的情況。

1.2試驗方法

1.2.1光學(xué)顯微鏡法取帶菌醉馬草、中華羊茅、野大麥和披堿草待檢驗的飽滿種子各50粒置于培養(yǎng)皿中，5%NaOH+1%苯胺藍(lán)浸泡過夜，用自來水沖洗3次。加人0.8%的乳酚油苯胺藍(lán)溶液于玻璃試管，在水浴中沸煮20 min，以保證其充分染色，再用自來水沖洗3次。每次取1粒種子置于載玻片上，用解剖針移去穎片，用蓋玻片輕輕擠壓蓋于上面，輕輕壓扁，使組織分散開，用吸水紙吸去多余的染液，在Olympus B2型生物顯微鏡(10X×40X)下分別觀察4種草的E+種皮和糊粉層內(nèi)內(nèi)生真菌菌絲體的形態(tài)，并拍照。分別取帶菌醉馬草、中華羊茅、野大麥和披堿草的葉鞘、莖髓、葉片，用開水煮沸5 min，用解剖刀刮取表皮組織于載玻片上，輕壓，用0.8%的乳酸苯胺藍(lán)溶液染色［18］，置于生物顯微鏡下觀察內(nèi)生真菌菌絲體。

1.2.2透射電子顯微鏡法各取帶菌的醉馬草、中華羊茅、野大麥、披堿草少粒的新鮮種子，置于盛有3%戊二醛固定液(以浸沒種子為宜)的離心管中。制作種子樹脂超薄切片，置于JEM-1230型透射電子顯微鏡下觀察種皮以及糊粉層中內(nèi)生真菌菌絲體。分別取帶菌醉馬草、中華羊茅、野大麥和披堿草的葉鞘、莖髓、葉片(0.5 cm×0.5 cm大小)，置于盛有3%的戊二醛固定液(以浸沒植物組織為宜)的離心管中。制作植物組織樹脂超薄切片，在透射電子顯微鏡下觀察四種禾草的葉鞘、莖髓、葉片中內(nèi)生真菌分布的微觀特征。

2　結(jié)果與分析

2.1光鏡下禾草體內(nèi)菌絲體分布情況

從醉馬草、中華羊茅、野大麥和披堿草的帶菌種子中檢測到典型的Epichloё禾草內(nèi)生真菌菌絲體。醉馬草、中華羊茅、野大麥和披堿草的種子內(nèi)表皮中均可觀察到內(nèi)生真菌菌絲體，其中醉馬草種皮中菌絲體數(shù)量較多，特征比較明顯(圖1)。種皮中菌絲體呈線型不規(guī)則分布，分布比較密集，平行或網(wǎng)狀排列，菌絲體分枝極少。中華羊茅和野大麥的糊粉層淀粉粒間隙存在較多的菌絲體，菌絲體粗短，高度彎曲，粗細(xì)均勻，圍繞著淀粉粒分布，分叉少，有隔膜;披堿草種子的糊粉層中只有少數(shù)的菌絲體存在(圖1)。醉馬草種子的糊粉層中未發(fā)現(xiàn)菌絲體的存在。

對醉馬草、中華羊茅、野大麥和披堿草種子的胚進(jìn)行分離染色，在組織的間隙觀察到了菌絲體(圖2)。內(nèi)生真菌菌絲體主要存在于帶菌醉馬草、中華羊茅、野大麥、中華羊茅的莖節(jié)、葉鞘、葉片中。內(nèi)生真菌菌絲體在莖節(jié)間的分布比較密集，而在葉片中則分布比較稀疏。相比莖節(jié)、葉鞘和葉片中的內(nèi)生真菌菌絲體，種子內(nèi)表皮和糊粉層中的菌絲體較為細(xì)長。莖節(jié)中菌絲沿著細(xì)胞延伸方向縱向生長，呈不規(guī)則排列，菌絲細(xì)長，單行，粗細(xì)均勻，菌絲微帶彎曲，分布密集，菌絲分叉較少(圖2) ;葉鞘中的菌絲體沿葉脈平行排列，縱向伸長生長，菌絲比較彎曲，菌絲多數(shù)不分叉(圖3) ;葉片中的菌絲體比較稀疏，延海綿組織細(xì)胞的延伸方向縱向生長，菌絲彎曲度小，多分布于氣孔附近，菌絲體分叉相對較少(圖3)。

2.2透射電子顯微鏡下禾草體內(nèi)菌絲體分布情況

在透射電子顯微鏡下觀察帶菌醉馬草、中華羊茅、野大麥和披堿草種子的超薄樹脂切片:內(nèi)生真菌菌絲體多存在于種子的種皮，菌絲體多呈圓形或橢圓形(圖4)。在醉馬草種子的種皮中觀察到的菌絲體多分布在種皮細(xì)胞附近;中華羊茅種子種皮中分布的菌絲體數(shù)量較多，種皮和糊粉層的交界處有少許菌絲體;野大麥種子種皮中分布的內(nèi)生真菌菌絲體，大多分布在種皮細(xì)胞的間隙;披堿草種子種皮中的內(nèi)生真菌分布則存在于種皮細(xì)胞間隙，緊挨細(xì)胞壁呈橢圓形。

在透射電子顯微鏡下觀察帶菌醉馬草、中華羊茅、野大麥和披堿草的莖稈、葉鞘和葉片的超薄樹脂切片。莖髓中的莖組織細(xì)胞排列比較緊密，菌絲體主要存在于莖組織細(xì)胞的間隙(圖5A、D、G、J)，其中醉馬草莖節(jié)間維管束附近也能發(fā)現(xiàn)少量菌絲體(圖5A)，菌絲體呈圓形或橢圓形;葉鞘中的菌絲體多分布在厚壁細(xì)胞附近呈圓形(圖5B、E、H、K)或楔形(圖5E) ;葉片中菌絲體所分布于葉肉細(xì)胞間隙(圖5C、F、I、L)呈圓形或橢圓形。

圖1　光學(xué)顯微鏡下Epichloё內(nèi)生真菌在醉馬草、中華羊茅、野大麥和披堿草種皮和糊粉層上的分布特征Fig.1 The characteristics of Epichloё endophytes distributed in the seed coat and aleurone layer of E+A.inebrians，F(xiàn).sinensis，H.brevisubulatum and E.dahuricus under an optical microscope

圖2　光學(xué)顯微鏡下Epichloё內(nèi)生真菌在醉馬草、中華羊茅、野大麥和披堿草種子胚中和莖節(jié)間的分布特征Fig.2 The characteristics of Epichloё endophytes distributed in the embryos and stem of A.inebrians，F(xiàn).sinensis，H.brevisubulatum and E.dahuricus under an optical microscope

圖3　光學(xué)顯微鏡下Epichloё內(nèi)生真菌在醉馬草、中華羊茅、野大麥和披堿草葉鞘和葉片的分布特征Fig.3 The characteristics of Epichloё endophytes distributed in the leaf sheath and blade of E+ A.inebrians，F(xiàn).sinensis，H.brevisubulatum and E.dahuricus under an optical microscope

圖4　透射電子顯微鏡下Epichloё內(nèi)生真菌在醉馬草、中華羊茅、野大麥和披堿草種皮上的分布特征Fig.4 The characteristics of Epichloё endophytes distributed in the seed coat of E+ A.inebrians，F(xiàn).sinensis，H.brevisubulatum and E.dahuricus under a transmission electron microscope

3　討論與結(jié)論

李春杰等［17］對醉馬草種子和植株的內(nèi)生真菌檢測方法主要有莖髓檢測法、種子檢測法、葉鞘檢測法和熒光檢測法，其中莖髓檢測法是一種比較簡便、快速、準(zhǔn)確的內(nèi)生真菌檢測方法。本試驗采用種子檢測法、莖髓檢測法和葉鞘檢測法對醉馬草、中華羊茅、野大麥和披堿草的種子、新鮮莖髓和葉鞘進(jìn)行苯胺藍(lán)染色并檢測，在光學(xué)顯微鏡下可明顯觀察到種皮、糊粉層、莖節(jié)及葉鞘中內(nèi)生真菌菌絲體的分布情況(圖1，2)，對于葉片的檢測，則是通過先在沸水中沸煮5 min后再以撕取葉片薄片進(jìn)行苯胺藍(lán)染色檢測。

本研究表明，醉馬草、中華羊茅、野大麥和披堿草的內(nèi)生真菌菌絲體主要分布于莖節(jié)、葉鞘、葉片和種子等組織中。與其他研究結(jié)果相類似，禾草內(nèi)生真菌菌絲體主要分布在禾草莖稈、葉鞘、葉片及種子中［6，19］。對禾草的莖稈、葉鞘和葉片進(jìn)行檢測，可觀察到內(nèi)生真菌菌絲體明顯的分布特征。禾草內(nèi)生真菌具有一定的組織專一性，即菌絲體只存在于植株的某一特定部位。在禾草的營養(yǎng)器官中，以近地面的莖基部分生組織中的菌絲體密度最高，其次為葉鞘，而葉片中的內(nèi)生真菌則較低。禾草植株不同部位的菌絲體形態(tài)也有差異［9］，醉馬草、中華羊茅、野大麥和披堿草莖節(jié)、葉鞘和葉片中內(nèi)生真菌菌絲體比種子內(nèi)表皮和糊粉層中粗短。菌絲體多分布于細(xì)胞間隙，分生組織及植株幼嫩部位的菌絲密度顯著高于成熟組織，隨著植物組織趨于成熟，菌絲體的密度逐漸降低［19］。本試驗對4種禾草的莖節(jié)、葉鞘和葉片進(jìn)行了內(nèi)生真菌的檢測，本研究結(jié)果與之相一致。

圖5　透射電子顯微鏡下Epichloё內(nèi)生真菌在莖節(jié)間、葉鞘、葉片上的分布特征Fig.5 The characteristics of Epichloё endophytes distributed in internodal region of stems，sheaths and blades under a transmission electron microscope

Christensen等［15］對多年生黑麥草和高羊茅內(nèi)生真菌的顯微研究發(fā)現(xiàn)，Epichloё屬的內(nèi)生真菌菌絲體在黑麥草葉鞘中與縱向葉軸平行，在葉片中分布于葉肉細(xì)胞間隙，透射電子顯微鏡下菌絲體與宿主細(xì)胞緊密地連在一起，菌絲體有橢圓形的、楔形的或者拉伸的，有的甚至被宿主細(xì)胞細(xì)胞壁擠壓而扭曲，菌絲體粗細(xì)均勻，微彎曲，少分叉，有隔膜，且菌絲體未穿透細(xì)胞。本研究關(guān)于醉馬草、中華羊茅、野大麥和披堿草的顯微研究得到了與其一致的結(jié)果。高羊茅葉鞘中的內(nèi)生真菌菌絲體分布在維管束韌皮部組織中，葉片中菌絲體則分布在葉肉細(xì)胞的間隙［20］。本研究中禾草莖髓中的內(nèi)生真菌菌絲體分布于排列緊密的莖組織細(xì)胞的間隙，呈不規(guī)則排列，菌絲體細(xì)長，粗細(xì)均勻，微帶彎曲，分布密集，很少分叉;與高羊茅不同，葉鞘中的內(nèi)生真菌菌絲體分布在厚壁細(xì)胞和氣孔以及維管束的附近，菌絲體比較彎曲，多數(shù)不分叉，且維管束中未發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌;葉片中的菌絲體則分布在葉肉細(xì)胞的間隙，比較稀疏。

在對禾草種子內(nèi)分布的內(nèi)生真菌檢測中發(fā)現(xiàn)，醉馬草、中華羊茅、野大麥和披堿草種子的種皮內(nèi)表皮帶菌率較高，菌絲多分布于細(xì)胞間隙，分布較為密集，菌絲體呈線型不規(guī)則分布，平行或網(wǎng)狀排列，菌絲體分枝極少。中華羊茅和野大麥種子的糊粉層中也分布著較多的內(nèi)生真菌菌絲體，菌絲圍繞著淀粉粒分布，高度彎曲，分叉少，直徑均勻。部分內(nèi)生真菌的種類在某種禾草或某個部位分離機(jī)率較高，有些可能是該植株或該組織的專性內(nèi)生真菌。李春杰等［18］對醉馬草內(nèi)生真菌的檢測觀察發(fā)現(xiàn)，醉馬草內(nèi)生真菌菌絲體主要分布于種子內(nèi)表皮下，僅有少數(shù)的菌絲體分布于種子的糊粉層中。這一特點明顯不同于內(nèi)生真菌菌絲體在其他禾本科植物種子中的分布，如，高羊茅和多年生黑麥草，大多數(shù)內(nèi)生真菌菌絲體位于種子的糊粉層［12，21］。本研究在醉馬草的糊粉層中沒有發(fā)現(xiàn)菌絲體，卻在種子的胚中發(fā)現(xiàn)了菌絲體的存在(圖2)，相關(guān)原因有待進(jìn)一步研究。在對禾草內(nèi)生真菌傳播的研究中發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)內(nèi)生真菌是以種子垂直傳播為主［12］，他們的菌絲能夠穿透種子早期的胚胎，形成系統(tǒng)性侵染的種子。同時，內(nèi)生真菌也可以通過禾草葉片表面產(chǎn)生分生孢子而進(jìn)行橫向傳播［22］。在種子萌發(fā)的過程中，胚芽的頂端分生組織細(xì)胞間的菌絲停止休眠，延伸到葉原基、腋芽以及生長成嫩枝的分生組織細(xì)胞［23］。頂端分生組織膨脹，菌絲進(jìn)入葉片，當(dāng)葉片成熟停止生長后，菌絲也不再延伸［8，24］。因此醉馬草通過種子胚中的菌絲體傳播的具體過程還有待進(jìn)一步研究確定。

本研究采用光學(xué)顯微鏡和透射電子顯微鏡對醉馬草、中華羊茅、野大麥和披堿草種子以及莖節(jié)、葉鞘、葉片中分布的內(nèi)生真菌進(jìn)行了檢測，通過透射電子顯微鏡進(jìn)一步驗證了在光學(xué)顯微鏡下菌絲體普遍存在于4種禾草的地上部分以及種子內(nèi)的分布情況。在光學(xué)顯微鏡下，中華羊茅、野大麥和披堿草種子的糊粉層中能夠觀察到菌絲體的存在，但在醉馬草種子糊粉層中卻很難發(fā)現(xiàn)菌絲體，而在種子的胚中卻發(fā)現(xiàn)了菌絲體的存在，進(jìn)一步為內(nèi)生真菌通過種子進(jìn)行垂直傳播提供了依據(jù)。

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(責(zé)任編輯王芳)

Distribution characteristics of Epichloё endophyte in gramineous grasses

ZHAO Xiao-jing，WANG Ping，LI Xiu-zhang，GU Li-jun，LI Chun-jie
(State Key Laboratory of Grassland Agro-ecosystems; College of Pastoral Agriculture Science and Technology，Lanzhou University，Lanzhou 730020，China)

In the present study，the internodal region of stems，sheaths，blades and seeds of four different species including Achnatheru inebrians，F(xiàn)estuca sinensis，Hordeum brevisubulatum and Elymus dahuricus were observed by the light microscopy and transmission electron microscopy.The results showed that Epichloё endophyte distributed in all these four tested tissues in each species.The endophyte distribution characteristics in these 4 different species were similar，which included hyphae densely distribution in the internodal region of stems and followed by sheaths whereas sparse distribution in blades.The hyphae were straight or curved and long，thin and unbranched and longitudinally growth in the cell extension direction.In the seeds，Epichloё endophyte hyphae were widely distributed in the aleurone layers of F.sinensis，H.brevisubulatum and E.dahuricus，however，it was sparely distributed in the aleurone layers of A.inebrians.Epichloё endophyte hyphae were also observed in the seed coats and embryos of these four gramineous grasses.

Achnatherum inebrians; Festuca sinensis; Hordeum brevisubulatum; Elymus dahuricus; hyphae

LI Chun-jie E-mail: chunjie@lzu.edu.cn

S543; Q949.32

A

1001-0629(2015) 08-1206-10*

10.11829j.issn.1001-0629.2014-0393

2014-08-25接受日期: 2014-10-27

國家“973”項目(2014CB138702) ;國家自然科學(xué)基金項目(31372366) ;教育部創(chuàng)新團(tuán)隊發(fā)展計劃項目(IRT13019) ;中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項資金(861615)

趙曉靜(1990-)，女，河北衡水人，在讀碩士生，研究方向為禾草內(nèi)生真菌共生體。E-mail: zhaoxj08@lzu.cn

李春杰(1968-)，男，甘肅鎮(zhèn)原人，教授，博導(dǎo)，博士，研究方向為禾草內(nèi)生真菌共生體和草類植物病理學(xué)。E-mail: chunjie@lzu.edu.cn