全瑞蘭，玉永雄

(1．西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，重慶 400716；2．信陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南 信陽 464000)

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淹水對(duì)紫花苜蓿南北方品種抗氧化酶和無氧呼吸酶的影響

全瑞蘭1，2，玉永雄1*

(1．西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，重慶 400716；2．信陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南 信陽 464000)

以紫花苜蓿南方育成品種渝苜1號(hào)和北方地方品種新疆紫泥泉為材料，在幼苗長(zhǎng)出4片真葉時(shí)進(jìn)行淹水處理，在淹水的第10天測(cè)定植株的生物量，并分別在淹水的第0，2，4，6，8，10天測(cè)定葉片中的丙二醛(MDA)含量以及葉片抗氧化酶和根系無氧呼吸酶的活性，以探明兩個(gè)品種對(duì)淹水脅迫的耐受性差異及其生理響應(yīng)機(jī)制。結(jié)果表明，淹水脅迫使紫花苜蓿的生物量減少，但與新疆紫泥泉相比，渝苜1號(hào)生物量的降幅小。淹水時(shí)渝苜1號(hào)葉片超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)等抗氧化酶活性比新疆紫泥泉的高，而葉片MDA含量比新疆紫泥泉的低；根系無氧呼吸酶活性在淹水脅迫中均增強(qiáng)，但渝苜1號(hào)的乙醇脫氫酶(ADH)和丙酮酸脫羧酶(PDC)活性增加明顯，乙醇發(fā)酵更強(qiáng)；而新疆紫泥泉的乳酸脫氫酶(LDH)的活性增加更為突出，乳酸發(fā)酵強(qiáng)。淹水影響紫花苜蓿正常生長(zhǎng)，但南方品種渝苜1號(hào)比北方品種新疆紫泥泉對(duì)淹水脅迫更具耐受性，因?yàn)榍罢呔哂斜容^高的抗氧化酶活性和比較強(qiáng)的乙醇發(fā)酵途徑，有利于增強(qiáng)植株抗淹水脅迫能力。

淹水脅迫；紫花苜蓿；品種；抗氧化酶；無氧呼吸酶

紫花苜蓿生態(tài)適應(yīng)性廣，營(yíng)養(yǎng)十分豐富，素有“牧草之王”的美譽(yù)，從西域傳入我國(guó)至今已有2000多年的栽培歷史，現(xiàn)在主要分布在華北、西北地區(qū)[1-2]。近年來，我國(guó)南方畜牧業(yè)快速發(fā)展，對(duì)優(yōu)質(zhì)豆科牧草的需求也越來越大[3]。而南方地區(qū)的多雨氣候條件造成土壤容易漬水，影響到紫花苜蓿的正常生長(zhǎng)和發(fā)育[4]。渝苜1號(hào)紫花苜蓿是我國(guó)南方地區(qū)第一個(gè)紫花苜蓿育成品種，該品種在弱酸性、中性或堿性砂壤土上生長(zhǎng)良好，在耐濕、耐熱、直立性、再生力、持久性等方面表現(xiàn)良好，雜草危害也相對(duì)較小。隨著紫花苜蓿南方品種渝苜1號(hào)的育成與推廣，將有利于解決南方地區(qū)優(yōu)質(zhì)豆科牧草不足的問題。淹水使植株根系周圍形成嫌氣環(huán)境，嚴(yán)重限制了植物的生長(zhǎng)和產(chǎn)量[5-7]。濕澇脅迫引起細(xì)胞產(chǎn)生自由基，破壞細(xì)胞膜系統(tǒng)，造成離子滲漏和細(xì)胞死亡，高水平的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)活性對(duì)長(zhǎng)時(shí)間淹水時(shí)多種植物的存活具有重要作用[8-9]。淹水條件下，植物根系缺氧，無氧呼吸增強(qiáng)，乙醇脫氫酶(ADH)、丙酮酸脫羧酶(PDC)和乳酸脫氫酶(LDH)活性增加，增強(qiáng)植株根系對(duì)缺氧環(huán)境的適應(yīng)性[10-12]。目前，紫花苜蓿耐濕性的研究報(bào)道較少，關(guān)于紫花苜蓿耐濕機(jī)理的研究比較缺乏。本研究以耐旱能力很強(qiáng)的我國(guó)新疆維吾爾自治區(qū)的地方品種新疆紫泥泉作為參照，以抗氧化酶和無氧呼吸酶活性變化為切入點(diǎn)，分析紫花苜蓿南方育成品種渝苜1號(hào)對(duì)淹水脅迫的耐受性及其生理響應(yīng)機(jī)制，為紫花苜蓿耐濕性的后續(xù)研究及解決紫花苜蓿在南方的推廣利用提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以在南方濕熱地區(qū)(重慶)育成的紫花苜蓿品種渝苜1號(hào)(Yumu No.1)和北方干旱地區(qū)地方品種新疆紫泥泉(Xinjiangziniquan)為試驗(yàn)材料。渝苜1號(hào)種子是西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院牧草研究室委托在新疆庫爾勒繁育的種子，新疆紫泥泉種子由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院曹致中老師提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與淹水處理

試驗(yàn)在西南大學(xué)牧草實(shí)驗(yàn)室的玻璃溫室內(nèi)進(jìn)行。種子經(jīng)消毒、催芽后，于露白時(shí)播于直徑為16 cm的裝有河沙的聚乙烯花盆中，每個(gè)花盆定苗10株，放入溫室培養(yǎng)。從真葉開始長(zhǎng)出時(shí)，每3 d澆灌1次1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，中間澆1次清水。待幼苗長(zhǎng)出4片真葉時(shí)進(jìn)行淹水處理，將花盆放入40 cm×30 cm×30 cm的裝滿自來水的玻璃缸內(nèi)，保持水面高于河沙表面1 cm。未進(jìn)行淹水處理的為對(duì)照。1個(gè)花盆1個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

處理0，2，4，6，8，10 d時(shí)，分別取各個(gè)處理的葉片和根系進(jìn)行酶活性的測(cè)定；并于處理10 d時(shí)測(cè)定植株的生物量。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與測(cè)定方法

1.3.1 鮮重、根冠比的測(cè)定 淹水10 d后，將生物量測(cè)定的材料，用水輕輕沖洗花盆中的河沙，將幼苗從花盆中完整取出并洗凈，用濾紙吸干表面的水分后用天平稱取花盆中所有植株的鮮重，然后將植株的地上和地下部分分開并稱重，計(jì)算根冠比及相對(duì)抑制率。

根冠比=植株根系鮮重(g)/植株地上部分鮮重(g)

相對(duì)抑制率=(1-處理組/對(duì)照組)×100%

1.3.2 MDA含量的測(cè)定 用TCA-TBA法[13]。取新鮮葉片0.2 g置于研缽中，加5%(W/V)三氯乙酸(TCA) 5 mL研磨，研磨后12000 r/min離心10 min，取上清液2 mL，加入用10%TCA配制成的0.67%(W/V)2-硫代巴比妥酸(TBA)溶液2 mL，混合液100℃水浴煮沸30 min后在冰上迅速冷卻，冷卻后12000 r/min離心10 min，取上清液分別測(cè)定其在450，532和600 nm處的吸光值。MDA濃度(C,μmol/L)=6.45(A532-A600)-0.56A450。式中，C為MDA濃度，A450、A532、A600分別代表450，532和600 nm波長(zhǎng)下的吸光值。樣品MDA含量用nmol/g FW(鮮重)表示。MDA含量(nmol/g)=MDA濃度(C,μmol/L)×提取液總體積(0.005 L)×稀釋倍數(shù)(2)÷質(zhì)量(0.2 g)×103。

1.3.3 SOD、POD和CAT活性的測(cè)定 參照Wang等[14]的方法提取酶液。分別稱取淹水處理和相應(yīng)對(duì)照的葉片0.3 g放于研缽中，加入1.5 mL蛋白提取液[內(nèi)含100 mmol/L 磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)(pH 7.5)、1 mmol/L EDTA和1%(W/V)聚乙烯吡咯烷酮]，在冰上將葉片研磨成勻漿，又在4℃，12000 r/min離心20 min，上清液即是粗酶液，取上清液轉(zhuǎn)入1.5 mL EP管中，用于酶活性的測(cè)定。SOD活性測(cè)定用NBT法[13], 以抑制氮藍(lán)四唑(NBT)光還原50%為1個(gè)酶活性單位(U)。POD活性測(cè)定用愈創(chuàng)木酚法[13]，以O(shè)D470每min增加0.1為1個(gè)酶活性單位(U)。CAT活性測(cè)定參照Yang等[15]的方法, 以O(shè)D240每min減少0.1為1個(gè)酶活性單位(U)。每個(gè)酶活性測(cè)定重復(fù)3次，酶活性以U/g FW(鮮重)表示。

1.3.4 乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)、丙酮酸脫羧酶(pyruvate decarboxylase, PDC)和乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase, ADH)活性的測(cè)定 參照Mustroph和Albrecht[10]的方法提取酶液。分別稱取淹水處理和相應(yīng)對(duì)照的根0.5 g于研缽中，加入1.5 mL預(yù)冷的提取液(內(nèi)含50 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L MgCl2、5 mmol/L β-巰基乙醇、15%甘油、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L EGTA和0.1 mmol/L 苯甲基磺酰氟，pH 6.8)，冰浴研磨成勻漿，4℃，12000 r/min離心20 min，上清液即是粗酶液，取上清液轉(zhuǎn)入1.5 mL EP管中，用于酶活性的測(cè)定。乳酸脫氫酶(LDH)活性測(cè)定參照Wang等[16]的方法，乙醇脫氫酶(ADH)和丙酮酸脫羧酶(PDC)活性測(cè)定參照Li等[17]的方法，蛋白質(zhì)含量測(cè)定參照Bradford[18]的考馬斯亮蘭G250法。以O(shè)D340每min底物減少1 μmol為1個(gè)酶活性單位(U)，酶活性以U/g蛋白表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 13.0，Duncan多重比較法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Excel作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 淹水脅迫對(duì)紫花苜蓿幼苗生長(zhǎng)的影響

對(duì)淹水脅迫第10天的幼苗生物量測(cè)定結(jié)果表明，2個(gè)苜蓿品種的鮮重、根冠比均顯著低于對(duì)照(表1)。渝苜1號(hào)生長(zhǎng)受抑制程度明顯低于新疆紫泥泉。淹水脅迫下，渝苜1號(hào)植株的鮮重和根冠比為對(duì)照的68.7%和53.4%，而新疆紫泥泉僅為對(duì)照的62.7%和44.1%；淹水對(duì)渝苜1號(hào)鮮重和根冠比的相對(duì)抑制率分別為31.2%和46.6%，明顯低于新疆紫泥泉的37.2%和56.0%(表1)，表明淹水對(duì)渝苜1號(hào)的影響較新疆紫泥泉小，渝苜1號(hào)比新疆紫泥泉具有更強(qiáng)的淹水耐受性。

表1 淹水第10天對(duì)紫花苜蓿幼苗生長(zhǎng)量的影響

表中數(shù)據(jù)表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，不同大寫字母表示同一品種對(duì)照和處理間差異顯著(P<0.05)，同列不同小寫字母表示同一測(cè)定項(xiàng)目不同品種間差異顯著(P<0.05)。

The data in the Table were expressed as Mean±SD, different capital letter means significant difference at 0.05 level between control and waterlogging test in the same vatiety, different small letters in a line mean significant differences at 0.05 level between different varieties under the same test.

2.2 淹水脅迫對(duì)葉片MDA含量的影響

圖1 淹水對(duì)紫花苜蓿幼苗葉片MDA含量的影響Fig.1 Effect of waterlogging on MDA content in the leaves of alfalfa seedlingsT：淹水Waterlogging；CK：對(duì)照Control； *和**：分別表示淹水條件下兩個(gè)品種間差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)。下同。*and**mean the significant differences at 0.05 and 0.01 level, respectively. The same below.

淹水脅迫下葉片MDA含量如圖1所示。在整個(gè)試驗(yàn)階段，對(duì)照植株中的MDA含量變化不大。淹水條件下，植株的MDA含量顯著增加，且新疆紫泥泉的MDA含量一直高于渝苜1號(hào)。從圖1還可以看出，新疆紫泥泉葉片MDA含量在第6天達(dá)到最大值，為對(duì)照的3.3倍，是渝苜1號(hào)的1.6倍，隨后開始下降，但淹水第10天仍顯著高于渝苜1號(hào)(P<0.05)。整個(gè)淹水階段渝苜1號(hào)MDA含量增加較新疆紫泥泉少，說明渝苜1號(hào)受淹水脅迫的影響較小，受到的傷害也比較小。

2.3 淹水脅迫對(duì)葉片中SOD、POD和CAT活性的影響

試驗(yàn)過程中，對(duì)照植株的抗氧化酶活性變化不大，一直在小范圍波動(dòng)，而淹水處理植株的酶活性變化比較大。淹水情況下，兩個(gè)品種SOD活性在淹水第2天稍微下降之后開始明顯增加，并在淹水第6天達(dá)到最大值，其中渝苜1號(hào)為544.5 U/g FW，新疆紫泥泉為406.8 U/g FW，二者差異顯著(P<0.01)。隨后，兩個(gè)品種SOD活性都迅速降低，在第10天降到對(duì)照水平以下，但渝苜1號(hào)仍高于新疆紫泥泉(圖2)。

兩個(gè)品種POD活性在淹水后開始增加，并在第4天達(dá)到最大值，隨后新疆紫泥泉中的POD活性開始迅速下降，而渝苜1號(hào)中的POD活性下降速度較慢，在淹水第8天渝苜1號(hào)中的POD活性是新疆紫泥泉的1.4倍，差異極顯著(P<0.01)(圖2)。

淹水處理后，兩個(gè)品種CAT活性明顯增強(qiáng)，在淹水第2天渝苜1號(hào)的CAT活性迅速達(dá)到峰值，是對(duì)照的2.3倍，是新疆紫泥泉的1.5倍。新疆紫泥泉的CAT活性在第4天達(dá)到最大值，隨后降低，而渝苜1號(hào)在淹水第6天依然保持著較高的CAT活性。在整個(gè)淹水處理過程中，渝苜1號(hào)的CAT活性明顯高于新疆紫泥泉(圖2)。

2.4 淹水脅迫對(duì)根系A(chǔ)DH、LDH和PDC活性的影響

整個(gè)淹水脅迫階段，兩個(gè)品種ADH活性都呈先增加后減小的趨勢(shì)，且都在第6天達(dá)到峰值，隨后，兩個(gè)品種ADH活性都降低。在淹水第8天，渝苜1號(hào)ADH活性是新疆紫泥泉的2.3倍，二者差異極顯著(P<0.01)。第10天，渝苜1號(hào)仍高于新疆紫泥泉(圖3)。

淹水處理后兩個(gè)品種植株中LDH活性都增加。淹水脅迫第2天，渝苜1號(hào)中的LDH活性達(dá)到最大值(5 U/g)，是對(duì)照的1.7倍，但與新疆紫泥泉(4.4 U/g)差異不顯著。隨后，渝苜1號(hào)中的LDH活性一直在較小的范圍內(nèi)波動(dòng)，緩慢下降，而新疆紫泥泉中的LDH活性顯著增加，在第6天達(dá)到峰值(9.4 U/g)，是對(duì)照的3.9倍，是渝苜1號(hào)的2.1倍，隨后新疆紫泥泉中的LDH活性顯著降低(圖3)。

兩個(gè)品種淹水脅迫后PDC活性增加，其中新疆紫泥泉的PDC活性在第2天達(dá)到最大值，隨后下降。而渝苜1號(hào)在淹水第6天才達(dá)到峰值，是新疆紫泥泉的1.5倍，兩者差異極顯著(P<0.01)，隨后渝苜1號(hào)PDC活性也降低，總體來看，渝苜1號(hào)PDC活性比新疆紫泥泉高，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)(圖3)。

3 討論

本研究結(jié)果表明，淹水脅迫顯著抑制了紫花苜蓿的生長(zhǎng)，但渝苜1號(hào)比新疆紫泥泉具有更強(qiáng)的淹水耐受性(表1)。渝苜1號(hào)是在南方濕熱地區(qū)(重慶)育成的品種，而新疆紫泥泉?jiǎng)t是北方干旱地區(qū)的地方品種。許多研究表明品種育成地氣候與品種特性密切相關(guān)[19-21]。在濕熱地區(qū)育成的品種渝苜1號(hào)應(yīng)表現(xiàn)出更具耐濕性。

圖2 淹水脅迫對(duì)紫花苜蓿幼苗葉片SOD、POD和CAT活性的影響Fig.2 Effect of waterlogging on the activity of SOD, POD and CAT in the leaves of alfalfa seedlings

圖3 淹水脅迫對(duì)紫花苜蓿幼苗根系A(chǔ)DH、LDH和PDC活性的影響Fig.3 Effect of waterlogging on the activity of ADH, LDH and PDC in the leaves of alfalfa seedlings

土壤淹水時(shí)，缺氧是最主要的脅迫因素。缺氧時(shí)，植物根系依靠氧的反應(yīng)過程被抑制，ATP供不應(yīng)求，植物通過啟動(dòng)無氧呼吸，進(jìn)入發(fā)酵代謝，依靠NAD+氧化底物生成ATP(底物水平磷酸化)來維持植物的生長(zhǎng)發(fā)育[22]。LDH是植物缺氧進(jìn)行乳酸發(fā)酵不可缺少的一種酶。旱生植物淹水之后缺氧誘導(dǎo)LDH活性迅速升高，淹水很短的時(shí)間之后就以乳酸發(fā)酵為主，這是不耐低氧植物的顯著特征[23]。PDC與ADH是植物缺氧進(jìn)行乙醇發(fā)酵不可缺少的酶，抗淹水植物的淹水耐性與ADH活性的變化呈正比，在淹水條件下，ADH活性迅速升高，將有毒物質(zhì)乙醛轉(zhuǎn)化成乙醇，幫助植物躲避缺氧根系的主要毒害物質(zhì)之一乙醛的傷害[8]。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)PDC是乙醇發(fā)酵的限速酶，過量表達(dá)丙酮酸脫羧酶基因pdc1和pdc2的擬南芥植株在淹水條件下的成活率明顯增加[24]?？梢娧退笠砸掖及l(fā)酵為主，是耐低氧植物的顯著特征。本研究的兩個(gè)品種在淹水2 d以后各個(gè)階段，渝苜1號(hào)根系無氧呼吸酶ADH和PDC的活性均高于新疆紫泥泉，而LDH的活性則低于新疆紫泥泉(圖3)，說明在淹水條件下渝苜1號(hào)NAD+產(chǎn)生的主要途徑不是乳酸發(fā)酵而是乙醇發(fā)酵。因此，乙醇發(fā)酵是渝苜1號(hào)耐缺氧的一種戰(zhàn)略，是渝苜1號(hào)比新疆紫泥泉耐水淹的重要理由之一。

淹水脅迫下，植物體內(nèi)氧化代謝紊亂，產(chǎn)生過多的活性氧類物質(zhì)(ROS)，產(chǎn)生氧化脅迫，但植物體內(nèi)的抗氧化酶保護(hù)系統(tǒng)能夠清除自由基的損傷，保護(hù)植物免受氧化傷害[25-26]。研究表明，SOD、POD和CAT活性高能夠保護(hù)植物在長(zhǎng)時(shí)間水淹時(shí)免受活性氧的傷害，對(duì)維持植物存活具有重要意義[7-8]。淹水條件下，渝苜1號(hào)比新疆紫泥泉能夠維持更高的SOD、POD和CAT活性水平(圖2)，這就使它能夠更好地消除活性氧，保護(hù)植株免受更嚴(yán)重的氧化傷害，這也是說明渝苜1號(hào)比新疆紫泥泉更耐淹水脅迫的理由之一。

4 結(jié)論

淹水脅迫下，紫花苜蓿生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，抑制幅度與品種耐濕強(qiáng)弱有關(guān)。在濕熱地區(qū)育成的品種渝苜1號(hào)耐淹水能力比新疆紫泥泉強(qiáng)，因?yàn)橛遘?號(hào)抗氧化酶活性更高，而且在缺氧條件下主要通過乙醇發(fā)酵途徑，具有耐低氧植物特征。

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Effect of waterlogging on antioxidant and anaerobic respiratory enzymesinMedicagosativavarieties from southern and northern China

QUAN Rui-Lan1,2， YU Yong-Xiong1*

1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,SouthwestUniversity,Chongqing400716,China; 2.XinyangCityAcademyofAgriculturalSciences,Xinyang464000,China

TwoMedicagosativavarieties, Yumu No.1 (southern China) and Xinjiangziniquan (northern China), were compared. Six waterlogging treatments; 0, 2, 4, 6, 8 and 10 days of waterlogging were imposed on seedlings at the 4-leaf stage. The malondialdehyde (MDA) content, superoxide dismutase (SOD), peroxidase (POD) and catalase (CAT) activity in the leaves and lactate dehydrogenase (LDH), pyruvate (PDC) and alcohol dehydrogenase (ADH) activity in the roots were evaluated in all treatments. Biomass was measured after 10 days of waterlogging. Waterlogging stress reduced the biomass of both varieties but Yumu No.1 was less affected than Xinjiangziniquan. The activities of SOD, POD and CAT in leaves of Yumu No.1 were higher than those of Xinjiangziniquan under waterlogging stress, but the MDA content in the leaves was lower than that of Xinjiangziniquan. The activity of respiratory enzymes in the roots was influenced by waterlogging; In Yumu No.1 ADH and PDC activity increased more than LDH activity with stronger alcohol dehydrogenaseactivity, while in Xinjiangziniquanwaterlogging resulted in increased LDH and lactic dehydrogenase activity. It was concluded that the greater tolerance of waterlogging observed in Yumu No.1 was primarily due to higher antioxidant enzyme and anaerobic respiratory enzyme activity.

waterlogging stress;Medicagosativa; variety; antioxidant enzyme; anaerobic respiratory enzyme

10.11686/cyxb20150510

http://cyxb.lzu.edu.cn

2014-03-11；改回日期：2014-11-03

973計(jì)劃課題(2007CB108901)，948項(xiàng)目(2014-Z31)和國(guó)家“十一五”支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAD36B02，2011BAD36B03)資助。

全瑞蘭(1985-)，女，河南平頂山人，碩士。E-mail：qrlhe@163.com *通訊作者Corresponding author. E-mail：yuyongxiong8@126.com

全瑞蘭, 玉永雄. 淹水對(duì)紫花苜蓿南北方品種抗氧化酶和無氧呼吸酶的影響. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2015, 24(5): 84-90.

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