劉健，肖雅文，蘆佳，吳忠義，張中保，徐杰，姚磊*

(1.內(nèi)蒙古師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010022；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，北京100097)

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四個(gè)抗草甘膦基因的抗性比較

劉健1,2**，肖雅文2**，蘆佳1,2**，吳忠義2，張中保2，徐杰1*，姚磊2*

(1.內(nèi)蒙古師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010022；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，北京100097)

草甘膦抗性是當(dāng)代農(nóng)業(yè)重要的農(nóng)藝性狀。為了選擇最佳的抗性基因用于植物篩選標(biāo)記，通過選取cp4-epsps、GR79-epsps、gat4621和GAT四個(gè)草甘膦抗性基因進(jìn)行比較，在擬南芥中驗(yàn)證各基因?qū)Σ莞熟⒌目剐浴?個(gè)基因的轉(zhuǎn)化苗經(jīng)4個(gè)濃度的草甘膦噴施檢測(cè)，結(jié)果顯示，GAT類基因的抗性明顯高于epsps類基因，基因間的差異達(dá)到了極顯著水平。gat4621基因?qū)Σ莞熟⒌目剐宰詈茫诟鳚舛认麓婊盥示憩F(xiàn)為最高值，且抗性穩(wěn)定。國(guó)內(nèi)發(fā)掘的GAT基因?qū)Σ莞熟⒁脖憩F(xiàn)出良好的抗性。GAT類基因的擬南芥轉(zhuǎn)化苗在噴施高濃度草甘膦條件下出現(xiàn)嚴(yán)重抽苔抑制；但在停施草甘膦后抑制解除，且可以開花結(jié)實(shí)。轉(zhuǎn)epsps類基因可以獲得高抗草甘膦植株，但在花期噴施草甘膦將造成敗育。從基因大小及抗性強(qiáng)弱考慮，GAT類基因作為篩選標(biāo)記基因應(yīng)該更為適合。

比較；草甘膦；抗性；基因

草甘膦(glyphosate)是由美國(guó)孟山都公司開發(fā)的一種內(nèi)吸傳導(dǎo)型除草劑，具有無選擇性、無殘留、滅生性的特點(diǎn)，特別是對(duì)滅除多年生雜草非常有效。植物綠色部分均能很好地吸收草甘膦，以葉片吸收為主。草甘膦通過與磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate，PEP)競(jìng)爭(zhēng)而和5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS)、莽草酸-3-磷酸(shikimate-3-phosphate，S3P)形成穩(wěn)定的復(fù)合體EPSPS-S3P-草甘膦，使得芳香族氨基酸化合物合成受阻，促使黃酮以及酚類化合物等激素和關(guān)鍵代謝物失調(diào)[1]，打亂了生物正常氮代謝而導(dǎo)致生物體的死亡[2]。

隨著當(dāng)前世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)向著機(jī)械化和集約化方向迅速發(fā)展，抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物成為一種普遍的種植需求。目前，植物獲得草甘膦抗性主要是通過兩種不同的途徑[3]。一種是通過誘變或向植物體內(nèi)導(dǎo)入對(duì)草甘膦不敏感的EPSPS，進(jìn)而提高植物對(duì)草甘膦的耐受性。另一種是通過向植物體內(nèi)導(dǎo)入草甘膦降解基因，在草甘膦發(fā)揮作用前將其降解，進(jìn)而使植物對(duì)草甘膦產(chǎn)生抗性。EPSPS是草甘膦作用于植物產(chǎn)生抑制的關(guān)鍵性合成酶。在提高植物對(duì)草甘膦耐受性的研究中多數(shù)是致力于對(duì)草甘膦不敏感的EPSPS發(fā)掘。當(dāng)前世界范圍內(nèi)應(yīng)用最廣的是來自根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)CP4菌株的EPSPS[4]。因其對(duì)PEP親和性較好且高抗草甘膦，轉(zhuǎn)cp4-epsps基因的植物對(duì)草甘膦具有較高的抗性，在抗草甘膦作物中應(yīng)用最多[3]。草甘膦降解機(jī)制與犧牲EPSPS和PEP結(jié)合催化活性為代價(jià)而獲得對(duì)草甘膦抗性不同，是在草甘膦發(fā)生作用前將其降解以使植物產(chǎn)生抗性。在長(zhǎng)期受草甘膦污染的土壤中存在許多可降解草甘膦的細(xì)菌[5]。多種基因已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)對(duì)草甘膦具有分解作用。草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(glyphosate N-acetyltransferase，GAT)基因即為其中一種。研究發(fā)現(xiàn)，草甘膦在GAT的作用下轉(zhuǎn)化成對(duì)植物沒有毒害的N-乙酰草甘膦(N-acetylglyphosate，NAG)[6]?，F(xiàn)在先鋒公司的轉(zhuǎn)gat4621抗草甘膦作物已得到大面積商業(yè)種植[3]。目前商業(yè)化的抗草甘膦作物所利用的抗性基因均屬國(guó)外專利。國(guó)內(nèi)對(duì)草甘膦抗性基因的研究以中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所獲得抗性基因相對(duì)較多。林敏實(shí)驗(yàn)室分離到的GR79(或稱AM79aroA)[7]的草甘膦抗性表現(xiàn)較好，被推測(cè)具有較大的商業(yè)應(yīng)用價(jià)值[8]。此外，該實(shí)驗(yàn)室還分離獲得了國(guó)內(nèi)唯一的草甘膦降解基因GAT，轉(zhuǎn)GAT的煙草(Nicotianatabacum)獲得較好的草甘膦抗性[9-10]。

植物篩選標(biāo)記基因是植物遺傳轉(zhuǎn)化體系中重要的組成部分。因植物材料的不同，最佳篩選標(biāo)記基因的選擇有所不同[11]。最適的篩選標(biāo)記基因?qū)χ参锏倪z傳轉(zhuǎn)化能起到事半功倍的作用。因cp4-epsps基因?qū)Σ莞熟⒕哂懈叨瓤剐裕唤ㄗh用作植物篩選標(biāo)記基因[12]。本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建一套含多種篩選標(biāo)記基因的植物表達(dá)雙元載體[13]，尋找最佳的抗草甘膦基因用于構(gòu)建載體的植物篩選標(biāo)記是豐富現(xiàn)有載體的目標(biāo)。雖然cp4-epsps和gat4621基因已經(jīng)在商業(yè)生產(chǎn)中得以應(yīng)用。但未見報(bào)道兩類基因?qū)Σ莞熟⒌目剐允欠翊嬖诓町?。本研究選擇cp4-epsps、GR79-epsps、gat4621和GAT四個(gè)草甘膦抗性基因進(jìn)行比較，在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中驗(yàn)證各基因?qū)Σ莞熟⒌目剐?，以期獲得最佳的抗性基因用于載體的構(gòu)建。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料與菌株 野生型擬南芥Columbia(Col-0)，大腸桿菌菌株DH5α和根癌農(nóng)桿菌GV3101:pMP90都為北京市農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心保存。

1.1.2 載體、酶和試劑 本實(shí)驗(yàn)使用的各種限制性內(nèi)切酶、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、T4連接酶、去磷酸化酶購(gòu)自TaKaRa、Promega和NEB公司。高保真酶Phusion購(gòu)自Thermo公司。Easy Taq購(gòu)自TransGen Biotech公司。PCR純化試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自博邁德有限公司。引物合成及測(cè)序由中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 草甘膦抗性基因的獲得 根據(jù)孟山都公司的pMON植物轉(zhuǎn)化載體序列[14]，設(shè)計(jì)引物AtPT-5′和CP4-3′(本試驗(yàn)所用引物序列見表1，下劃線部分為酶切位點(diǎn))，從抗草甘膦玉米基因組中擴(kuò)增cp4-epsps基因。該cp4-epsps基因序列5′端含有1段225 bp的擬南芥epsps基因的引導(dǎo)肽CPT序列。

根據(jù)中國(guó)專利ZL200710177090.1中GR79序列，由Invitrogen公司根據(jù)植物偏愛密碼子優(yōu)化堿基序列并合成。為保持與上述cp4-epsps基因相同，通過融合PCR方法在GR79的5′端添加CPT引導(dǎo)肽序列。方法是用引物AtPT-5′和AtPTGR79-R以cp4-epsps基因?yàn)槟０鍞U(kuò)增CPT引導(dǎo)肽序列；用引物AtPTGR79-F和GR79-3′擴(kuò)增GR79基因。瓊脂糖凝膠電泳純化PCR產(chǎn)物后，以純化產(chǎn)物為模板，將CPT和GR79基因混合，再用引物AtPT-5′和GR79-3′擴(kuò)增，獲得5′端添加CPT引導(dǎo)肽序列的GR79-epsps基因。

根據(jù)美國(guó)專利US 7973218-B2中g(shù)at4621序列，基因由中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司合成，并克隆至pBluescript SK載體SacⅠ(基因5′端)和KpnⅠ(基因3′端)位點(diǎn)。

根據(jù)中國(guó)專利200510086626.X中GAT序列，并選用單子葉植物偏愛密碼子優(yōu)化堿基序列后命名GATm?；騁ATm由中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司合成，并克隆至pBluescript SK載體SacⅠ(基因5′端)和KpnⅠ(基因3′端)位點(diǎn)。

表1 試驗(yàn)中所用PCR引物

注：引物下劃線部分為位點(diǎn)SacⅠ和KpnⅠ。

Note: The underline of the sequences indicate the cleave sites of restriction enzymesSacⅠ andKpnⅠ.

1.2.2 植物轉(zhuǎn)化雙元載體的構(gòu)建 用SacⅠ和KpnⅠ分別雙酶切cp4-epsps和GR79-epsps含CPT的PCR產(chǎn)物及含gat4621和GATm的pBSK載體，瓊脂糖凝膠電泳純化后備用。用SacⅠ和KpnⅠ雙酶切植物表達(dá)載體pYBA1305[15](pYBA100衍生載體，植物篩選標(biāo)記基因?yàn)閎ar，含CaMV 35SΩ啟動(dòng)子和CaMV polyA終止子的植物表達(dá)框)，瓊脂糖凝膠電泳純化后分別與上述各基因片段連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，挑選克隆提取質(zhì)粒DNA酶切驗(yàn)證并測(cè)序，得到4個(gè)基因用于植物轉(zhuǎn)化的雙元載體，各載體的T-DNA區(qū)段見圖1。

1.2.3 擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性苗的篩選 2013年，利用電擊法將各載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101:pMP90中，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸漬法侵染擬南芥[16]，每個(gè)基因各侵染32株野生型擬南芥。將收獲的各基因轉(zhuǎn)化T0代種子分別均勻播撒在3盤盛有營(yíng)養(yǎng)土的培養(yǎng)托盤中，置于22℃(晝)/18℃(夜)，光照周期為16 h(光)/8 h(暗)的人工氣候室。待幼苗長(zhǎng)出兩片子葉后噴灑2～3次濃度為0.2%(體積比)的商業(yè)Basta除草劑篩選陽(yáng)性苗。存活植株用小量快速法[17]提取植物基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)。用引物AtPT-5′和CP4-3′檢測(cè)cp4-epsps轉(zhuǎn)化苗；擴(kuò)增出1.8 kb目的條帶為陽(yáng)性苗。用引物AtPTGR79-F和GR79-3′檢測(cè)GR79-epsps轉(zhuǎn)化苗；擴(kuò)增出1.5 kb目的條帶的為陽(yáng)性苗。用引物GAT4621-F/R檢測(cè)gat4621轉(zhuǎn)化苗；擴(kuò)增出約269 bp目的條帶為陽(yáng)性苗。用引物GATm-F/R檢測(cè)GATm轉(zhuǎn)化苗；擴(kuò)增出約245 bp目的條帶為陽(yáng)性苗。

1.2.4 草甘膦抗性的鑒定 待噴灑Basta除草劑獲得陽(yáng)性苗后，對(duì)4個(gè)基因的轉(zhuǎn)基因苗按照濃度從低至高逐步噴施不同濃度的孟山都公司“農(nóng)達(dá)”除草劑(Roundup，41%草甘膦異丙胺鹽水劑)稀釋液。稀釋濃度梯度為0.2%，0.4%，0.6%，0.8%(體積比)，每隔3 d噴1次，每個(gè)梯度噴2次。統(tǒng)計(jì)4個(gè)基因的轉(zhuǎn)化株在每個(gè)草甘膦濃度下的存活率，存活率=存活株數(shù)/Basta抗性株。每個(gè)基因3盤苗，為3次重復(fù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.5 基因表達(dá)量的定量PCR檢測(cè) 在0.4%濃度“農(nóng)達(dá)”處理下，4個(gè)基因的轉(zhuǎn)基因苗對(duì)草甘膦的抗性差異已經(jīng)非常明顯。隨機(jī)選取各基因的高抗與弱抗苗各1株，用TRIzol法提取總RNA，用M-MLV翻轉(zhuǎn)成cDNA。以擬南芥SAND基因(AT2G28390)為內(nèi)參進(jìn)行基因表達(dá)量的熒光相對(duì)定量檢測(cè)?；驒z測(cè)引物為CP4-F/R、GR79-F/R、GAT4621-F/R、GATm-F/R和SAND-F/R。

1.3 抗性分析

各基因在不同草甘膦濃度下的抗性差異，用SPSS軟件進(jìn)行差異顯著性方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗性基因的獲得與載體構(gòu)建

用引物AtPT-5′和CP4-3′以抗草甘膦玉米基因組DNA為模板，擴(kuò)增獲得cp4-epsps基因。經(jīng)GenBank的Blast比對(duì)，該cp4-epsps基因序列5′端含1段與擬南芥epsps基因(AT2G45300)前225 bp同源性100%的引導(dǎo)肽序列；其cp4-epsps基因區(qū)段與抗草甘膦大豆中cp4-epsps基因(AF464188)核酸序列同源性最高，為99.64%，氨基酸同源性為100%。該cp4-epsps基因PCR產(chǎn)物經(jīng)SacⅠ和KpnⅠ雙酶切后連入植物表達(dá)載體pYBA1305；酶切及測(cè)序驗(yàn)證正確后命名1305-cp4-epsps。

由Invitrogen公司根據(jù)植物偏愛密碼子合成的GR79序列與原始序列核酸的同源性為72.48%，氨基酸同源性為100%。通過融合PCR添加CPT引導(dǎo)肽后，該GR79-epsps基因PCR產(chǎn)物經(jīng)SacⅠ和KpnⅠ雙酶切后連入植物表達(dá)載體pYBA1305；酶切及測(cè)序驗(yàn)證正確后命名1305-GR79-epsps。

基因gat4621合成后用SacⅠ和KpnⅠ雙酶切相應(yīng)載體，純化后的基因連入植物表達(dá)載體pYBA1305；酶切及測(cè)序驗(yàn)證正確后命名1305-gat4621。

根據(jù)單子葉植物偏愛密碼子優(yōu)化后，GATm與原始序列核酸的同源性為82.17%，氨基酸同源性為100%?；騁ATm合成后用SacⅠ和KpnⅠ雙酶切相應(yīng)載體，純化后的基因連入植物表達(dá)載體pYBA1305；酶切及測(cè)序驗(yàn)證正確后命名1305-GATm。

圖1 載體T-DNA區(qū)段示意圖Fig.1 Structure of the T-DNA region of vectors A: 載體1305-cp4-epsps Vector 1305-cp4-epsps; B: 載體1305-GR79-epsps Vector 1305-GR79-epsps; C: 載體1305-gat4621 Vector 1305-gat4621; D: 載體1305-GATm Vector 1305-GATm.

2.2 擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗的篩選

利用電擊法將4個(gè)載體分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101:pMP90中，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸漬法侵染擬南芥[16]。將每個(gè)載體收獲的擬南芥T0代種子播種于3盤盛有營(yíng)養(yǎng)土的托盤中置于人工氣候室培養(yǎng)。因pYBA1305載體的植物篩選標(biāo)記基因?yàn)锽ar，轉(zhuǎn)基因苗首先應(yīng)具有草胺磷抗性。幼苗經(jīng)噴灑2～3次Basta除草劑篩選后，能夠繼續(xù)生長(zhǎng)且長(zhǎng)勢(shì)良好的植株為抗性株。從各載體的抗性苗中隨機(jī)抽取12株提取植物基因組DNA進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果全部為陽(yáng)性(圖2)，證明目的基因已整合到擬南芥植物基因組中。經(jīng)統(tǒng)計(jì)4個(gè)載體1305-cp4-epsps、1305-GR79-epsps、1305-gat4621和1305-GATm分別平均每盤各獲得轉(zhuǎn)化苗(185.7±18.6)，(192.0±23.5)，(145.3±43.5)和(119.0±8.5)棵；平均每轉(zhuǎn)化1株擬南芥獲得11～18株T1代轉(zhuǎn)化苗。

圖2 轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗4種抗性基因的PCR檢測(cè)Fig.2 The PCR detections of four glyphosate-resistant genes from transgenic plants A：cp4-epsps;B：GR79-epsps;C：gat4621;D：GATm;M: DNA分子量標(biāo)記DNA ladder；1～12：不同轉(zhuǎn)化植株Different transgenic plants；13：空白對(duì)照Blank control.

2.3 草甘膦抗性的比較

圖3 不同草甘膦濃度梯度下各基因轉(zhuǎn)化苗的存活率Fig.3 Transgenic plants survival amount on different concentrations of glyphosate不同字母表示差異顯著(P<0.05)。 The different letters mean significantly different (P<0.05).

在先經(jīng)除草劑Basta篩選的基礎(chǔ)上，分別對(duì)4個(gè)載體的轉(zhuǎn)化苗逐步噴施了0.2%～0.8%四個(gè)濃度梯度的“農(nóng)達(dá)”。轉(zhuǎn)化苗噴施草甘膦后的存活率統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖3，生長(zhǎng)情況見圖4。由圖3和圖4可以看到各濃度下GAT類(gat4621和GATm)轉(zhuǎn)化苗的存活率都較EPSPS類(cp4-epsps和GR79-epsps)轉(zhuǎn)化苗的存活率高。結(jié)果顯示濃度間和基因間的差異都達(dá)到了極顯著的水平(P<0.05)。相比低濃度的0.2%，當(dāng)濃度提升至0.6%時(shí)差異開始顯著。4個(gè)基因間的差異都達(dá)到了顯著性水平(P<0.05)；其中抗性最好的gat4621與其他3個(gè)基因的差異達(dá)到極顯著水平。

對(duì)4個(gè)“農(nóng)達(dá)”濃度和4個(gè)基因組成的全部16個(gè)處理的存活率進(jìn)行單因子方差分析(圖3)。gat4621基因?qū)Σ莞熟⒌目剐宰詈茫诟鳚舛认麓婊盥示憩F(xiàn)為最高值，且抗性穩(wěn)定，只在0.8%濃度時(shí)才有所下降，差異達(dá)到顯著性水平。GATm基因?qū)Σ莞熟⒁脖憩F(xiàn)出良好的抗性，但隨著濃度的提高抗性逐漸下降，濃度達(dá)到0.6%時(shí)基因內(nèi)差異達(dá)到了顯著水平；其與gat4621基因的抗性在0.2%的濃度時(shí)無差異。

圖4 不同草甘膦濃度梯度下各基因轉(zhuǎn)化苗的存活情況Fig.4 The growth situation of transgenic plants of different genes on the different concentrations of glyphosate

圖5 噴施草甘膦后GAT類和epsps類基因轉(zhuǎn)化苗的抽苔情況Fig.5 The bolting of transgenic plants of GAT or epsps genesA: GATm轉(zhuǎn)化苗 The transgenic plants of GATm; B: cp4-epsps轉(zhuǎn)化苗The transgenic plants of cp4-epsps.

圖6 epsps類和GAT類基因轉(zhuǎn)化苗的果莢結(jié)實(shí)情況Fig.6 The siliques of transgenic plants of GAT or epsps genesA: cp4-epsps轉(zhuǎn)化苗 The transgenic plant of cp4-epsps; B: GATm轉(zhuǎn)化苗 The transgenic plant of GATm.

epsps基因轉(zhuǎn)化苗對(duì)草甘膦相對(duì)較敏感。在噴施0.2%的“農(nóng)達(dá)”后,GR79-epsps基因轉(zhuǎn)化苗的存活率急劇下降至42.08%。cp4-epsps基因轉(zhuǎn)化苗的存活率雖然達(dá)到83.06%，但其中許多苗出現(xiàn)心葉變黃不良癥狀(圖4)。當(dāng)“農(nóng)達(dá)”濃度達(dá)到0.4%時(shí)，cp4-epsps基因轉(zhuǎn)化苗中前期表現(xiàn)不良癥狀的苗死亡，存活率降到49.21%。當(dāng)濃度提高到0.8%時(shí)，cp4-epsps基因轉(zhuǎn)化苗的存活率下降到17.04%。各濃度下GR79-epsps基因轉(zhuǎn)化苗的存活率最低，且均約為cp4-epsps基因轉(zhuǎn)化苗存活率的50%，在低濃度時(shí)差異達(dá)顯著水平。

2.4 噴施草甘膦后抗性苗的不良癥狀

由于在長(zhǎng)日照條件下擬南芥Col-0生態(tài)型生長(zhǎng)3～4周后開始抽苔。當(dāng)用0.2%濃度的“農(nóng)達(dá)”處理轉(zhuǎn)化苗時(shí)生長(zhǎng)時(shí)期已經(jīng)接近3周，部分苗已經(jīng)開始抽苔。隨著施用“農(nóng)達(dá)”濃度的提高和生長(zhǎng)期的變化，epsps高抗轉(zhuǎn)化苗陸續(xù)抽苔開花，但GAT轉(zhuǎn)化苗表現(xiàn)出抽苔受到抑制，葉片顏色變暗(圖4)。但在停止繼續(xù)噴施草甘膦后，生長(zhǎng)受到抑制的轉(zhuǎn)化苗葉片逐漸轉(zhuǎn)綠，并陸續(xù)抽苔結(jié)實(shí)(圖5A)。epsps存活的高抗轉(zhuǎn)化苗在噴施草甘膦后抽苔沒有受到影響，葉片顏色較綠(圖5B)；但在種子收獲時(shí)發(fā)現(xiàn)所有的果莢都沒有結(jié)實(shí)(圖6A)，沒有收到1粒種子。在體式顯微鏡下?lián)荛_epsps轉(zhuǎn)化苗的果莢可以看到所有的胚珠都在早期停止了發(fā)育，而GAT轉(zhuǎn)化苗的果莢內(nèi)胚珠發(fā)育成正常的種子(圖6B)。將GAT轉(zhuǎn)化苗收獲的種子播種于人工氣候室，經(jīng)噴灑除草劑Basta后，存活的抗性苗在不噴施除草劑“農(nóng)達(dá)”的條件下可以正常抽苔結(jié)實(shí)。

2.5 草甘膦抗性與基因表達(dá)量的關(guān)系

圖7 轉(zhuǎn)基因苗的基因表達(dá)量分析Fig.7 The analysis of genes expression of transgenic plants

當(dāng)“農(nóng)達(dá)”濃度提升到0.4%時(shí)，4個(gè)基因的轉(zhuǎn)化苗都出現(xiàn)生長(zhǎng)受到抑制幼苗。各基因轉(zhuǎn)化苗中隨機(jī)選取高抗和弱抗幼苗各1株，提取葉片總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。在檢測(cè)RNA無基因組DNA污染后，用此cDNA為模板，以SAND為內(nèi)源參照基因進(jìn)行抗性基因表達(dá)的熒光相對(duì)定量分析(SAND基因引物見表1)。結(jié)果如圖7所示，4個(gè)基因分別在高抗株中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于弱抗株。為了明確高抗株的高抗性是否源于拷貝數(shù)的增加而引起。分別對(duì)gat4621和GATm各16個(gè)高抗轉(zhuǎn)化株T2代幼苗進(jìn)行了抗除草劑Basta分離比統(tǒng)計(jì)。gat4621和GATm各有75.0%和43.8%的轉(zhuǎn)化株系符合3∶1分離比，這些株系可以初步認(rèn)為是單拷貝插入。

3 討論

草甘膦抗性是重要的農(nóng)藝性狀。本研究選取兩類4個(gè)草甘膦抗性基因構(gòu)建于同一載體的相同克隆位點(diǎn)，且epsps類基因都含有相同的CPT引導(dǎo)肽序列，相對(duì)客觀地體現(xiàn)了該4個(gè)基因?qū)Σ莞熟⒌恼鎸?shí)抗性。從T1代轉(zhuǎn)化苗噴施“農(nóng)達(dá)”后的存活率來看，GAT類基因的抗性明顯高于epsps類基因。先鋒公司的gat4621是由地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)3個(gè)菌株的GAT基因經(jīng)體外重組(DNA shuffling)后大量篩選獲得。此外，為了在植物中更好表達(dá)該蛋白，一個(gè)由GCT編碼的丙氨酸被插在蛋白質(zhì)氨基酸序列的第二位[18]。國(guó)內(nèi)發(fā)掘的GAT蛋白氨基酸序列第二位不含有插入的丙氨酸，也表現(xiàn)出對(duì)草甘膦的良好抗性，且在施用低濃度草甘膦時(shí)抗性已經(jīng)接近gat4621，其在將來的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)具有廣闊的應(yīng)用前景。GAT類基因的轉(zhuǎn)化苗在噴施高濃度“農(nóng)達(dá)”條件下存活率高，但嚴(yán)重抑制抽苔。由于在不施用草甘膦時(shí)GAT轉(zhuǎn)基因苗能夠正常抽苔，這種抽苔抑制可能是由于中間產(chǎn)物NAG不能迅速降解而積累所致。這一現(xiàn)象以前未見相關(guān)報(bào)道，具體原因有待以后進(jìn)一步深入研究。在實(shí)際應(yīng)用中注意草甘膦的施用濃度，將有助于防止或緩解藥害的發(fā)生。

采用過量表達(dá)epsps或引入突變的epsps使植物獲得對(duì)草甘膦耐性方法易造成植物體內(nèi)草甘膦的累積，使植物出現(xiàn)敗育、授粉率降低、不耐脅迫、農(nóng)藝性狀改變等問題[19]。本研究結(jié)果再次證實(shí)盡管轉(zhuǎn)epsps基因可以獲得高抗草甘膦植株，但在花期噴施草甘膦將造成敗育，這就要求在草甘膦的實(shí)際使用中注意作物適用生育期。

研究結(jié)果顯示高抗轉(zhuǎn)基因植株是由于轉(zhuǎn)入基因的轉(zhuǎn)錄水平(或表達(dá)量)高；而從分離比看這又不是因?yàn)槎嗫截愐?；更主要的原因?yīng)該是由不同的插入位點(diǎn)所致。最近的研究發(fā)現(xiàn)由于草甘膦的多年使用，在選擇壓下自然界中的雜草有的對(duì)草甘膦產(chǎn)生了自然抗性。美國(guó)佐治亞州的抗草甘膦長(zhǎng)芒莧(Amaranthuspalmeri)中含有5～160倍拷貝數(shù)的epsps基因，且分布于每條染色體[20]，表明多拷貝超劑量的表達(dá)抗性基因可增加植物的草甘膦抗性。雖然多拷貝的轉(zhuǎn)入外源基因有可能造成轉(zhuǎn)入的基因沉默和抑制，但在適當(dāng)?shù)那闆r下這未嘗不是一種可用的手段。此外，將epsps基因和草甘膦降解基因聯(lián)合使用將有可能做到優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)。

本研究只是利用十字花科模式植物進(jìn)行的驗(yàn)證。由于不同的物種自身對(duì)草甘膦的抗性表現(xiàn)不同，在單子葉大田作物中抗性基因的抗性和表現(xiàn)可能會(huì)有差異。在目前的大田作物應(yīng)用中cp4-epsps基因仍是最主要的草甘膦抗性基因[3]。從基因大小和抗性強(qiáng)弱考慮，GAT類基因作為篩選標(biāo)記基因應(yīng)該更為適合，但在具體實(shí)施中應(yīng)注意草甘膦的施用濃度。

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Comparison of four glyphosate tolerance genes

LIU Jian1,2**， XIAO Ya-Wen2**， LU Jia1,2**， WU Zhong-Yi2， ZHANG Zhong-Bao2， XU Jie1*，YAO Lei2*

1.CollegeofLifeScienceandTechnology,InnerMongoliaNormalUniversity,Hohhot010022,China; 2.BeijingAgro-BiotechnologyResearchCenter,BeijingAcademyofAgricultureandForestry,Beijing100097,China

Glyphosate tolerance is an important agronomic trait in modern agriculture. In order to determine the best glyphosate tolerance gene for plant selectable markers we compared four glyphosate tolerance genes,cp4-epsps,GR79-epsps,gat4621 andGAT, inArabidopsis. Four transgenic plants harboring each gene were treated with four different rates of glyphosate. The results showed that the resistance of plants withGATgene was significantly higher than plants with theepspsgene. Plants with thegat4621 gene had the highest survival rate at all herbicide rates. The plants with the domesticGATgene also had strong resistance. Reproductive development ofArabidopsisplants with theGATgene was suppressed at higher glyphosate application rates.It was concluded that theGATgene was more suitable as a selectable marker gene.

comparison; glyphosate; tolerance; gene

10.11686/cyxb20150519

http://cyxb.lzu.edu.cn

2014-05-16；改回日期：2014-06-22

北京市農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新能力建設(shè)專項(xiàng)(No. KJCX201102003)資助。

劉健(1988-)，男，山西呂梁人，在讀碩士。E-mail: 906047892@qq.com。肖雅文(1988-)，女，四川成都人，碩士。E-mail: xyw_1020@126.com。蘆佳(1987-)，女，山西大同人，在讀碩士。E-mail: 905696441@qq.com。**共同第一作者These authors contributed equally to this work. *通訊作者Corresponding author. E-mail：yaolei@baafs.net.cn，xujie@imnu.edu.cn

劉健, 肖雅文, 蘆佳, 吳忠義, 張中保, 徐杰, 姚磊. 四個(gè)抗草甘膦基因的抗性比較. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2015, 24(5): 159-166.

Liu J, Xiao Y W, Lu J, Wu Z Y, Zhang Z B, Xu J, Yao L. Comparison of four glyphosate tolerance genes. Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(5): 159-166.