付維力 李箭 李棋 唐新 陳剛

四川大學(xué)華西醫(yī)院骨科（成都610041）

種子細(xì)胞是組織工程半月板和細(xì)胞治療的首要因素， 也是保證組織工程半月板進(jìn)一步深入研究和應(yīng)用的前提條件[1]。構(gòu)建組織工程半月板和細(xì)胞治療需要大量的種子細(xì)胞， 目前用于組織工程半月板的種子細(xì)胞主要有半月板軟骨細(xì)胞、干細(xì)胞等[2]；干細(xì)胞如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有多項(xiàng)分化潛能，其細(xì)胞來源充足、取材方便、分離培養(yǎng)相對簡單，但其細(xì)胞因子調(diào)控和誘導(dǎo)十分復(fù)雜并且具有潛在的癌變可能。 自體半月板纖維軟骨細(xì)胞是目前種子細(xì)胞最佳和應(yīng)用最廣泛的細(xì)胞來源，而分離的原代細(xì)胞培養(yǎng)無法滿足細(xì)胞數(shù)目的要求，單層培養(yǎng)半月板纖維軟骨細(xì)胞是目前用于半月板細(xì)胞擴(kuò)增的最常用手段， 但是在體外單層培養(yǎng)系統(tǒng)中細(xì)胞表型可能會出現(xiàn)改變[3]。近年來的研究已確定體外單層培養(yǎng)系統(tǒng)中關(guān)節(jié)軟骨和椎間盤軟骨細(xì)胞表型隨傳代的進(jìn)行變?yōu)槌衫w維細(xì)胞的表型，表現(xiàn)出去分化的現(xiàn)象[4-6]。但目前對半月板細(xì)胞體內(nèi)外生物學(xué)特性的認(rèn)識非常有限， 在單層培養(yǎng)系統(tǒng)中半月板纖維軟骨細(xì)胞的表型改變尚不確切[7]。本研究采用機(jī)械分離與酶連續(xù)消化相結(jié)合的方法體外分離培養(yǎng)兔半月板纖維軟骨細(xì)胞， 單層培養(yǎng)傳代至第5 代，并從形態(tài)學(xué)、生長狀況、基質(zhì)蛋白表達(dá)水平比較分析體外培養(yǎng)的半月板細(xì)胞生物學(xué)特性的改變， 為構(gòu)建組織工程半月板和細(xì)胞治療中的種子細(xì)胞優(yōu)選提供進(jìn)一步的理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑及儀器

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級健康1 周齡新西蘭乳兔，雌雄不限，體重約200～300 g,由四川大學(xué)華西動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。 1∶1 的DMEM/ F12（DF）、FBS、透明質(zhì)酸酶、胰蛋白酶、EDTA、Ⅱ型膠原酶、MTT、DMSO(Sigma 公司，美國)，PBS （成都新川化學(xué)試劑有限公司），CO2培養(yǎng)箱（SANYO 公司，日本）；離心機(jī)（Eppendorf 公司，德國），倒置相差顯微鏡 （Olympus 公司， 日本）， 掃描電鏡（JSM-6700F, JEOL, 日本）, 鼠抗兔Ⅰ型膠原單克隆抗體、鼠抗兔Ⅱ型膠原單克隆抗體原（Oncogene 公司，美國），SABC 免疫組化試劑盒（武漢博士德生物技術(shù)有限公司），DAB 顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），酶聯(lián)免疫檢測儀(BIORAD，美國)。

1.2 半月板纖維軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)、傳代

無菌條件下取1 周齡新西蘭乳兔雙膝內(nèi)外側(cè)半月板, 盡量切除附著的滑膜和韌帶，并切除滑膜緣少量半月板組織，放入盛有DF 培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，用含1%慶大霉素的PBS 沖洗3 遍, 剪成約1 mm3碎塊, 然后0.05%透明質(zhì)酸酶5min 和0.25%胰蛋白酶37 ℃預(yù)消化30 min， 再加入0.2%Ⅱ型膠原酶37 ℃恒溫水浴搖床振蕩消化4～6 h。 經(jīng)顯微鏡觀察，大部分細(xì)胞消化下來后用巴氏吸管吹打2 min，終止消化，用200 目篩網(wǎng)過濾消化后的細(xì)胞懸液，1.2 kpm 離心5 min， 棄上清，PBS 洗兩次，加入含10% FBS 的DF, 苔盼藍(lán)染色測定細(xì)胞成活率約90%， 細(xì)胞計(jì)數(shù)后細(xì)胞按1×106/瓶重懸于含10%FBS 的DF 培養(yǎng)基的25 cm2的培養(yǎng)瓶, 置于37 ℃、5%CO2、95%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 每3 d 換液1次, 隔日倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化和生長情況。 待細(xì)胞鋪滿瓶底（80%～90%融合）后, 吸除培養(yǎng)液， 用含0.1% EDTA 的0.25% 胰蛋白酶消化傳代, 倒置相差顯微鏡下見細(xì)胞突觸收縮、細(xì)胞收縮變圓、細(xì)胞間隙增大后吸除消化酶，37 ℃孵育1～2 min。 細(xì)胞從瓶壁上脫落后， 加含10% FBS 的DF 培養(yǎng)液吹打混懸終止消化，將細(xì)胞懸液按1∶2 比例傳代，于37 ℃、5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2 d 換液。 隨即傳代至第5 代。 每代細(xì)胞懸液按4×104/孔的細(xì)胞密度、3 ml 培養(yǎng)液/孔接種于放有24 × 24 血蓋片的六孔板上， 隔日觀察換液，待細(xì)胞長滿瓶底取爬片備用。

1.3 形態(tài)學(xué)觀察

在倒置顯微鏡下隔日觀察原代至第5 代細(xì)胞的大體形態(tài)和生長狀況。取第1 代、第5 代細(xì)胞爬片行SEM觀察：經(jīng)2.5%戊二醛固定2 h，酒精梯度脫水，醋酸異戊酯固定置換，CO2臨界點(diǎn)干燥，表面噴金后于SEM 下觀察。

1.4 MTT 法檢測細(xì)胞增殖，繪制細(xì)胞的生長曲線

取第1～5 代半月板纖維軟骨細(xì)胞，分別以含0.1%EDTA 的0.25% 胰蛋白酶消化后，1.2 kpm 離心5 min后收集，加入10% FBS 的DF 培養(yǎng)基，制備密度為2 ×104個(gè)/ ml 的細(xì)胞懸液， 以每孔200 μl 接種于96 孔板內(nèi)，8 孔為1 組，每代細(xì)胞各設(shè)5 組，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于接種后1、3、5、7、9 d 檢測，檢測時(shí)每孔加入20 μl MTT 液后37 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸除全部液體， 每孔加入50 μl DMSO 振蕩10 min 至結(jié)晶完全溶解，以空白對照孔調(diào)零，在酶標(biāo)儀上檢測在570 nm 波長處的吸光度（A）值。 以時(shí)間為橫坐標(biāo)、A 值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線， 比較不同代次細(xì)胞的生長周期及生長速度。

1.5 細(xì)胞化學(xué)和免疫組織化學(xué)染色

取原代至第5 代半月板細(xì)胞爬片行甲苯胺藍(lán)、番紅O 染色，免疫組化鑒定細(xì)胞分泌的蛋白聚糖和Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

半月板纖維軟骨細(xì)胞原代接種細(xì)胞為小圓球形,呈懸浮狀態(tài)，接種后8～12 h 開始貼壁, 48～72 h 大部分細(xì)胞貼壁完全, 胞質(zhì)逐漸展開，胞體變大伸長，形成突起，呈多角形。隨著細(xì)胞數(shù)量增加，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，輪廓清晰，光滑，胞漿豐富、透亮，折光性強(qiáng)，鏡下觀察有立體感，胞核清晰可見，居中，呈圓形/橢圓形，有多個(gè)核仁。 接種5 d 后細(xì)胞逐漸融合，7～9 d 后，細(xì)胞鋪滿瓶底傳代。 傳代后細(xì)胞貼壁生長能力和增殖速度明顯加快，4～6 h 開始貼壁，24 h 貼壁完全，細(xì)胞增殖較快，48 h 后開始增殖分裂， 進(jìn)入對數(shù)生長期，4～6 d 后細(xì)胞融合成片狀，出現(xiàn)接觸性抑制。 同時(shí)，細(xì)胞形成單層、成簇生長，出現(xiàn)明顯的聚集樣分區(qū)，表現(xiàn)出“細(xì)胞群集”現(xiàn)象。原代至第2 代半月板軟骨細(xì)胞生長迅速，形態(tài)較規(guī)則，多呈多角形，大小均一，細(xì)胞周圍可見具有折光性的細(xì)胞外基質(zhì)。 細(xì)胞傳至第3 代后，細(xì)胞生長緩慢，不規(guī)則細(xì)胞逐漸增多， 細(xì)胞體積逐漸變大， 形態(tài)逐漸變?yōu)樗笮?，出現(xiàn)大量的長梭形細(xì)胞，呈漩渦狀緊密排列，具有成纖維樣細(xì)胞的典型特征。隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞活力逐漸下降，生長速度減慢，傳代周期延長，并出現(xiàn)不規(guī)則形態(tài)的細(xì)胞。 第5 代細(xì)胞分裂相少見， 密度稀疏，細(xì)胞形態(tài)不佳，胞漿內(nèi)出現(xiàn)空泡和黑色小顆粒，胞核散大，細(xì)胞間連接松散，細(xì)胞增殖普遍減緩、停滯。 隨著傳代次數(shù)的增加, 細(xì)胞中梭形細(xì)胞增多,第5 代培養(yǎng)細(xì)胞大約80%呈長梭形，分泌和增殖能力下降。 見圖1。

SEM 觀察： 第一代半月板細(xì)胞形態(tài)規(guī)則， 呈多極性，表面有突起，立體感強(qiáng)；第5 代細(xì)胞胞體變大，形態(tài)不規(guī)則。 見圖2。

圖1 各代次半月板細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察（倒置相差顯微鏡，×200）

圖2 第1、5 代半月板細(xì)胞掃描電鏡觀察（×400）

2.2 細(xì)胞生長曲線

生長曲線（圖3）可見第4 代前半月板細(xì)胞生長速度及生長周期均相似，第5 代后細(xì)胞生長速度減慢，增殖減緩。

圖3 前5 代半月板細(xì)胞生長曲線

2.3 細(xì)胞化學(xué)和免疫組化染色（圖4）

甲苯胺藍(lán)染色：細(xì)胞爬片經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色后，細(xì)胞質(zhì)染成淺藍(lán)色，細(xì)胞核染成深藍(lán)色，清晰可見1～3 個(gè)核仁。 細(xì)胞外基質(zhì)為淺藍(lán)色。3 代以后的軟骨細(xì)胞逐漸發(fā)生去分化，細(xì)胞體積增大，出現(xiàn)許多指狀突起，胞核增大， 隨著傳代次數(shù)增多， 細(xì)胞的甲苯胺藍(lán)染色逐漸變淺。

番紅O 染色：番紅O 染色主要是對軟骨細(xì)胞的蛋白聚糖染色，軟骨細(xì)胞胞內(nèi)、胞外含大量蛋白聚糖陽性物質(zhì)被染成紅色，軟骨細(xì)胞被包埋于其中，表明有軟骨細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)蛋白聚糖分泌。 隨著傳代的進(jìn)行，蛋白聚糖表達(dá)逐漸減弱。

免疫組化：表達(dá)呈陽性反應(yīng)為細(xì)胞胞漿呈棕黃色，蘇木素襯染的細(xì)胞核呈藍(lán)色。 Ⅰ型膠原免疫組化染色可見：至第5 代細(xì)胞胞漿內(nèi)陽性反應(yīng)增強(qiáng)。Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色，軟骨細(xì)胞胞漿被染成棕黃色，細(xì)胞相互接觸少的地方棕色較淡， 細(xì)胞密集生長的地方棕色較深，并且細(xì)胞外也可見到棕色。 說明在培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)中有Ⅱ型膠原表達(dá)， 即可以從細(xì)胞中分泌Ⅱ型膠原到細(xì)胞外基質(zhì)， 說明培養(yǎng)的細(xì)胞具有軟骨細(xì)胞的特征。 第1 代后細(xì)胞胞漿內(nèi)顯色明顯減弱，且陽性率逐漸降低。

圖4 各代次半月板細(xì)胞的細(xì)胞化學(xué)和免疫組化染色（×200）

3 討論

如何選擇理想的半月板組織工程種子細(xì)胞目前仍存在爭議。 目前用于組織工程半月板的種子細(xì)胞主要有自體半月板軟骨細(xì)胞、干細(xì)胞及轉(zhuǎn)基因細(xì)胞等[8,9]。干細(xì)胞如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有多項(xiàng)分化潛能， 其細(xì)胞來源充足方便、可以大量擴(kuò)增、分離培養(yǎng)相對簡單，但需要細(xì)胞因子刺激誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為纖維軟骨細(xì)胞或是在修復(fù)過程中首先形成纖維組織再轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維軟骨, 而細(xì)胞因子調(diào)控十分復(fù)雜，目前對于細(xì)胞因子的類型、劑量及其作用機(jī)理尚不十分清楚,并具有潛在的癌變可能[10]。 胚胎干細(xì)胞具有主動(dòng)性和無限增殖的能力， 有望成為組織工程半月板種子細(xì)胞的新來源， 其應(yīng)用于臨床的最大問題在于如何有效地誘導(dǎo)其向纖維軟骨細(xì)胞定向分化、有效地建立起無免疫原性的胚胎干細(xì)胞系、倫理道德方面觀念的制約、致瘤性等。自體半月板纖維軟骨細(xì)胞是目前種子細(xì)胞最佳和應(yīng)用最廣泛的細(xì)胞來源[11,12]，而分離的原代細(xì)胞培養(yǎng)無法滿足細(xì)胞數(shù)目的要求，單層培養(yǎng)半月板纖維軟骨細(xì)胞是目前用于半月板細(xì)胞擴(kuò)增最常用的手段， 要擴(kuò)增到理想的細(xì)胞數(shù)需要多次傳代,但是在體外單層培養(yǎng)系統(tǒng)中細(xì)胞表型可能會出現(xiàn)改變。本研究直接從切除的半月板獲取纖維軟骨細(xì)胞, 比較研究不同代次間半月板纖維軟骨細(xì)胞基質(zhì)蛋白表達(dá)水平和生物學(xué)特性的改變， 為構(gòu)建組織工程半月板和細(xì)胞治療中的種子細(xì)胞優(yōu)選提供了進(jìn)一步的理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。 如何使用適當(dāng)?shù)臈l件作用以促進(jìn)半月板纖維軟骨細(xì)胞有效增殖并維持其表型特征尚需進(jìn)一步研究。

半月板由半月板細(xì)胞和大量的基質(zhì)構(gòu)成， 半月板細(xì)胞包埋于基質(zhì)中。半月板細(xì)胞外基質(zhì)包括蛋白多糖，組成胞外大分子結(jié)構(gòu)如纖連蛋白和層粘連蛋白的I、III型膠原，軟骨基質(zhì)的II 型膠原[13]。對于將半月板細(xì)胞歸類于軟骨細(xì)胞還是成纖維細(xì)胞，一直存在爭議。 有研究發(fā)現(xiàn)半月板組織包含成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞和軟骨細(xì)胞兩種細(xì)胞亞型， 因此認(rèn)為將其稱為纖維軟骨細(xì)胞較為合適。形態(tài)學(xué)上，半月板細(xì)胞在單層培養(yǎng)條件下顯示三種不同的細(xì)胞類型[14]：伸長的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞、多邊形細(xì)胞和小圓的軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞。McDevitt 等[14]根據(jù)半月板細(xì)胞形態(tài)、 分布和細(xì)胞外基質(zhì)的不同將半月板細(xì)胞分為不同的細(xì)胞亞群：纖維軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞和位于淺表層區(qū)的細(xì)胞。 纖維軟骨細(xì)胞位于半月板內(nèi)側(cè)2/3 和深部， 呈圓形或橢圓形， 有活躍的分泌功能，細(xì)胞外基質(zhì)主要為Ⅰ、Ⅱ型膠原，其比例為2∶3，提供半月板的支架結(jié)構(gòu)和拉伸性能[15]，還包括蛋白多糖（半月板主要的蛋白多糖是蛋白聚糖，提供壓縮性能）；成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞位于外周1/3，該區(qū)域含少量細(xì)胞外基質(zhì)，主要為Ⅰ型膠原[16]。 Upton 等[17]利用Real-Time PCR 分子技術(shù)研究成年豬半月板組織不同區(qū)域ECM蛋白基因表達(dá)和鑒定短期（3d）單層培養(yǎng)是否能維持該表型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：半月板內(nèi)側(cè)有類似于關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)蛋白高水平的mRNA 表達(dá)， 包括蛋白聚糖，II 型膠原和NOS-2； 而外側(cè)含有與纖維組織相關(guān)聯(lián)的蛋白的高水平mRNA 表達(dá)， 包括I 型膠 原、 蛋白酶 MMP2 和MMP3；短期單層培養(yǎng)能維持這些表型。 未來的研究將集中于內(nèi)外側(cè)不同區(qū)域基因表達(dá)對損傷、 年齡和環(huán)境刺激因素的生物學(xué)改變的意義。 Verdonk 等[18]在不同條件下培養(yǎng)人半月板細(xì)胞，并用FCM 分析細(xì)胞外基質(zhì)的合成產(chǎn)量和半月板細(xì)胞膜標(biāo)記的表型鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：單層培養(yǎng)條件下細(xì)胞外基質(zhì)包含較多的Ⅰ、 Ⅱ型膠原和較低的蛋白聚糖，而在海藻酸鈉微珠（水凝膠）條件下培養(yǎng)包含較高的Ⅰ型膠原和蛋白聚糖， 較低的Ⅱ型膠原； 大部分半月板細(xì)胞膜標(biāo)記CD44+CD105+CD34-CD31-，少部分細(xì)胞CD34+CD31-主要來源于外周緣半月板有血管區(qū)。 但是這些細(xì)胞群準(zhǔn)確的細(xì)胞表型標(biāo)記尚不很清楚。

本研究結(jié)果顯示，體外單層培養(yǎng)條件下，隨著傳代的進(jìn)行，半月板纖維軟骨細(xì)胞活力逐漸下降，生長速度減慢，傳代周期延長，逐漸變?yōu)樗笮?，形態(tài)不規(guī)則。體外單層培養(yǎng)系統(tǒng)中， 半月板纖維軟骨細(xì)胞表型隨傳代的進(jìn)行， Ⅱ型膠原蛋白和蛋白聚糖的表達(dá)逐漸減少而Ⅰ型膠原表達(dá)逐漸增多， 體外單層培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的半月板纖維軟骨細(xì)胞在第5 代開始逐漸失去其特異性表型，發(fā)生去分化，逐漸變?yōu)槌衫w維細(xì)胞的表型。 體外單層分離培養(yǎng)的第5 代前的半月板細(xì)胞基本維持纖維軟骨細(xì)胞的表型和生物學(xué)特性， 可作為組織工程半月板的種子細(xì)胞。

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