朱正兵，梅澤勝

(海南靈康制藥有限公司，海南 ?？?570311)

HPLC法測(cè)定米力農(nóng)注射液中5-羥甲基糠醛的含量

朱正兵，梅澤勝

(海南靈康制藥有限公司，海南 ?？?570311)

目的 建立米力農(nóng)注射液中5-羥甲基糠醛的含量測(cè)定方法。方法高效液相色譜法，采用ODS-C18 (4.6 mm×250 mm，5μm)色譜柱，磷酸氫二鉀溶液(取磷酸氫二鉀2.7 g，加水800 ml溶解后加三乙胺2.4 ml，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至7.5)-乙腈(85：15)為流動(dòng)相，流速1.0 ml/min，檢測(cè)波長為284 nm。結(jié)果在0.003~3.103 μg/ml范圍內(nèi)5-羥甲基糠醛的峰面積與濃度具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9，平均回收率為99.50，RSD為0.98%。結(jié)論本方法準(zhǔn)確，可靠，重復(fù)性好，可作為米力農(nóng)注射液中5-羥甲基糠醛的質(zhì)量控制方法。

高效液相色譜法；米力農(nóng)注射液；5-羥甲基糠醛；含量

米力農(nóng)(Milrinone)化學(xué)名2-甲基-6-氧-1，6-二氫-[3，4'二吡啶]-5-甲腈，是人工合成的雙吡啶化合物，為非洋地黃、非兒茶酚類強(qiáng)心藥，上市的米力農(nóng)注射液有以無水葡萄糖為輔料和以氯化鈉為輔料兩種注射液。以無水葡萄糖為輔料生產(chǎn)的米力農(nóng)注射液，由于葡萄糖在高溫或弱酸性條件下脫水易生成5-羥甲基糠醛，該化合物穩(wěn)定性不好，易分解成乙酰丙酸和甲酸或發(fā)生聚合反應(yīng)，對(duì)人體橫紋肌和內(nèi)臟有損害，為全面把握藥品質(zhì)量，保證藥品的安全性，我們對(duì)米力農(nóng)注射液中的5-羥甲基糠醛進(jìn)行研究。

5-羥甲基糠醛(5-HMF)的檢查方法通常有控制溶液的顏色、紫外法、雙波長法、雜質(zhì)對(duì)照法等。由于5-HMF的最大吸收波長為284 nm，該處干擾較少，UV法?？梢宰鳛?-HMF檢查的首選方法[3]。但由于原料米力農(nóng)在284 nm也有較強(qiáng)的吸收，干擾5-HMF的檢查。因此參考文獻(xiàn)[1-2]選擇HPLC法對(duì)以葡萄糖為輔料的米力農(nóng)注射液中5-HMF進(jìn)行了質(zhì)量研究，并確定了檢查方法。

1 儀器與試藥

島津LC-20AT高效液相色譜儀，SPD-20A紫外檢測(cè)器，LC-Solution色譜工作站。5-羥甲基糠醛對(duì)照品(Sigma公司生產(chǎn)，批號(hào)：BCBF6127V，含量：99%)米力農(nóng)注射液(海南靈康制藥有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：5 ml：5 mg，批號(hào)：140601，140602，140603)

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：C18色譜柱(250×4.6 mm，5 μm，ODS2柱，依利特科技有限公司)；流動(dòng)相：磷酸氫二鉀溶液(取磷酸氫二鉀2.7 g，加水800 ml溶解后加三乙胺2.4 ml，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至7.5)-乙腈(85：15)；流速：1.0 ml/min，檢測(cè)波長為284 nm。

2.2 專屬性試驗(yàn) 以流動(dòng)相為空白溶劑；精密稱取乳酸適量，加流動(dòng)相使溶解并稀釋制成乳酸濃度為1.0 mg/ml的溶液為含乳酸空白溶液；精密稱取米力農(nóng)適量，加流動(dòng)相水浴加熱溶解并稀釋制成濃度為1.0 mg/ml的溶液為含米力農(nóng)空白溶液；精密稱取5-羥甲基糠醛對(duì)照品適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成每1 ml中約含2.5 μg的溶液為5-羥甲基糠醛定位溶液；取制備的米力農(nóng)注射液(批號(hào)：140601)為供試品溶液。取上述各溶液20 μl，注入液相色譜儀，色譜圖見圖1。結(jié)果表明，空白溶劑、乳酸和米力農(nóng)在5-羥甲基糠醛峰相應(yīng)位置無吸收峰，乳酸、米力農(nóng)、5-羥甲基糠醛峰的保留時(shí)間不同，三者峰分離很好，相互無干擾。

圖1 色譜圖

2.3 線性關(guān)系與范圍 精密稱取5-羥甲基糠醛對(duì)照品約12.5 mg，置25 ml量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取1 ml，置于100 ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液，分別精密量取貯備液(編號(hào)1、2、3、4、5、6)置于10 ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得系列溶液，精密量取各溶液20 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，5-羥甲基糠醛濃度在0.003~3.103 μg/ml濃度范圍內(nèi)，峰面積與濃度線性關(guān)系良好。

2.4 精密度試驗(yàn) 精密量取線性試驗(yàn)項(xiàng)下的貯備液5ml，置于10 ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，照上述色譜條件，精密量取20 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，重復(fù)進(jìn)樣6次的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于1%，本方法精密度試驗(yàn)良好。

表1 5-羥甲基糠醛線性關(guān)系測(cè)定結(jié)果

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取線性試驗(yàn)項(xiàng)下的貯備液5 ml，置于10 ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，照上述色譜條件，分別于0、2 h、4 h、6 h、8 h精密量取20 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見表3。結(jié)果表明：5-羥甲基糠醛溶解在流動(dòng)相中，室溫下放置8 h很穩(wěn)定(峰面積RSD為0.05%)。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 定量線的測(cè)定 在選定的色譜條件下，按信噪比為10：1對(duì)最低定量線進(jìn)行測(cè)定。取線性試驗(yàn)項(xiàng)下貯備液，將其逐級(jí)稀釋，依照上述色譜條件分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，取定量限供試品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，保留時(shí)間RSD≤2.0%，峰面積RSD≤10%。結(jié)果表明：5-羥甲基糠醛定量限為0.06 ng(0.003μg/ml× 20μl；重復(fù)進(jìn)樣6次，保留時(shí)間RSD為0.05%，峰面積RSD為7.56%)。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

2.7.1 加樣前米力農(nóng)注射液中5-羥甲基糠醛含量測(cè)定 取米力農(nóng)注射液(批號(hào)：140601)為供試液，精密稱取5-羥甲基糠醛對(duì)照品適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成每1 ml中約含2.5 μg的溶液，混勻，作為對(duì)照品溶液。分別精密量取供試液和對(duì)照品溶液各20 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算5-羥甲基糠醛的含量，結(jié)果見表4。

表4 加樣前米力農(nóng)注射液中5-羥甲基糠醛含量測(cè)定

2.7.2 加樣測(cè)定 分別精密稱取5-羥甲基糠醛對(duì)照品(約10 mg、12.5 mg、15 mg)，各3份，置于10 ml量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取1.0 ml置于25 ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為備用液。精密量取上述9份備用液各1.0 ml，分別置于25 ml量瓶中，加米力農(nóng)注射液稀釋至刻度，搖勻，濾過，作為供試品溶液。即得含5-羥甲基糠醛濃度相當(dāng)于80%、100%、120%的供試品溶液。精密量取上述供試品溶液及對(duì)照品溶液各20 μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算測(cè)得量，再計(jì)算回收率。結(jié)果表明：5-羥甲基糠醛回收率均在98.0%~102.0%之間，平均值99.5%RSD為0.98%，小于2.0%；表明本方法準(zhǔn)確度良好，誤差在充許的范圍內(nèi)，見表5。

2.7.3 三批制備樣品5-羥甲基糠醛測(cè)定 供試品溶液的制備：取制備的三批米力農(nóng)注射液，作為供試品溶液。對(duì)照品溶液的制備：精密稱取5-羥甲基糠醛對(duì)照品適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成每1 ml中約含2.5 μg的溶液，混勻，作為對(duì)照品溶液。精密量取對(duì)照品溶液和供試品溶液各20 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算本品中5-羥甲基糠醛的含量。結(jié)果表明，制備的3批米力農(nóng)注射液樣品5-羥甲基糠醛含量均小于0.025%[3](以葡萄糖計(jì))，見表6。

表5 5-羥甲基糠醛回收率試驗(yàn)結(jié)果

表6 三批米力農(nóng)注射液制備樣品中5-羥甲基糠醛含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

本文提出了以葡萄糖為輔料的米力農(nóng)注射液中葡萄糖降解產(chǎn)物5-羥甲基糠醛的含量測(cè)定方法，根據(jù)方法學(xué)研究和對(duì)樣品的檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)米力農(nóng)注射液(含葡萄糖)中5-羥甲基糠醛含量存在，為了保證產(chǎn)品質(zhì)量，可以考慮將此指標(biāo)列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

本實(shí)驗(yàn)建立了米力農(nóng)注射液(含葡萄糖)中5-羥甲基糠醛含量測(cè)定方法，文獻(xiàn)[1]報(bào)道用高效液相法測(cè)定葡萄糖注射液中5-羥甲基糠醛含量，流動(dòng)相0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液-乙腈(80：20)不能將米力農(nóng)與5-羥甲基糠醛很好的分離，為了不影響檢測(cè)結(jié)果，參考文獻(xiàn)[1]中有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)下的方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果空白溶劑無干擾、線性關(guān)系良好、重復(fù)性試驗(yàn)、回收率試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)均表明該方法良好。

[1]姚會(huì)敏,金 焱.HPLC法測(cè)定葡萄糖注射液中5-羥甲基糠醛的含量[J].黑龍江醫(yī)藥,2011,24(1)：21-23.

[2]國家藥品標(biāo)準(zhǔn).新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)(D).第73冊(cè)：105.

[3]鄧海星,蔣 煜.5-羥甲基糠醛的檢查方法及限度要求初探.國家食品藥品監(jiān)督管理總局藥品審評(píng)中心.[2005-06-22].http：//www. cde.org.cn/dzkw.do?method=largePage&id=1425.

Determination of 5-hydroxymethyfurfural in milrinone injection by HPLC.

ZHU Zheng-bing,MEI Ze-sheng. Hainan Ling Kang Pharmaceutical Co.,Ltd.,Haikou 570311,Hainan,CHINA

ObjectiveTo establish an assay for determination of 5-hydroxymethyl furfural in milrinone injection by high performance liquid chromatography(HPLC).MethodsHPLC was carried out on a ODS-C18 column(4.6 mm×250 mm,5 μm),with potassium phosphate dibasic solution-acetonitrile(85：15)as the mobile phase,the flow rate of 1.0 ml/min and the detection wavelength of 284 nm.Potassium phosphate dibasic solution was prepared by dissolving 2.7 g potassium phosphate dibasic in 800 ml water,followed by adding 2.4 ml triethylamine,which were then adjusted to pH 7.5 with phosphoric acid.ResultsThe standard curve was in good linearity in the range of 0.003~3.103 μg/ml for determination of its related substances(r=0.999 9).The average recovery was 99.45%,with RSD of 1.02%.ConclusionThe method is accurate,reliable,reproducible and can be used for quality control of 5-hydroxymethyfurfural in milrinone injection.

High performance liquid chromatography(HPLC);Milrinone injection;5-hydroxymethyl furfural;Content

R972+.1

A

1003—6350（2015）09—1373—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.09.0493

2014-10-31)

朱正兵。E-mail：13637552447@163.com