高 慧，何金花，崔美玲，劉志偉，梁紫甄

（廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 廣州 511400）

乙型肝炎病毒X基因BCP雙變異和CP聚集變異及其臨床意義

高 慧，何金花，崔美玲，劉志偉，梁紫甄

（廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 廣州 511400）

目的 探討廣州市番禺區(qū)133例乙型肝炎患者血清中HBV X基因區(qū)BCP雙變異(A1762T/G1764A)和CP聚集變異情況及其臨床意義。方法丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)采用速率法；ELISA和PCR法分別檢測(cè)HBeAg和HBV DNA拷貝數(shù)；并以PCR方法擴(kuò)增HBV X基因，再進(jìn)行測(cè)序，最后將結(jié)果分成四組(BCP雙變異、CP聚集變異、BCP雙變異合并CP聚集變異，無(wú)BCP雙變異和CP聚集變異)進(jìn)行綜合比較分析。結(jié)果(1)HBeAg陽(yáng)性在BCP雙變異組中檢出率最低(P＜0.05)；(2)四組HBV DNA拷貝數(shù)兩兩比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；BCP雙變異、CP聚集變異HBeAg陽(yáng)性組的HBV DNA拷貝數(shù)均高于HBeAg陰性組(P＜0.05)；(3)四組ALT、AST異常例數(shù)檢出率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論乙型肝炎患者常規(guī)的相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)對(duì)病情的評(píng)估尚不全面，在條件許可情況下，對(duì)HBV X基因區(qū)的BCP雙變異(A1762T/G1764A)和CP聚集變異的常見突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，并結(jié)合其他臨床資料進(jìn)行綜合分析可做出較正確的診斷。

乙型肝炎病毒；測(cè)序；X基因；BCP雙變異；CP聚集變異

乙型肝炎病毒(HBV)在我國(guó)是發(fā)病率高、感染力強(qiáng)的傳染病[1-2]，HBV X基因的3'末端有調(diào)節(jié)C基因表達(dá)的啟動(dòng)子(CP，nt1643-1849)，包含增強(qiáng)子2(EnhⅡ，nt1672-1743)和基本啟動(dòng)子(BCP，nt1742-1849)，具有廣泛的反式激活作用，在HBV的復(fù)制和表達(dá)中起重要作用[3-4]。BCP最常見的變異是A1762T和G1764A變異，這兩個(gè)點(diǎn)變異通常同時(shí)發(fā)生，被稱為雙突變，該突變已被很多文獻(xiàn)報(bào)道與肝癌有關(guān)[5-8]。增強(qiáng)子2區(qū)常見的突變點(diǎn)T1719G、A1726C、A1727T、C1730G常同時(shí)發(fā)生突變，被稱為CP聚集變異，該突變對(duì)HBV DNA轉(zhuǎn)錄有明顯激活作用[9-10]。本研究對(duì)133例HBV感染者血清X基因擴(kuò)增后進(jìn)行測(cè)序，對(duì)其中的BCP雙變異(A1762T/G1764A)和CP聚集變異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2011年6月至2013年6月本院傳染科門診及住院HBV DNA陽(yáng)性患者133例，其中乙肝攜帶者36例，慢性肝炎40例，肝硬化34例，肝癌23例；男性108例，女性25例；年齡19~78歲。所有患者均出生于廣州市番禺區(qū)，并在本區(qū)生活至今，血清收集后于-70℃凍存至檢測(cè)。

1.2 方法 HBeAg采用ELISA法，檢測(cè)試劑為上海科華生物工程股份有限公司提供；ALT及AST采用速率法，檢測(cè)試劑為上海復(fù)星長(zhǎng)征醫(yī)學(xué)有限公司提供；乙型肝炎病毒核酸FQ-PCR試劑由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供，儀器為美國(guó)ABI公司生產(chǎn)的ABI7500熒光定量PCR儀；血清HBV DNA提取采用經(jīng)典酚-氯仿抽提法。

1.3 HBV基因型序列 自美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心基因庫(kù)(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/x85254.1)中下載B及C基因型各1個(gè)。

1.4 HBV X基因擴(kuò)增 上游引物序列5'-ctaggctgtgctgccaact-3'，下游引物序列5'-ggaaaaagttgcatggtgct-3'，PCR反應(yīng)體系為ddH2O 15.3μl、10×擴(kuò)增緩沖液2.0μl、模版1.0μl、正向引物0.5μl、反向引物0.5μl、dNTP 0.5μl、TaqDNA聚合酶0.2μl、反應(yīng)總體積20μl；PCR循環(huán)參數(shù)為預(yù)變性95℃5 min；95℃45 s、60℃ 45 s、72℃ 30 s，共9個(gè)循環(huán)；95℃45 s、57℃45 s、72℃30 s，共34個(gè)循環(huán)；延伸72℃5 min。PCR產(chǎn)物送至金唯智生物科技有限公司測(cè)序部進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)B及C基因型序列均不同的堿基即為突變堿基，查找文獻(xiàn)中已發(fā)表在致病過程起作用的變異位點(diǎn)，比對(duì)后再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 將結(jié)果分成四組(BCP雙變異、CP聚集變異、BCP雙變異聯(lián)合CP聚集變異，無(wú)BCP雙變異及CP聚集變異)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。HBV DNA結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用t檢驗(yàn)，檢出率采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HBV感染者檢出BCP雙變異及CP聚集變異情況 133例HBV感染者中，BCP雙變異(A1762T/ G1764A)78例，CP聚集變異34例，BCP雙變異(A1762T/G1764A)合并CP聚集變異7例。

2.2 四組中HBeAg、HBV DNA、ALT、AST檢出情況 HBeAg陽(yáng)性者在BCP雙變異組中檢出率最低(χ2=8.068，P=0.045＜0.05)；四組HBV DNA拷貝數(shù)兩兩比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；ALT異常者檢出率在四組中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.261，P=0.738＞0.05)；AST異常者檢出率在四組中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.765，P=0.429＞0.05)，見表1。

表1BCP雙變異、CP聚集變異中HBeAg、HBV DNA、ALT、AST檢出情況

2.3 BCP雙變異、CP聚集變異的HBeAg狀態(tài)與HBV DNA的關(guān)系 BCP雙變異HBeAg陽(yáng)性組HBV DNA為(5.70±1.19)×103、HBeAg陰性組HBV DNA為(4.70±0.99)×103，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-3.955，P＜0.05)；CP聚集變異HBeAg陽(yáng)性組HBV DNA為(6.06±1.06)×103、HBeAg陰性組HBV DNA為(4.49±1.04)×103，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-4.246，P＜0.05)。

3 討論

BCP區(qū)是富含AT區(qū)域，是肝臟富含因子的獨(dú)立結(jié)合點(diǎn)，變異的BCP可改變這種結(jié)合，降低前C區(qū)的RNA轉(zhuǎn)錄，最終使HBeAg表達(dá)減少[11]。本實(shí)驗(yàn)表明，四組中BCP雙變異組的HBeAg陽(yáng)性檢出率最低，為35.9%(28/78)，與文獻(xiàn)報(bào)道吻合。HBeAg陽(yáng)性檢出率在CP聚集變異組中最高61.8%(21/34)，這似乎與文獻(xiàn)中描述CP變異阻抑了HBeAg產(chǎn)生[12]的現(xiàn)象不完全相同，可能CP聚集變異并未完全消除HBeAg的表達(dá)，也可能是本實(shí)驗(yàn)的標(biāo)本例數(shù)不夠多所導(dǎo)致，還尚待進(jìn)一步研究。在慢性HBV感染中，HBeAg是臨床表達(dá)病毒復(fù)制較實(shí)用的血清標(biāo)志物，傳統(tǒng)認(rèn)為HBeAg陰轉(zhuǎn)常標(biāo)志病變活動(dòng)性的緩解[3]，但以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HBeAg陰性未必表示病毒復(fù)制終止，病情也可能正在向惡化方向發(fā)展，尤其要引起臨床的注意。

本實(shí)驗(yàn)顯示，四組中，HBV DNA水平拷貝數(shù)兩兩比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在BCP雙變異及CP聚集變異中，HBeAg陽(yáng)性組的DNA拷貝數(shù)均高于HBeAg陰性組，提示HBV DNA水平與HBeAg陽(yáng)性關(guān)系密切，與HBV X基因是否變異關(guān)系不大，可能HBV X基因變異對(duì)病毒本身復(fù)制沒有造成影響，也可能與本實(shí)驗(yàn)標(biāo)本數(shù)量有限有關(guān)。

HBV X基因變異與血清轉(zhuǎn)氨酶(ALT、AST)的關(guān)系文獻(xiàn)報(bào)道較少，傳統(tǒng)的肝功能實(shí)驗(yàn)ALT、AST反映病變的活動(dòng)性、水平升高、病變的活動(dòng)程度，不過當(dāng)前對(duì)肝功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià)多是經(jīng)驗(yàn)性的，本文經(jīng)過統(tǒng)計(jì)后，四組中ALT、AST差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示HBV X基因變異與否對(duì)ALT、AST影響未造成差別。

綜上所述，乙型病毒性肝炎患者病情輕重是由宿主和病毒兩方面所決定，取決于本身的遺傳素質(zhì)，也與病毒的因素密切相關(guān)，僅憑傳統(tǒng)的血清學(xué)實(shí)驗(yàn)判斷病情的進(jìn)展明顯不足，條件允許的情況下，對(duì)HBV感染者的HBV X區(qū)的BCP雙變異位點(diǎn)及CP聚集變異的常見位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，可對(duì)患者病情的可能發(fā)展進(jìn)行預(yù)測(cè)并采取有效的防治措施，應(yīng)對(duì)患者長(zhǎng)期觀察，定期復(fù)查，盡量延緩病變的發(fā)展。

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Analysis and clinical significance of the BCP double mutation and CP gathered variation in hepatitis B virus X gene.

GAO Hui,HE Jin-hua,CUI Mei-ling,LIU Zhi-wei,LIANG Zi-zhen.Department of Laboratory,Panyu Central Hospital,Guangzhou 511400,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the BCP double mutation(A1762T/G1764A)and CP gathered variation of serum hepatitis B virus(HBV)X gene region and their clinical significance in 133 patients with hepatitis B from Panyu district of Guangzhou.MethodsAlanine aminotransferase(ALT),aspartate aminotransferase(AST) were tested by velocity method.ELISA and PCR were used to detect HBeAg and HBV DNA copy number respectively.The HBV X gene was amplified by PCR and then sequenced.In order to make a comprehensive comparative analysis,the results were divided into four groups：BCP double mutation,CP gathered variation,BCP double mutation merge CP gathered variation,and no mutation.Results(1)The positive rate of HBeAg in BCP double mutant group was the lowest(P＜0.05).(2)Four groups of HBV DNA copy pairwise comparisons showed no statistically significant difference(P＞0.05).The copy number of HBV DNA BCP double mutation and accumulation of CP mutation in HBeAg positive group were higher than that in HBeAg negative group(P＜0.05).(3)The abnormal rates of ALT and AST from the four groups were not statistically different(P＞0.05).ConclusionTo assess the disease of patients with hepatitis B by routine testing of the related indicators is not comprehensive.With permission,combining the common mutations of BCP double mutation(A1762T/G1764A)and CP gathered variation of HBV X gene region with clinical information can help the doctors make more accurate diagnoses.

Hepatitis B virus;Sequencing;X gene;BCP double mutation;CP gathered variation

R512.6+2

A

1003—6350（2015）09—1304—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.09.0468

2014-09-05)

廣州市番禺區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：2012-Z-03-17）

何金花。E-mail：332518579@qq.com