高 慧,何金花,崔美玲,劉志偉,梁紫甄
(廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院檢驗(yàn)科,廣東 廣州 511400)
乙型肝炎病毒X基因BCP雙變異和CP聚集變異及其臨床意義
高 慧,何金花,崔美玲,劉志偉,梁紫甄
(廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院檢驗(yàn)科,廣東 廣州 511400)
目的 探討廣州市番禺區(qū)133例乙型肝炎患者血清中HBV X基因區(qū)BCP雙變異(A1762T/G1764A)和CP聚集變異情況及其臨床意義。方法丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)采用速率法;ELISA和PCR法分別檢測(cè)HBeAg和HBV DNA拷貝數(shù);并以PCR方法擴(kuò)增HBV X基因,再進(jìn)行測(cè)序,最后將結(jié)果分成四組(BCP雙變異、CP聚集變異、BCP雙變異合并CP聚集變異,無(wú)BCP雙變異和CP聚集變異)進(jìn)行綜合比較分析。結(jié)果(1)HBeAg陽(yáng)性在BCP雙變異組中檢出率最低(P<0.05);(2)四組HBV DNA拷貝數(shù)兩兩比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);BCP雙變異、CP聚集變異HBeAg陽(yáng)性組的HBV DNA拷貝數(shù)均高于HBeAg陰性組(P<0.05);(3)四組ALT、AST異常例數(shù)檢出率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論乙型肝炎患者常規(guī)的相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)對(duì)病情的評(píng)估尚不全面,在條件許可情況下,對(duì)HBV X基因區(qū)的BCP雙變異(A1762T/G1764A)和CP聚集變異的常見突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè),并結(jié)合其他臨床資料進(jìn)行綜合分析可做出較正確的診斷。
乙型肝炎病毒;測(cè)序;X基因;BCP雙變異;CP聚集變異
乙型肝炎病毒(HBV)在我國(guó)是發(fā)病率高、感染力強(qiáng)的傳染病[1-2],HBV X基因的3'末端有調(diào)節(jié)C基因表達(dá)的啟動(dòng)子(CP,nt1643-1849),包含增強(qiáng)子2(EnhⅡ,nt1672-1743)和基本啟動(dòng)子(BCP,nt1742-1849),具有廣泛的反式激活作用,在HBV的復(fù)制和表達(dá)中起重要作用[3-4]。BCP最常見的變異是A1762T和G1764A變異,這兩個(gè)點(diǎn)變異通常同時(shí)發(fā)生,被稱為雙突變,該突變已被很多文獻(xiàn)報(bào)道與肝癌有關(guān)[5-8]。增強(qiáng)子2區(qū)常見的突變點(diǎn)T1719G、A1726C、A1727T、C1730G常同時(shí)發(fā)生突變,被稱為CP聚集變異,該突變對(duì)HBV DNA轉(zhuǎn)錄有明顯激活作用[9-10]。本研究對(duì)133例HBV感染者血清X基因擴(kuò)增后進(jìn)行測(cè)序,對(duì)其中的BCP雙變異(A1762T/G1764A)和CP聚集變異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,并探討其臨床意義。
1.1 一般資料 選擇2011年6月至2013年6月本院傳染科門診及住院HBV DNA陽(yáng)性患者133例,其中乙肝攜帶者36例,慢性肝炎40例,肝硬化34例,肝癌23例;男性108例,女性25例;年齡19~78歲。所有患者均出生于廣州市番禺區(qū),并在本區(qū)生活至今,血清收集后于-70℃凍存至檢測(cè)。
1.2 方法 HBeAg采用ELISA法,檢測(cè)試劑為上海科華生物工程股份有限公司提供;ALT及AST采用速率法,檢測(cè)試劑為上海復(fù)星長(zhǎng)征醫(yī)學(xué)有限公司提供;乙型肝炎病毒核酸FQ-PCR試劑由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供,儀器為美國(guó)ABI公司生產(chǎn)的ABI7500熒光定量PCR儀;血清HBV DNA提取采用經(jīng)典酚-氯仿抽提法。
1.3 HBV基因型序列 自美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心基因庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/x85254.1)中下載B及C基因型各1個(gè)。
1.4 HBV X基因擴(kuò)增 上游引物序列5'-ctaggctgtgctgccaact-3',下游引物序列5'-ggaaaaagttgcatggtgct-3',PCR反應(yīng)體系為ddH2O 15.3μl、10×擴(kuò)增緩沖液2.0μl、模版1.0μl、正向引物0.5μl、反向引物0.5μl、dNTP 0.5μl、TaqDNA聚合酶0.2μl、反應(yīng)總體積20μl;PCR循環(huán)參數(shù)為預(yù)變性95℃5 min;95℃45 s、60℃ 45 s、72℃ 30 s,共9個(gè)循環(huán);95℃45 s、57℃45 s、72℃30 s,共34個(gè)循環(huán);延伸72℃5 min。PCR產(chǎn)物送至金唯智生物科技有限公司測(cè)序部進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果與2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)B及C基因型序列均不同的堿基即為突變堿基,查找文獻(xiàn)中已發(fā)表在致病過程起作用的變異位點(diǎn),比對(duì)后再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 將結(jié)果分成四組(BCP雙變異、CP聚集變異、BCP雙變異聯(lián)合CP聚集變異,無(wú)BCP雙變異及CP聚集變異)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。HBV DNA結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用t檢驗(yàn),檢出率采用χ2檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 HBV感染者檢出BCP雙變異及CP聚集變異情況 133例HBV感染者中,BCP雙變異(A1762T/ G1764A)78例,CP聚集變異34例,BCP雙變異(A1762T/G1764A)合并CP聚集變異7例。
2.2 四組中HBeAg、HBV DNA、ALT、AST檢出情況 HBeAg陽(yáng)性者在BCP雙變異組中檢出率最低(χ2=8.068,P=0.045<0.05);四組HBV DNA拷貝數(shù)兩兩比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);ALT異常者檢出率在四組中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.261,P=0.738>0.05);AST異常者檢出率在四組中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.765,P=0.429>0.05),見表1。
表1BCP雙變異、CP聚集變異中HBeAg、HBV DNA、ALT、AST檢出情況
2.3 BCP雙變異、CP聚集變異的HBeAg狀態(tài)與HBV DNA的關(guān)系 BCP雙變異HBeAg陽(yáng)性組HBV DNA為(5.70±1.19)×103、HBeAg陰性組HBV DNA為(4.70±0.99)×103,兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-3.955,P<0.05);CP聚集變異HBeAg陽(yáng)性組HBV DNA為(6.06±1.06)×103、HBeAg陰性組HBV DNA為(4.49±1.04)×103,兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-4.246,P<0.05)。
BCP區(qū)是富含AT區(qū)域,是肝臟富含因子的獨(dú)立結(jié)合點(diǎn),變異的BCP可改變這種結(jié)合,降低前C區(qū)的RNA轉(zhuǎn)錄,最終使HBeAg表達(dá)減少[11]。本實(shí)驗(yàn)表明,四組中BCP雙變異組的HBeAg陽(yáng)性檢出率最低,為35.9%(28/78),與文獻(xiàn)報(bào)道吻合。HBeAg陽(yáng)性檢出率在CP聚集變異組中最高61.8%(21/34),這似乎與文獻(xiàn)中描述CP變異阻抑了HBeAg產(chǎn)生[12]的現(xiàn)象不完全相同,可能CP聚集變異并未完全消除HBeAg的表達(dá),也可能是本實(shí)驗(yàn)的標(biāo)本例數(shù)不夠多所導(dǎo)致,還尚待進(jìn)一步研究。在慢性HBV感染中,HBeAg是臨床表達(dá)病毒復(fù)制較實(shí)用的血清標(biāo)志物,傳統(tǒng)認(rèn)為HBeAg陰轉(zhuǎn)常標(biāo)志病變活動(dòng)性的緩解[3],但以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,HBeAg陰性未必表示病毒復(fù)制終止,病情也可能正在向惡化方向發(fā)展,尤其要引起臨床的注意。
本實(shí)驗(yàn)顯示,四組中,HBV DNA水平拷貝數(shù)兩兩比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,在BCP雙變異及CP聚集變異中,HBeAg陽(yáng)性組的DNA拷貝數(shù)均高于HBeAg陰性組,提示HBV DNA水平與HBeAg陽(yáng)性關(guān)系密切,與HBV X基因是否變異關(guān)系不大,可能HBV X基因變異對(duì)病毒本身復(fù)制沒有造成影響,也可能與本實(shí)驗(yàn)標(biāo)本數(shù)量有限有關(guān)。
HBV X基因變異與血清轉(zhuǎn)氨酶(ALT、AST)的關(guān)系文獻(xiàn)報(bào)道較少,傳統(tǒng)的肝功能實(shí)驗(yàn)ALT、AST反映病變的活動(dòng)性、水平升高、病變的活動(dòng)程度,不過當(dāng)前對(duì)肝功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià)多是經(jīng)驗(yàn)性的,本文經(jīng)過統(tǒng)計(jì)后,四組中ALT、AST差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示HBV X基因變異與否對(duì)ALT、AST影響未造成差別。
綜上所述,乙型病毒性肝炎患者病情輕重是由宿主和病毒兩方面所決定,取決于本身的遺傳素質(zhì),也與病毒的因素密切相關(guān),僅憑傳統(tǒng)的血清學(xué)實(shí)驗(yàn)判斷病情的進(jìn)展明顯不足,條件允許的情況下,對(duì)HBV感染者的HBV X區(qū)的BCP雙變異位點(diǎn)及CP聚集變異的常見位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè),可對(duì)患者病情的可能發(fā)展進(jìn)行預(yù)測(cè)并采取有效的防治措施,應(yīng)對(duì)患者長(zhǎng)期觀察,定期復(fù)查,盡量延緩病變的發(fā)展。
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Analysis and clinical significance of the BCP double mutation and CP gathered variation in hepatitis B virus X gene.
GAO Hui,HE Jin-hua,CUI Mei-ling,LIU Zhi-wei,LIANG Zi-zhen.Department of Laboratory,Panyu Central Hospital,Guangzhou 511400,Guangdong,CHINA
ObjectiveTo investigate the BCP double mutation(A1762T/G1764A)and CP gathered variation of serum hepatitis B virus(HBV)X gene region and their clinical significance in 133 patients with hepatitis B from Panyu district of Guangzhou.MethodsAlanine aminotransferase(ALT),aspartate aminotransferase(AST) were tested by velocity method.ELISA and PCR were used to detect HBeAg and HBV DNA copy number respectively.The HBV X gene was amplified by PCR and then sequenced.In order to make a comprehensive comparative analysis,the results were divided into four groups:BCP double mutation,CP gathered variation,BCP double mutation merge CP gathered variation,and no mutation.Results(1)The positive rate of HBeAg in BCP double mutant group was the lowest(P<0.05).(2)Four groups of HBV DNA copy pairwise comparisons showed no statistically significant difference(P>0.05).The copy number of HBV DNA BCP double mutation and accumulation of CP mutation in HBeAg positive group were higher than that in HBeAg negative group(P<0.05).(3)The abnormal rates of ALT and AST from the four groups were not statistically different(P>0.05).ConclusionTo assess the disease of patients with hepatitis B by routine testing of the related indicators is not comprehensive.With permission,combining the common mutations of BCP double mutation(A1762T/G1764A)and CP gathered variation of HBV X gene region with clinical information can help the doctors make more accurate diagnoses.
Hepatitis B virus;Sequencing;X gene;BCP double mutation;CP gathered variation
R512.6+2
A
1003—6350(2015)09—1304—03
10.3969/j.issn.1003-6350.2015.09.0468
2014-09-05)
廣州市番禺區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào):2012-Z-03-17)
何金花。E-mail:332518579@qq.com