高 慧,何金花,崔美玲,劉志偉,梁紫甄
(廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院檢驗科,廣東 廣州 511400)
乙型肝炎病毒X基因BCP雙變異和CP聚集變異及其臨床意義
高 慧,何金花,崔美玲,劉志偉,梁紫甄
(廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院檢驗科,廣東 廣州 511400)
目的 探討廣州市番禺區(qū)133例乙型肝炎患者血清中HBV X基因區(qū)BCP雙變異(A1762T/G1764A)和CP聚集變異情況及其臨床意義。方法丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)采用速率法;ELISA和PCR法分別檢測HBeAg和HBV DNA拷貝數(shù);并以PCR方法擴增HBV X基因,再進行測序,最后將結果分成四組(BCP雙變異、CP聚集變異、BCP雙變異合并CP聚集變異,無BCP雙變異和CP聚集變異)進行綜合比較分析。結果(1)HBeAg陽性在BCP雙變異組中檢出率最低(P<0.05);(2)四組HBV DNA拷貝數(shù)兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05);BCP雙變異、CP聚集變異HBeAg陽性組的HBV DNA拷貝數(shù)均高于HBeAg陰性組(P<0.05);(3)四組ALT、AST異常例數(shù)檢出率差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論乙型肝炎患者常規(guī)的相關指標檢測對病情的評估尚不全面,在條件許可情況下,對HBV X基因區(qū)的BCP雙變異(A1762T/G1764A)和CP聚集變異的常見突變位點進行檢測,并結合其他臨床資料進行綜合分析可做出較正確的診斷。
乙型肝炎病毒;測序;X基因;BCP雙變異;CP聚集變異
乙型肝炎病毒(HBV)在我國是發(fā)病率高、感染力強的傳染病[1-2],HBV X基因的3'末端有調節(jié)C基因表達的啟動子(CP,nt1643-1849),包含增強子2(EnhⅡ,nt1672-1743)和基本啟動子(BCP,nt1742-1849),具有廣泛的反式激活作用,在HBV的復制和表達中起重要作用[3-4]。BCP最常見的變異是A1762T和G1764A變異,這兩個點變異通常同時發(fā)生,被稱為雙突變,該突變已被很多文獻報道與肝癌有關[5-8]。增強子2區(qū)常見的突變點T1719G、A1726C、A1727T、C1730G常同時發(fā)生突變,被稱為CP聚集變異,該突變對HBV DNA轉錄有明顯激活作用[9-10]。本研究對133例HBV感染者血清X基因擴增后進行測序,對其中的BCP雙變異(A1762T/G1764A)和CP聚集變異進行統(tǒng)計分析,并探討其臨床意義。
1.1 一般資料 選擇2011年6月至2013年6月本院傳染科門診及住院HBV DNA陽性患者133例,其中乙肝攜帶者36例,慢性肝炎40例,肝硬化34例,肝癌23例;男性108例,女性25例;年齡19~78歲。所有患者均出生于廣州市番禺區(qū),并在本區(qū)生活至今,血清收集后于-70℃凍存至檢測。
1.2 方法 HBeAg采用ELISA法,檢測試劑為上??迫A生物工程股份有限公司提供;ALT及AST采用速率法,檢測試劑為上海復星長征醫(yī)學有限公司提供;乙型肝炎病毒核酸FQ-PCR試劑由中山大學達安基因股份有限公司提供,儀器為美國ABI公司生產的ABI7500熒光定量PCR儀;血清HBV DNA提取采用經典酚-氯仿抽提法。
1.3 HBV基因型序列 自美國國立生物技術信息中心基因庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/x85254.1)中下載B及C基因型各1個。
1.4 HBV X基因擴增 上游引物序列5'-ctaggctgtgctgccaact-3',下游引物序列5'-ggaaaaagttgcatggtgct-3',PCR反應體系為ddH2O 15.3μl、10×擴增緩沖液2.0μl、模版1.0μl、正向引物0.5μl、反向引物0.5μl、dNTP 0.5μl、TaqDNA聚合酶0.2μl、反應總體積20μl;PCR循環(huán)參數(shù)為預變性95℃5 min;95℃45 s、60℃ 45 s、72℃ 30 s,共9個循環(huán);95℃45 s、57℃45 s、72℃30 s,共34個循環(huán);延伸72℃5 min。PCR產物送至金唯智生物科技有限公司測序部進行測序,測序結果與2個標準B及C基因型序列均不同的堿基即為突變堿基,查找文獻中已發(fā)表在致病過程起作用的變異位點,比對后再進行統(tǒng)計分析。
1.5 統(tǒng)計學方法 將結果分成四組(BCP雙變異、CP聚集變異、BCP雙變異聯(lián)合CP聚集變異,無BCP雙變異及CP聚集變異)進行統(tǒng)計,應用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學處理。HBV DNA結果以均數(shù)±標準差(±s)表示,采用t檢驗,檢出率采用χ2檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 HBV感染者檢出BCP雙變異及CP聚集變異情況 133例HBV感染者中,BCP雙變異(A1762T/ G1764A)78例,CP聚集變異34例,BCP雙變異(A1762T/G1764A)合并CP聚集變異7例。
2.2 四組中HBeAg、HBV DNA、ALT、AST檢出情況 HBeAg陽性者在BCP雙變異組中檢出率最低(χ2=8.068,P=0.045<0.05);四組HBV DNA拷貝數(shù)兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05);ALT異常者檢出率在四組中差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.261,P=0.738>0.05);AST異常者檢出率在四組中差異無統(tǒng)計學意義(χ2=2.765,P=0.429>0.05),見表1。
表1BCP雙變異、CP聚集變異中HBeAg、HBV DNA、ALT、AST檢出情況
2.3 BCP雙變異、CP聚集變異的HBeAg狀態(tài)與HBV DNA的關系 BCP雙變異HBeAg陽性組HBV DNA為(5.70±1.19)×103、HBeAg陰性組HBV DNA為(4.70±0.99)×103,兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(t=-3.955,P<0.05);CP聚集變異HBeAg陽性組HBV DNA為(6.06±1.06)×103、HBeAg陰性組HBV DNA為(4.49±1.04)×103,兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(t=-4.246,P<0.05)。
BCP區(qū)是富含AT區(qū)域,是肝臟富含因子的獨立結合點,變異的BCP可改變這種結合,降低前C區(qū)的RNA轉錄,最終使HBeAg表達減少[11]。本實驗表明,四組中BCP雙變異組的HBeAg陽性檢出率最低,為35.9%(28/78),與文獻報道吻合。HBeAg陽性檢出率在CP聚集變異組中最高61.8%(21/34),這似乎與文獻中描述CP變異阻抑了HBeAg產生[12]的現(xiàn)象不完全相同,可能CP聚集變異并未完全消除HBeAg的表達,也可能是本實驗的標本例數(shù)不夠多所導致,還尚待進一步研究。在慢性HBV感染中,HBeAg是臨床表達病毒復制較實用的血清標志物,傳統(tǒng)認為HBeAg陰轉常標志病變活動性的緩解[3],但以上實驗結果表明,HBeAg陰性未必表示病毒復制終止,病情也可能正在向惡化方向發(fā)展,尤其要引起臨床的注意。
本實驗顯示,四組中,HBV DNA水平拷貝數(shù)兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義,在BCP雙變異及CP聚集變異中,HBeAg陽性組的DNA拷貝數(shù)均高于HBeAg陰性組,提示HBV DNA水平與HBeAg陽性關系密切,與HBV X基因是否變異關系不大,可能HBV X基因變異對病毒本身復制沒有造成影響,也可能與本實驗標本數(shù)量有限有關。
HBV X基因變異與血清轉氨酶(ALT、AST)的關系文獻報道較少,傳統(tǒng)的肝功能實驗ALT、AST反映病變的活動性、水平升高、病變的活動程度,不過當前對肝功能實驗結果評價多是經驗性的,本文經過統(tǒng)計后,四組中ALT、AST差異均無統(tǒng)計學意義,提示HBV X基因變異與否對ALT、AST影響未造成差別。
綜上所述,乙型病毒性肝炎患者病情輕重是由宿主和病毒兩方面所決定,取決于本身的遺傳素質,也與病毒的因素密切相關,僅憑傳統(tǒng)的血清學實驗判斷病情的進展明顯不足,條件允許的情況下,對HBV感染者的HBV X區(qū)的BCP雙變異位點及CP聚集變異的常見位點進行檢測,可對患者病情的可能發(fā)展進行預測并采取有效的防治措施,應對患者長期觀察,定期復查,盡量延緩病變的發(fā)展。
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Analysis and clinical significance of the BCP double mutation and CP gathered variation in hepatitis B virus X gene.
GAO Hui,HE Jin-hua,CUI Mei-ling,LIU Zhi-wei,LIANG Zi-zhen.Department of Laboratory,Panyu Central Hospital,Guangzhou 511400,Guangdong,CHINA
ObjectiveTo investigate the BCP double mutation(A1762T/G1764A)and CP gathered variation of serum hepatitis B virus(HBV)X gene region and their clinical significance in 133 patients with hepatitis B from Panyu district of Guangzhou.MethodsAlanine aminotransferase(ALT),aspartate aminotransferase(AST) were tested by velocity method.ELISA and PCR were used to detect HBeAg and HBV DNA copy number respectively.The HBV X gene was amplified by PCR and then sequenced.In order to make a comprehensive comparative analysis,the results were divided into four groups:BCP double mutation,CP gathered variation,BCP double mutation merge CP gathered variation,and no mutation.Results(1)The positive rate of HBeAg in BCP double mutant group was the lowest(P<0.05).(2)Four groups of HBV DNA copy pairwise comparisons showed no statistically significant difference(P>0.05).The copy number of HBV DNA BCP double mutation and accumulation of CP mutation in HBeAg positive group were higher than that in HBeAg negative group(P<0.05).(3)The abnormal rates of ALT and AST from the four groups were not statistically different(P>0.05).ConclusionTo assess the disease of patients with hepatitis B by routine testing of the related indicators is not comprehensive.With permission,combining the common mutations of BCP double mutation(A1762T/G1764A)and CP gathered variation of HBV X gene region with clinical information can help the doctors make more accurate diagnoses.
Hepatitis B virus;Sequencing;X gene;BCP double mutation;CP gathered variation
R512.6+2
A
1003—6350(2015)09—1304—03
10.3969/j.issn.1003-6350.2015.09.0468
2014-09-05)
廣州市番禺區(qū)科技計劃項目(編號:2012-Z-03-17)
何金花。E-mail:332518579@qq.com