李 玲，李從榮

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 武漢 430060)

膠乳增強(qiáng)免疫透射比濁法測(cè)定NGAL的性能評(píng)價(jià)

李 玲，李從榮

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 武漢 430060)

目的 評(píng)價(jià)膠乳增強(qiáng)免疫透射比濁法商品化試劑盒測(cè)定中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)的性能。方法分析商品化NGAL膠乳增強(qiáng)免疫透射比濁法試劑盒在全自動(dòng)生化分析儀上檢測(cè)的精密度、準(zhǔn)確度、線性、抗干擾能力和比對(duì)實(shí)驗(yàn)等性能。結(jié)果檢測(cè)的準(zhǔn)確度較好，批內(nèi)精密度(CV)≤10%，批間精密度(CV)≤15%，NGAL濃度在25～2 565 ng/ml范圍內(nèi)，理論值與實(shí)測(cè)值均呈線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r≥0.990；檢測(cè)不同濃度干擾物（甘油三酯、膽紅素、血紅蛋白、抗壞血酸）時(shí)，其干擾程度≤10%，NGAL試劑盒的檢測(cè)結(jié)果均不受影響。兩個(gè)不同全自動(dòng)生化分析儀廠家間比較，相關(guān)系數(shù)為0.996，線性回歸方程為y=0.994x-5.388，預(yù)期偏差可接受。結(jié)論該商品化NGAL試劑盒的準(zhǔn)確度、精密度、線性范圍和抗干擾能力均良好，可批量測(cè)定，且快速、操作方便、簡(jiǎn)單，可作為臨床常規(guī)NGAL測(cè)定方法使用。

膠乳增強(qiáng)免疫透射比濁法；中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白；性能；評(píng)價(jià)

中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(Neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)是載脂蛋白家族成員之一，屬于脂質(zhì)運(yùn)載蛋白超家族[1]。NGAL早期檢測(cè)主要采用免疫組化SP法和酶聯(lián)免疫吸附法，限制了其在臨床的常規(guī)應(yīng)用。本試驗(yàn)采用國(guó)產(chǎn)商品化試劑盒和日本進(jìn)口全自動(dòng)生化分析儀，用膠乳增強(qiáng)免疫比濁法定量檢測(cè)NGAL，旨在評(píng)價(jià)NGAL檢測(cè)方法的性能，為其臨床應(yīng)用提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 東芝全自動(dòng)生化分析儀、日立全自動(dòng)生化分析儀、武漢市長(zhǎng)立生物技術(shù)有限責(zé)任公司NGAL試劑、質(zhì)控品、校準(zhǔn)品。

1.2 研究對(duì)象 收集本院門診100例患者新鮮血清，男性58例，女性42例，年齡10～65歲。收集的血清標(biāo)本均無溶血、黃疸和脂血。分裝好后置-20℃冷凍保存，血清標(biāo)本在復(fù)溶后24 h內(nèi)檢測(cè)。

1.3 標(biāo)本采集 于清晨采集研究對(duì)象空腹靜脈血5 ml，15～20 min待血液完全凝固后3 500 r/min離心5 min后分離血清。

1.4 方法

1.4.1 NGAL檢測(cè)原理 標(biāo)本中的NGAL與試劑中的NGAL抗體膠乳顆粒反應(yīng)，產(chǎn)生凝集以致濁度上升，該濁度高低與NGAL濃度呈正比。通過測(cè)定特定波長(zhǎng)的吸光度值變化，參照校準(zhǔn)曲線即可計(jì)算出血清中NGAL的含量。

1.4.2 NGAL濃度的檢測(cè)方法 按試劑生產(chǎn)廠家提供的上機(jī)參數(shù)進(jìn)行設(shè)置并定標(biāo)，待定標(biāo)通過后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4.3 精密度驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 參考CLSI文件EP5-A2[2]，實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的準(zhǔn)備：收集健康人新鮮混合血清和不同濃度的NGAL血清標(biāo)本，配制成所需要的濃度：高濃度(1 275 ng/ml，H)、中濃度(733 ng/ml，M)、低濃度(98 ng/ml，L)各30套(每套分裝300 μl)，-20℃冷凍保存。批內(nèi)精密度測(cè)定：取高、中、低值三個(gè)不同濃度的血清各一份，分別用試劑盒校準(zhǔn)，當(dāng)天每隔1 h測(cè)定一次，重復(fù)測(cè)定20次，計(jì)算平均值(Mean)、標(biāo)準(zhǔn)差(S)和變異系數(shù)(CV)。批間精密度測(cè)定：用試劑盒單次校準(zhǔn)后，每天分別測(cè)定一次高、中、低值三個(gè)不同濃度的血清，共20 d，計(jì)算Mean、S和CV。

1.4.4 準(zhǔn)確度驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 用批號(hào)為14-0121P的校準(zhǔn)品校準(zhǔn)檢測(cè)系統(tǒng)后，對(duì)同一批號(hào)和不同批號(hào)(15-0130)校準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，各重復(fù)測(cè)定3次，分別計(jì)算平均值、絕對(duì)偏差和相對(duì)偏差。

1.4.5 線性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 參考CLSI文件EP6-A[3]，取高值標(biāo)本(2 565 ng/ml)和低值標(biāo)本(25 ng/ml)等量混勻后制備中值標(biāo)本(1 295 ng/ml)，中值標(biāo)本再分別與低、高值標(biāo)本等量混勻，得兩個(gè)不同濃度水平的標(biāo)本(660 ng/ml、1 930 ng/ml)，5個(gè)不同濃度水平的標(biāo)本(25 ng/ml、660 ng/ml、1 295 ng/ml、1 930 ng/ml、2 565 ng/ml)分別重復(fù)測(cè)定4次后求平均值。參考CLSI文件EP6-A進(jìn)行線性分析。

1.4.6 干擾驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 臨床化學(xué)實(shí)驗(yàn)室中常見的干擾來自于血清標(biāo)本，標(biāo)本的脂血、黃疸、溶血和抗壞血酸是最常見的干擾因素。本實(shí)驗(yàn)選取NGAL為98 ng/ml和1 275 ng/ml的兩個(gè)濃度水平標(biāo)本作為基礎(chǔ)標(biāo)本。其中將干擾物質(zhì)與基礎(chǔ)標(biāo)本按不同比例混合，使其甘油三酯系列干擾濃度為：2 mmol/L、4 mmol/L、6 mmol/L、8 mmol/L、10 mmol/L；膽紅素系列干擾濃度為：100 μmol/L、200 μmol/L、300 μmol/L、400 μmol/L、500 μmol/L；血紅蛋白系列干擾濃度為：1.0 g/L、2.0 g/L、3.0 g/L、4.0 g/L、5.0 g/L；抗壞血酸系列干擾濃度為：300 μmol/L、600 μmol/L、900 μmol/L、1 200 μmol/L、1 500 μmol/L。將等體積的生理鹽水加入混合血清中，作為無干擾血清，同時(shí)測(cè)定NGAL濃度各10次，分別取均值，干擾值=各組均值-未加干擾物相應(yīng)的均值。按CLSI文件EP7-A2[4]進(jìn)行干擾試驗(yàn)評(píng)價(jià)。

1.4.7 比對(duì)實(shí)驗(yàn) 參考CLSI文件EP9-A2[5]，每天檢測(cè)8份臨床患者新鮮標(biāo)本并編號(hào)，按照1→8和8→1的順序分別在東芝全自動(dòng)生化分析儀和日立全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行檢測(cè)，連續(xù)檢測(cè)5 d，分別求其均值。組內(nèi)離群值檢查：以絕對(duì)差值均值的4倍作為每個(gè)檢測(cè)方法的“可接受”限，以相對(duì)差值均值的4倍作為標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)界限，如果有一個(gè)值超過上述“可接受”限或相對(duì)范圍的檢測(cè)界限，檢查原因，并從數(shù)據(jù)組中刪除此值。從數(shù)據(jù)中刪除的離群值不得超過一個(gè)。數(shù)據(jù)作圖：以日立全自動(dòng)生化分析儀的結(jié)果為X軸，以東芝全自動(dòng)生化分析儀結(jié)果為Y軸作散點(diǎn)圖。計(jì)算NGAL在兩個(gè)醫(yī)學(xué)決定水平(Xc=100 ng/ml、200 ng/ml)的預(yù)期偏差Bc和預(yù)期偏差95%的可信區(qū)間，預(yù)期偏差Bc公式為Bc=a+(b-1)Xc。以1/2CLIA’88允許誤差作為臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算醫(yī)學(xué)決定水平(Xc)的允許誤差，評(píng)判偏差是否可接受。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析。線性范圍實(shí)驗(yàn)的相關(guān)性采用曲線擬合(Curve estimation)，回歸方程用線性回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 精密度實(shí)驗(yàn) 不同濃度水平血清的CV在0.82%～3.54%，CV在2.34%～4.27%，與廠家聲明的批內(nèi)精密度和批間精密度一致，見表1和表2。

表1 NGAL批內(nèi)精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 NGAL批間精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn) 兩個(gè)不同批號(hào)校準(zhǔn)品的測(cè)定均值和靶值的相對(duì)偏差在2.16%～4.33%，與廠家聲明的準(zhǔn)確度一致，見表3。

2.3 線性實(shí)驗(yàn) NGAL線性回歸方程為y= 0.991x-10.49，r=0.999 2，NGAL在25～2 565 ng/ml范圍內(nèi)呈良好線性，偏倚較小，能滿足臨床需要。

2.4 干擾實(shí)驗(yàn) 甘油三酯≤10 mmol/L，血紅蛋白≤5.0 g/L，抗壞血酸≤1 500 μmol/L，膽紅素≤500 μmol/L時(shí)，試劑盒測(cè)定NGAL的結(jié)果未受到干擾。

2.5 比對(duì)實(shí)驗(yàn) 兩個(gè)系統(tǒng)內(nèi)和系統(tǒng)間均無離群點(diǎn)；繪制日立生化分析儀和東芝生化分析儀兩個(gè)系統(tǒng)測(cè)定NGAL的散點(diǎn)圖(見圖1)。兩個(gè)系統(tǒng)的相關(guān)性較好，相關(guān)系數(shù)r2為0.996，線性回歸方程為Y= 0.994x-5.388。偏差：醫(yī)學(xué)決定水平(100 ng/ml、200 ng/ml)的預(yù)期偏差分別為4.8和4.2，預(yù)期偏差的95%可信區(qū)間分別為94.3～105.7和191.3～207.1，允許誤差為10%。允許誤差大于預(yù)期偏差的95%可信區(qū)間的上限，偏差可以接受。

表3 NGAL準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1 東芝生化分析儀均值對(duì)日立生化分析儀均值的散點(diǎn)圖

3 討論

目前，我們已知的NGAL功能可能與免疫炎癥反應(yīng)[6-7]、腫瘤發(fā)生發(fā)展[8-10]以及腎臟發(fā)育有關(guān)[11]。大量研究證實(shí)NGAL是早期檢測(cè)急、慢性腎功能損傷的重要指標(biāo)[12-15]，也是診斷急性腎損傷的最有效生物學(xué)標(biāo)志之一[16]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)NGAL和中性粒細(xì)胞相關(guān)載脂蛋白膜受體(Neutrophil gelatinase-associated lipocalin receptor，NGALR)的表達(dá)與結(jié)直腸癌的發(fā)生、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移相關(guān)，可輔助臨床診斷，并有可能成為結(jié)直腸癌臨床治療的新靶點(diǎn)[17]。另外研究發(fā)現(xiàn)妊娠期高血壓患者血液中NGAL的含量較正常孕婦也出現(xiàn)顯著升高[18]。NGAL新的臨床意義正在不斷被發(fā)現(xiàn)，因此，NGAL的檢測(cè)方法及其性能指標(biāo)十分重要。

精密度和準(zhǔn)確度是反映檢測(cè)系統(tǒng)的重要性能指標(biāo)，其中良好的精密度是進(jìn)行其他性能指標(biāo)實(shí)驗(yàn)的前提。根據(jù)CLSI文件EP5-A2評(píng)價(jià)方案的實(shí)驗(yàn)結(jié)果確認(rèn)，NGAL的批內(nèi)精密度和批間精密度均可接受；在此基礎(chǔ)上進(jìn)行準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)，采用兩個(gè)不同批號(hào)NGAL校準(zhǔn)品評(píng)價(jià)檢測(cè)系統(tǒng)的準(zhǔn)確度，兩個(gè)不同批號(hào)校準(zhǔn)品的驗(yàn)證值與靶值的相對(duì)偏差在2.16%～4.33%，可接受。線性驗(yàn)證顯示NGAL在25～2 565 ng/ml范圍內(nèi)呈良好線性；血清標(biāo)本中甘油三酯濃度≤10 mmol/L、膽紅素濃度≤500 μmol/L、血紅蛋白濃度≤5.0 g/L、抗壞血酸濃度≤1 500 μmol/L時(shí)，NGAL結(jié)果未受到干擾；東芝全自動(dòng)生化分析儀與日立全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)同一商品化NGAL試劑相關(guān)性較好，相關(guān)系數(shù)r2=0.996。

綜上所述，膠乳增強(qiáng)免疫透射比濁法試劑盒測(cè)定NGAL的性能較好，在全自動(dòng)生化分析儀上可批量檢測(cè)、速度快、樣品用量少、操作方便、簡(jiǎn)單，可作為臨床常規(guī)的NGAL檢測(cè)方法使用。

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Evaluation of the performance of latex-enhanced immunoturbidimetric assay for neutrophil gelatinase-associated lipocalin.

LI Ling,LI Cong-rong.Department of Clinical Laboratory,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,Hubei,CHINA

ObjectiveTo evaluate the performance of latex-enhanced immunoturbidimetric assay in the determination of neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL).MethodsThe precision,accuracy,linearity and anti-jamming performances were evaluated during the tests on a fully automatic biochemical analyzer with the commercialized kit of latex-enhanced immunoturbidimetric assay for NGAL.ResultsA good accuracy was obtained, with the intra specific variation coefficient(CV)of≤10%and the inter specific variation coefficient(CV)of≤15%. The measured values were linearly related to the theoretical values when the concentrations of NGAL were in the range of 25～2 565 ng/ml(r≥0.990).It was observed that the interfering components had no impact on the test results from NGAL kits when different concentrations of the interfering components(such as triglycerides,bilirubin,hemoglobin,ascorbic acid)were presented in the test,with the degree of interference≤10%.Comparison between two different automatic biochemical analyzer manufacturer showedr2=0.996,y=0.994x-5.388.The bias was acceptable between the two systems.ConclusionThe accuracy,precision,linearity and anti-interference ability of commercialized kit for NGAL evaluation are excellent.The kit is suitable for a great quantity samples analyzing,and the assay is fast,simple,and can be easily operated,which can be used as a routine clinical method for NGAL determination.

Latex-enhanced immunoturbidimetric assay;Neutrophil gelatinase-associated lipocalin;Performance;Evaluation

R446.61

A

1003—6350（2015）19—2882—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.19.1048

2015-03-16)

李從榮。E-mail：115099473@qq.com