楊靜，王永，葉川，張俊標，楊龍，孫博，劉琴，馬敏先

(1.貴陽醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽550004；2.貴陽醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院，貴州貴陽550004；3.貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨科，貴州貴陽550004)

電紡殼聚糖與聚乙烯醇纖維膜的生物相容性研究

楊靜1，王永2，葉川3，張俊標1，楊龍1，孫博1，劉琴1，馬敏先2

(1.貴陽醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽550004；2.貴陽醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院，貴州貴陽550004；3.貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨科，貴州貴陽550004)

目的制備殼聚糖與聚乙烯醇纖維膜并研究其體外的生物相容性，為應(yīng)用于臨床提供一定的理論依據(jù)。方法利用靜電紡絲技術(shù)制備殼聚糖與聚乙烯醇纖維膜，通過掃描電子顯微鏡對其超微結(jié)構(gòu)進行表征，采用溶血實驗和細胞毒性實驗評價其體外生物相容性。結(jié)果通過電紡制備的殼聚糖與聚乙烯醇纖維膜，質(zhì)地均勻，伴有少量的珠狀結(jié)構(gòu)，纖維直徑在60～300 nm之間，溶血實驗顯示溶血率為2.80%，無溶血作用，細胞毒性實驗中，纖維膜的細胞增殖度為89.96%，細胞毒性為1級，評分合格，無細胞毒性。結(jié)論通過靜電紡絲法可成功制備殼聚糖與聚乙烯醇纖維膜，生物相容性較好，有望應(yīng)用于口腔臨床中。

靜電紡絲；殼聚糖；聚乙烯醇；生物相容性

殼聚糖常存在于蝦、蟹的甲殼中，是甲殼素的一種衍生物，也是自然界僅有的帶正電荷的天然多糖，其生物相容性好，可降解吸收，具有特別的生物學(xué)活性[1]，廣泛應(yīng)用于皮膚的敷料、止血材料、藥物緩釋和組織工程支架等領(lǐng)域[2]。

聚乙烯醇是一種無毒、可降解、有生物親和性的水溶性高分子，具有成膜性好、無刺激性等優(yōu)點，是一種很好的生物醫(yī)用高分子材料，單純的殼聚糖不能單獨紡絲，但是與聚乙烯醇共混以后，可以通過分子間相互的作用，削弱氨基的作用，改善殼聚糖的紡絲性能，從而可以制備較好的纖維。

靜電紡絲(以下叫電紡)技術(shù)是新發(fā)展的一項技術(shù)，其制作出的纖維，直徑可以達到納米的級別，具有較高的孔隙率，極大的比表面積，與天然的細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)相仿，能夠滿足細胞的生長、粘附等要求，Dai等[3]認為納米纖維更有利于細胞的生長。

近年來，種植牙技術(shù)發(fā)展迅速，在種植術(shù)中，骨量充足成為種植牙成功的關(guān)鍵，引導(dǎo)骨組織再生技術(shù)(GBR)可以促進骨的修復(fù)與形成，其中膜是引導(dǎo)骨組織再生技術(shù)中關(guān)鍵的因素，GBR膜的研究為骨組織再生提供了新的技術(shù)，已被實驗及臨床證實可以解決骨量不足的問題[3]，GBR膜分為可吸收與不可吸收膜，不可吸收膜具有很好的機械性能，但容易暴露導(dǎo)致感染，可吸收膜易塌陷。本課題采用電紡技術(shù)，以鈦網(wǎng)作為接收裝置，制備殼聚糖與聚乙烯醇復(fù)合雙層纖維膜，結(jié)合可吸收膜與不可吸收膜的優(yōu)點，解決可吸收膜易塌陷及不可吸收膜易暴露的缺點，本實驗為前期階段，探討所制備的殼聚糖與聚乙烯醇纖維膜的體外生物相容性。

1 材料與方法

1.1 主要材料與設(shè)備靜電紡絲機(清華大學(xué)提供)，MTS試劑(Promega公司)；掃描電子顯微鏡；酶標儀。

1.2 方法

1.2.1 殼聚糖與聚乙烯醇纖維膜的制備將殼聚糖溶液與聚乙烯醇溶液混合，靜置過夜，常溫保存待用，將裝有兩種混合液的注射器放入注射泵中，調(diào)節(jié)電壓至14 kV，推注速度為0.1 ml/min，接收距離設(shè)置為20 cm，用錫箔紙來接收纖維膜。

1.2.2 殼聚糖與聚乙烯醇纖維膜的掃描電子顯微鏡掃描電子顯微鏡下觀察其纖維形態(tài)，用ImageJ軟件測量電鏡圖中的纖維直徑，每個樣品的電鏡圖隨機取40根纖維計算其平均的直徑。

1.2.3 纖維膜的溶血實驗抽取10 ml新鮮兔血，立即加入含有2%草酸鉀抗凝劑的試管中，從中抽取4 ml抗凝兔血，加入5 ml生理鹽水稀釋，制備成稀釋的抗凝兔血。將實驗分為三組：(1)實驗組：各取5個樣本膜，分別放入5個分別裝有10 ml的生理鹽水的離心管中完全浸泡；(2)陰性對照組：在5個離心管內(nèi)分別加入10 ml生理鹽水；(3)陽性對照組：在5個離心管內(nèi)分別加入10 ml蒸餾水。將上述三組離心管置于溫度為(37±1)℃的恒溫水浴中保溫30 min，然后在每個離心管內(nèi)分別各加入0.2 ml已制備好的稀釋抗凝兔血，混合均勻，繼續(xù)在(37±1)℃恒溫水浴中保溫60 min。取出所有離心管，離心后吸取上清液3 ml，置于分光光度計比色皿中，用分光光度計測定波長為545 nm時的吸光度值，并記錄結(jié)果，5個平行樣吸光度值的平均值為其吸光度值(陽性對照組吸光度值應(yīng)為(0.8±0.3)，陰性對照組吸光度應(yīng)＜0.03)，溶血率=(實驗組吸光度值-陰性對照組吸光度值)/(陽性對照組吸光度值-陰性對照組吸光度值)×100%，陰性對照組的吸光值應(yīng)為(0.8±0.3)，陽性對照組的吸光值應(yīng)＜0.03，若材料的溶血率＜5%，證明材料無溶血作用，符合材料的溶血要求。若材料的溶血率＞5%，則提示材料有溶血作用。

1.2.4 細胞毒性實驗根據(jù)6 cm2表面積加1 ml細胞培養(yǎng)液的標準制取材料浸出液，37℃提取48 h，4℃保存待用。提取第三代人骨髓間充質(zhì)干細胞，用胰酶消化為細胞懸液，將細胞密度調(diào)整為1×104/ml，接種于96孔板中，接種1 d后待細胞貼壁后去上清液，于每孔加入材料提取液100 μl，陰性對照組每孔加入100 μl細胞培養(yǎng)液；空白對照組不接種細胞，加入100 μl細胞培養(yǎng)液，以校正OD值。于第2天向每孔加入20 μl MTS溶液，繼續(xù)放入37℃培養(yǎng)箱4 h后，用酶標儀讀取490 nm處的吸光度值，計算出細胞相對增殖度(RGR)，RGR=實驗組平均OD值/陰性對照組平均OD值×100%，算出的RGR，按表1美國藥典對材料細胞毒性的評分標準評價材料的細胞毒性。

表1 RGR評分標準

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法實驗數(shù)據(jù)采用SPSS17.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，多組之間計量資料采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 殼聚糖與聚乙烯醇纖維膜大體觀如圖1所示，通過電紡法制得的殼聚糖與聚乙烯醇纖維膜不透明，各處厚度比較均勻，約為0.3 mm，有一定的強度和韌性，拉伸不易斷裂，有一定的彈性形變。

圖1 電紡殼聚糖與聚乙烯醇纖維膜

2.2 殼聚糖與聚乙烯醇纖維膜的掃描電鏡電鏡下可見膜表面較平整，纖維直徑粗細不一，軟件分析后可知纖維直徑60～300 nm，平均為140 nm，為納米級結(jié)構(gòu)。

2.3 溶血實驗各組試驗吸光度值和根據(jù)公式計算的溶血率如表2所示，纖維膜的溶血率為2.80%，符合《醫(yī)療器械生物學(xué)評價標準GB/T16886》中規(guī)定的5%。

圖2 電鏡觀察電紡殼聚糖/聚乙烯醇纖維膜（a：×10 000，b：×8 000）

表2 溶血實驗結(jié)果（n=5）

2.4 細胞毒性實驗實驗結(jié)果顯示細胞保持正常形態(tài)、貼壁、增殖良好，根據(jù)毒性分級，RGR為89.86%，為1級，評分為合格，證明電紡殼聚糖與聚乙烯醇纖維膜無明顯細胞毒性，見表3。

表3 MTS實驗結(jié)果

3 討論

電紡是一種比較新的制備納米纖維的技術(shù)，指的是通過高壓電場使聚合物溶液帶電，當液體表面產(chǎn)生的電場力大于其表面張力時形成射流，溶劑揮發(fā)后在接收裝置上形成連續(xù)纖維的一種方法[5]。電紡制備的纖維和傳統(tǒng)的方法比較，具有較大的比表面積和高孔隙率，更接近細胞外基質(zhì)，廣泛應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域[6]。殼聚糖是一種已經(jīng)廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的原料料，純的殼聚糖難以單獨紡絲，復(fù)合聚乙烯醇以后分子之間形成了氫鍵，減弱了殼聚糖中氨基的作用，可以成功紡出絲來，而且加入了聚乙烯醇還可以增加纖維膜的力學(xué)性能。

通過電紡制備出的殼聚糖/聚乙烯醇纖維膜，直徑范圍在60～300 nm，納米級別的纖維膜更能促進細胞的粘附和生長。

材料的血液相容性評價是材料生物學(xué)評價的重要組成部分，理想的生物膜材料必須滿足無毒且具有良好的生物相容性，溶血實驗主要用于材料的體外急性溶血性能評價。其原理為：材料與血液接觸后其溶血成分可以導(dǎo)致紅細胞中的血紅蛋白釋放出來，游離血漿血紅蛋白增加，從而對機體產(chǎn)生不利的作用，通過這種方法，可以檢測材料的可溶性或者釋放性成分的溶血性能及材料表面的溶血性能。殼聚糖與聚乙烯醇已經(jīng)廣泛用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，生物相容性很好，但在電紡的過程中纖維膜是否有溶劑的殘留導(dǎo)致溶血，需要進一步檢測。因此本實驗根據(jù)有關(guān)牙科材料的要求，對殼聚糖與聚乙烯醇纖維膜進行了溶血實驗，制備的纖維膜溶血率為2.80%，遠小于國家標準中的5%，該纖維膜無急性溶血作用，符合生物材料學(xué)要求。

生物材料生物相容性評價中MTS細胞毒性試驗是檢測材料毒性比較敏感的指標，可以用材料浸提液與細胞共同培養(yǎng)研究材料的毒性，此方法更直接和敏感[7]。MTS實驗結(jié)果表明用材料提取液培養(yǎng)細胞，細胞可以正常的增殖，細胞增殖度評分為1級，說明該纖維膜無明顯細胞毒性，符合ISO10993中對體內(nèi)植入材料的要求。

目前，生物醫(yī)學(xué)材料安全性評價主要是采用醫(yī)療器械生物學(xué)的評價體系，也就是國家標準(GB/T) 16886系列標準，本實驗選擇了溶血作用、細胞毒性實驗來評價該膜的體外生物相容性。

本實驗結(jié)果顯示，通過電紡可以成功制備殼聚糖/聚乙烯醇纖維膜，該膜無急性溶血作用，無明顯細胞毒性，有一定的應(yīng)用前景，但本研究屬于基礎(chǔ)的研究，還需要后續(xù)體內(nèi)實驗進行更深的探索和研究。

[1]車小瓊,孫慶申,趙凱.甲殼素和殼聚糖作為天然生物高分子材料的研究進展[J].高分子通報,2008,2∶45-49.

[2]You Y,Youk JH,Lee SW,et al.Preparation of porous ultrafine PGA fibers via selective dissolution of electrospun PGA/PLA blend fibers[J].Mater Letters,2006,60∶757-760.

[3]Dai TY,Chen K,Qing XT,et al.Sequential polymer precipitation of core/shell microstructured composites with giant permittivity[J]. Macromolecular Rapid Communications,2010,31(5)∶484-489.

[4]Urban IA.Vertical ridge augmentation using guided bone regeneration(GBR)in three clinical scenarios prior to implant placement∶A retrospective study of 35 patients 12 to 72 months after loading[J]. Int J Oral Maxillofac Implants,2009,24(3)∶502-510.

[5]Li D,Xia YN.Electrospinning of nanofibers∶Reinventing the wheel [J].Adv Mater,2004,16(14)∶1151-1170.

[6]Yoshimoto H,Shin YM,Terai H,et al.A biodegradable nanoifber scaffold by electrospinning and its potential for bone tissue engineering[J].Biomaterials,2003,24(12)∶2077-2082.

[7]李玉寶.生物醫(yī)學(xué)材料[M].北京∶化學(xué)工業(yè)出版社,2003∶20-25.

Study on the biocompatibility of electrospun chitosan/poly(vinyl alcohol)fiber membrane.

YANG Jing1,WANG Yong2,YE Chuan3,ZHANG Jun-biao1,YANG Long1,SUN Bo1,LIU Qin1,MA Min-xian2.1.Guiyang Medical College, Guiyang 550004,Guizhou,CHINA;2.Stomatological Hospital Affiliated to Guiyang Medical College,Guiyang 550004, Guizhou,CHINA;3.Department of Orthopedics,the Affiliated Hospital of Guiyang Medical College,Guiyang 550004, Guizhou,CHINA

ObjectiveTo prepare of chitosan/poly(vinyl alcohol)fiber membrane and to explore the biocompatibility in vitro,in order to provide certain theoretical basis for clinical application.MethodsThe chitosan/poly(vinyl alcohol)fiber membrane was prepared by electrospinning technique.Its ultrastructure was characterized by scanning electron microscope(SEM),and its in vitro biocompatibility was studied with hemolysis test and cytotoxicity test.ResultsThe chitosan/poly(vinyl alcohol)fiber membrane prepared was found to have a good appearance and homogenous fibers,with a little beads and the diameter of 60～300 nm in average.The hemolysis rate was 2.8%,which means no hemolysis.The cell relative growth rate of the fiber membrane was 89.86%,with the cytotoxicity of gradeⅠ,which indicated no cytotoxicity.ConclusionThe chitosan/poly(vinyl alcohol)fiber membrane can be prepared by the electrospinning technique successfully,with good biocompatibility,which is expected to be applied in oral clinical practice.

Electrospinning;Chitosan;Poly(vinyl alcohol);Biocompatibility

R318

A

1003—6350（2015）12—1719—03

2015-01-12)

貴州省科技廳聯(lián)合基金（編號：M2012-22）

馬敏先。E-mail：mahe2005919@hotmail.com