榮 維，宋麗芳，朱 旭，宋麗萍

（1.撫順市礦務(wù)局總醫(yī)院消化內(nèi)科，遼寧 撫順 113008；2.撫順市中心醫(yī)院消化內(nèi)科，遼寧 撫順 113008；3.中國科學院微生物研究所病源室，北京 100101）

結(jié)腸癌患者血清miRNA表達譜分析

榮 維1，宋麗芳2，朱 旭2，宋麗萍3

（1.撫順市礦務(wù)局總醫(yī)院消化內(nèi)科，遼寧 撫順 113008；2.撫順市中心醫(yī)院消化內(nèi)科，遼寧 撫順 113008；3.中國科學院微生物研究所病源室，北京 100101）

目的 探討結(jié)腸癌患者血清中miRNA分子的表達差異，尋找潛在的結(jié)腸癌診斷分子標記物。方法以12例正常人血清樣本為對照組，采用miRNA芯片技術(shù)對12例結(jié)腸癌患者血清樣本的miRNA表達譜進行分析；隨后，擴大患者樣本量至40例，擴大對照組樣本量至45例，采用實時熒光定量PCR(Real-time PCR)技術(shù)對差異表達的miRNA分子進行驗證分析。結(jié)果芯片結(jié)果顯示，與對照組比較，結(jié)腸癌患者血清miRNA表達譜發(fā)生了顯著的變化，其中3條miRNA表達水平上調(diào)，21條miRNA表達水平下調(diào)；Real-time PCR驗證實驗結(jié)果表明，與對照組比較，結(jié)腸癌患者血清中miR-508和miR-502-5p的表達水平明顯下調(diào)。結(jié)論miR-508和miR-502-5p可作為結(jié)腸癌診斷的潛在分子標記物進行開發(fā)。

結(jié)腸癌；血清；miRNA；芯片；實時熒光定量PCR

結(jié)腸癌是最常見的消化系統(tǒng)腫瘤之一。目前結(jié)腸癌臨床診斷的金標準方法為電子結(jié)腸鏡診斷技術(shù)，該技術(shù)需要一定的設(shè)備和技術(shù)支持，對操作者的操作熟練程度要求較高,診斷時需要侵入人體檢查，并且有發(fā)生出血及穿孔的并發(fā)癥危險，因此有必要研發(fā)一些新型診斷方法以減輕患者的痛苦和降低診斷的風險[1]。

microRNA(miRNA)是一類不編碼蛋白質(zhì)的RNA分子，長度為18～22 nt，通過靶向結(jié)合mRNA分子的3'UTR端來實現(xiàn)對基因表達的調(diào)控[2-11]。近年來，很多學者已經(jīng)證實腫瘤組織中的miRNA分子可作為新型標志物應(yīng)用于腫瘤臨床診斷[12-17]。有研究表明，miRNA可以在血清中穩(wěn)定存在，因此循環(huán)miRNA作為新穎的生物標志物受到了廣泛的關(guān)注，并且其可作為疾病診斷標志物的潛力已得到認可。

本研究以正常人的血清樣本為對照，利用miRNA芯片篩選技術(shù)對比分析了結(jié)腸癌患者血清中miRNA表達譜變化；隨后，擴大結(jié)腸癌患者樣本量至40例，對照組樣本量至45例，應(yīng)用Real-time PCR技術(shù)并對芯片的結(jié)果進行驗證，最終篩選獲得了兩個在結(jié)腸癌患者血清中特異性低表達的miRNA分子。本研究結(jié)果為結(jié)腸癌診斷提供了新型潛在分子標記物。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年1～12月12例結(jié)腸癌患者[年齡平均(62.2±8.6)歲，男性、女性各6例]血清作為研究對象(結(jié)腸癌組)。所有研究對象均為術(shù)后病理診斷為未發(fā)生轉(zhuǎn)移的原位結(jié)腸癌患者，在采集樣本前均未接受過化療藥物治療以及切除術(shù)處理。另收集12例健康人[年齡平均(60.2±6.4)歲，男性、女性各6例]血清作為對照組。本研究獲得撫順市中心醫(yī)院以及撫順市礦務(wù)局總醫(yī)院倫理委員會批準，所有組織標本的收集均征得患者本人的知情同意。

1.2 血漿樣本收集 采集受試者靜脈血4 ml于EDTA抗凝管中，輕輕顛倒數(shù)次后靜置10 min，于室溫2 500 r/min離心15 min，分兩層，吸取上層血漿400μl轉(zhuǎn)移至一個EP(RNase free)管中，-70℃保存。

1.3 血漿總RNA提取 將保存的血漿置于冰上溶解，4℃，12 000 r/min離心5 min，吸取上層血漿300μl轉(zhuǎn)移至一個EP(RNase free)管中，用Ambion mir VanaTMPARISTM提取試劑盒按說明書提取。

1.4 miRNA芯片分析 將患者組和對照組的樣本按照1.3中的方法提取RNA分子。將提取獲得的RNA分子送到ABI(Applied Biosystems by Life Technologies)公司進行miRNA芯片分析。

1.5 Real-time PCR檢測miRNA的表達 分別按照1.3中的方法提取患者組和對照組血漿樣本的RNA分子，使用miRcute miRNAcDNA第一鏈合成試劑盒(天根生化科技有限公司)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA分子，使用miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒(天根生化科技有限公司)定量檢測樣本中miRNA分子的表達，使用U6分子作為檢測內(nèi)參。

1.6 結(jié)腸癌血漿中miRNA分子標志物的驗證 為了篩選血漿中miRNA分子的標志物，2013年 1～12月我們擴大收集了40例結(jié)腸癌患者[年齡平均(61.4±10.27)歲，男22例，女18例]的血清樣本，所有研究對象均為術(shù)后病理診斷為未發(fā)生轉(zhuǎn)移的原位結(jié)腸癌患者，結(jié)腸癌患者在采集樣本前均未接受過化療藥物治療以及切除術(shù)處理。另收集45例健康對照者[年齡平均(62.2±12.01)歲，男24名，女21名]血漿樣本作為對照組進行獨立樣本的驗證。本研究獲得撫順市中心醫(yī)院以及撫順市礦務(wù)局總醫(yī)院倫理委員會批準，所有組織標本的收集均征得患者本人的知情同意。

1.7 統(tǒng)計學方法 miRNA芯片實驗結(jié)果按照Ratio≥1.4或≤0.7倍為標準，篩選出患者組和對照組之間差異；臨床特征與分組間的關(guān)系用Mann-Whituey U和Student's-t-test分析；以P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 芯片分析結(jié)腸癌患者血清中miRNA表達譜變化 利用miRNA芯片分析結(jié)腸癌患者混合血清中miRNA表達譜的變化，以U6表達水平作為檢測內(nèi)參。以Ratio≥1.4或≤0.7倍為標準，篩選出發(fā)生變化的miRNA分子。結(jié)果如表1所示，其中表達上調(diào)的miRNA分子有3個，表達下調(diào)的miRNA分子有21個。

表1 結(jié)腸癌患者血清中miRNA表達的變化

2.2 Real-time PCR驗證芯片檢測結(jié)果 為了進一步驗證芯片結(jié)果，篩選出結(jié)腸癌血漿中miRNA分子標志物群，我們將結(jié)腸癌患者樣本量擴大至40例(未轉(zhuǎn)移原位結(jié)腸癌，未經(jīng)過手術(shù)和接受過化療)，對照樣本量擴大至45例。利用Real-time PCR技術(shù)對所有樣本中上述24條miRNA分子進行獨立樣本檢測。結(jié)果如圖1所示，在結(jié)腸癌患者血漿中miR-508 (Mann-WhitneyU=7.28，P=0.028)和 miR-502-5p (Mann-Whitney U=8.65，P=0.035)的表達水平較正常對照組均有顯著降低(P＜0.05)。

圖1 血漿中miRNA在結(jié)腸癌組與正常組的相對表達水平

3 討論

在本研究中，為了篩選獲得的結(jié)腸癌患者血漿中miRNA分子標志物群，筆者2013年1～12月共收集了12例結(jié)腸癌血漿樣本(患者未接受化療和手術(shù)處理)進行miRNA表達譜的分析，以12例正常人血漿作為對照組，并以U6的表達水平作為內(nèi)參。研究結(jié)果表明，結(jié)腸癌患者血漿中共有24條miRNA分子的表達水平發(fā)生了顯著性變化。為了進一步驗證miRNA芯片的篩選結(jié)果，我們擴大了樣本收集量，將結(jié)腸癌患者樣本擴大至40例，對照組樣本擴大至45例。用Real-time PCR技術(shù)驗證篩選獲得的24個miRNA分子在獨立樣本中的表達情況，結(jié)果顯示在結(jié)腸癌患者血漿中miR-508和miR-502-5p這兩條miRNA分子的表達水平較對照組有顯著下降(P＜0.05)。

眾所周知，結(jié)腸癌的早期診斷對于患者的存活率有較大影響[18-20]。因此，本研究會繼續(xù)擴大收集樣本量，深入分析miR-508和miR-502-5p在不同時期，特別是早期的結(jié)腸癌患者血清中的表達水平，進一步探討miR-508和miR-502-5p作為潛在結(jié)腸癌診斷分子標記物的可能性。

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Analysis of miRNA profile in serum of patients with colon cancer.

RONG Wei1,SONG Li-fang2,ZHU Xu2,SONG Li-ping3.
1.Department of Gastroenterology,Fushun Mining Bureau General Hospital,Fushun 113008,Liaoning, CHINA;2.Department of Gastroenterology,the Central Hospital of Fushun,Fushun 113008,Liaoning,CHINA;3. Department of Pathogen,Institute of Microbiology,Chinese Academy of Science,Beijing 100101,CHINA

ObjectiveTo profile the miRNA expression pattern in the serum of patients with colon cancer, and to explore the potential molecular marker for the diagnosis of colon cancer.MethodsThe 12 serum samples of colon cancer patients were collected and miRNA chips were used to analyze the miRNA profile of colon cancer(the study group).The 12 serum samples of normal persons were collected as control(the control group).And then the samples of colon cancer and control were extended to 40 cases and 45 cases respectively.Real-time PCR was used to further validate the expression level of miRNA in samples of colon cancer.ResultsCompared to the control group,the miRNA profile of the study group represented obvious changes,with 3 miRNAs up-regulated and 21 miRNAs down-regulated.The results of real-time PCR showed that the expression levels of miR-508 and miR-502-5p were down-regulated significantly in the study group compared to the control group.ConclusionmiR-508 and miR-502-5p can be explored as potential diagnosis marker for colon cancer.

Colon cancer;Serum;miRNA;Chip;Real-time PCR

R735.3+5

A

1003—6350（2015）06—0841—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.06.0300

2014-09-18)

宋麗芳。E-mail：slp_0705@sina.com