牛志立，張平安，童永清

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 武漢 430060)

年齡和性別對健康人群外周血I型干擾素基因表達(dá)的影響

牛志立，張平安，童永清

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 武漢 430060)

目的 觀察不同性別和年齡健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）中I型干擾素mRNA表達(dá)，探討I型干擾素基因表達(dá)的性別和年齡差異。方法選擇113例健康人，中老年54例包括女性27例和男性27例，平均(63±8)歲；青年人59例包括女性30例和男性29例，平均(36±6)歲。取抗凝全血，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測干擾素α(IFN-α)和干擾素β(IFN-β)的mRNA表達(dá)。結(jié)果健康中老年男性IFN-α和IFN-β基因表達(dá)量與青年男性比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且前者基因表達(dá)量分別比后者低25倍和2.9倍；健康中老年女性IFN-α和IFN-β基因表達(dá)量與青年男性比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且前者基因表達(dá)量分別比后者低6.67倍和3.57倍；健康青年男性IFN-α和IFN-β基因表達(dá)量與青年女性比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且前者基因表達(dá)量分別比后者低4倍和1.92倍；健康中老年男性IFN-α基因表達(dá)量和中老年女性比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且前者基因表達(dá)量比后者低16.67倍，但健康中老年男性IFN-β基因表達(dá)量和中老年女性比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論性別和年齡對I型干擾素表達(dá)有一定的影響，為臨床研究免疫相關(guān)性疾病的發(fā)病機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

健康人群；外周血單個(gè)核細(xì)胞；I型干擾素；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

性別長期以來被認(rèn)為與免疫功能有很大關(guān)系。最近有研究表明丙肝病毒(HCV)女性感染者有更強(qiáng)的清除能力和持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答(Sustained virologic response，SVR)[1-2]。對于病毒感染而言，男性血清IgG、IgM和IgA的基線水平相對于女性顯著減少[3]。此外，對于獲得感染性疾病的男性比女性具有較高的TNF-α(Tumor necrosis factor)，導(dǎo)致男性的疾病更嚴(yán)重，而女性患者的炎癥水平比男性高，這意味著女性比男性表現(xiàn)出更強(qiáng)的免疫反應(yīng)[4-5]。研究HIV(Human immunodeficiency virus)的結(jié)果表明，未治療的女性比男性的生存率要低而且女性比男性具有較低的病毒載量，有趣的是，病毒控制的女性患者在5～7年內(nèi)病毒載量比男性上升的速度要快的多[6-7]，這說明病毒載量在不同性別是不一致的。

Ⅰ型干擾素包括IFN-α和IFN-β，具有抑制病毒復(fù)制、抗寄生蟲、抑制多種細(xì)胞增殖、刺激免疫細(xì)胞的殺傷活性、參與免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等作用[8]。病毒感染人體后，可通過Toll受體或其他受體的識(shí)別激活I(lǐng)型干擾素，激活的Ⅰ型干擾素基因表達(dá)的蛋白激活JAK-STAT信號(hào)通路，最終激活干擾素誘導(dǎo)基因(Interferon stimulated gene，ISG)的表達(dá)而發(fā)揮抗病毒作用[8-9]。目前關(guān)于雌激素與Ⅰ型干擾素之間的研究，尤其對女性絕經(jīng)期和非絕經(jīng)期的研究國內(nèi)外較少，本文將從性別和年齡的角度對絕經(jīng)期和非絕經(jīng)期的健康人群的女性和年齡匹配的男性進(jìn)行Ⅰ型干擾素基因表達(dá)的研究和比較，觀察是否健康女性Ⅰ型干擾素的表達(dá)水平比男性具有較高的基礎(chǔ)水平，分析是否易感性取決于不同性別人群的干擾素不同，最終為臨床研究免疫相關(guān)性疾病的發(fā)病機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2013年3月至2014年8月在武漢大學(xué)人民醫(yī)院體檢的113例健康人，按照世界衛(wèi)生組織年齡劃分標(biāo)準(zhǔn)分為中老年組(年齡＞45歲)和青組(＜45歲)[10]。中老年人包括女性27例和男性27例，年齡51～74歲，平均(63±8)歲，青年人包括女性30例和男性29例，年齡25～43歲，平均(36±6)歲。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[編號(hào)：(2013)鄂倫字(KY-035)]，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器 淋巴細(xì)胞分離液由天津美德太平洋科技有限公司提供，Trizol和SYBR Premix ExTaqⅡ由TaKaRa公司提供，反轉(zhuǎn)錄試劑盒由Thermo SCIENTIFIC公司提供。PCR分析儀由Applied Biosystem Inc公司生產(chǎn)；VII7熒光定量分析儀由ABI公司生產(chǎn)。

1.3 研究方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì) 利用美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)網(wǎng)站中提供的IFN-α和IFN-βmRNA序列和BLAST進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，見表1。所有引物均由上海維基生物科技有限公司合成。

表1 基因IFN-α，IFN-β和GAPDH的上下游引物

1.3.2 mRNA提取和逆轉(zhuǎn)錄 采集所有研究對象空腹靜脈血2ml于EDTA抗凝的采血管中，按照淋巴細(xì)胞分裂液說明書(天津美德太平洋科技有限公司)提取2ml外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)并用Trizol法提取PBMC總mRNA。取11 μl RNA模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，加入1μl oligo引物混勻并瞬時(shí)離心，65℃5min，反應(yīng)體系：4μl Reaction Buffer，2 μl Mix，1μl RI，1μlRT。反應(yīng)條件：42℃60min，72℃10min，4℃保存。得到的cDNA產(chǎn)物放置在-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 熒光定量PCR檢測 反應(yīng)體系為cDNA1μl，上下游引物各lμl，SYBR Premix ExTaqⅡ10μl，ROXⅡ0.4μl，ddH2O7.6 ul，總體積為20μl。3個(gè)基因(IFN-α，IFN-β，GAPDH)擴(kuò)增反應(yīng)條件均為94℃30 s預(yù)變性，94℃20 s，60℃20 s，72℃35 s，50個(gè)循環(huán)，溶解曲線條件：95℃15 s，60℃1min，95℃15 s。擴(kuò)增效率驗(yàn)證：本實(shí)驗(yàn)對3個(gè)基因(IFN-α、IFN-β、GAPDH)進(jìn)行了10倍稀釋，稀釋5個(gè)梯度，目的基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增效率相差小于5%，且在98%～102%之間，可以認(rèn)為擴(kuò)增效率近似相等[11]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料呈正態(tài)分布且方差齊性的資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Ⅰ型干擾素基因mRNA在中老年組和青年組間的表達(dá)情況 健康中老年男性IFN-α和IFN-β基因表達(dá)量與青年男性比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，并且其基因表達(dá)量分別比后者低25倍和2.9倍。健康中老年女性IFN-α和IFN-β基因表達(dá)量與青年男性比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，并且其基因表達(dá)量分別比后者低6.67倍和3.57倍，見表2。

表2 I型干擾素基因mRNA在中老年組和青年組間的表達(dá)情況(±s)

表2 I型干擾素基因mRNA在中老年組和青年組間的表達(dá)情況(±s)

注：2-△△Ct表示表達(dá)量的倍比關(guān)系，△△Ct=△Ct中老年組-△Ct青年組。

組別IFN-β(△Ct)男性 女性IFN-α(△Ct)IFN-β(△Ct)IFN-α(△Ct)中老年組青年組2-△△Ctt值P值9.09±2.107.27±1.3528/1003.940.000115.60±2.9010.87±2.594/1006.430.00019.77±1.238.20±1.2634/1004.720.000111.64±2.408.90±1.3915/1005.340.0001

2.2 Ⅰ型干擾素基因mRNA在女性組和男性組間的表達(dá)情況 健康青年男性IFN-α和IFN-β基因表達(dá)量與青年女性比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，并且其基因表達(dá)量分別比后者低4倍和1.92倍。健康中老年男性IFN-α基因表達(dá)量和中老年女性比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，并且其基因表達(dá)量比后者低16.67倍。但是健康中老年男性IFN-β基因表達(dá)量和中老年女性比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表3。

表3 I型干擾素基因mRNA在女性組和男性組間的表達(dá)情況(±s)

表3 I型干擾素基因mRNA在女性組和男性組間的表達(dá)情況(±s)

注：2-△△Ct表示表達(dá)量的倍比關(guān)系，△△Ct=△Ct男性組-△Ct女性組。

組別 青年 中老年IFN-α(△Ct)IFN-β(△Ct)IFN-α(△Ct)IFN-β(△Ct)男性組女性組2-△△Ctt值P值10.89±2.588.90±1.3925/1003.670.0018.20±1.267.27±1.3552/1002.710.00915.60±2.9011.64±2.46/1005.470.00019.77±1.239.09±2.1062/1001.450.15

3 討論

有研究報(bào)道[2，12-13]，不同性別的人感染病毒后對I型干擾素的表達(dá)和治療反應(yīng)不同，導(dǎo)致病毒的清除能力也不一致，如HCV感染的女性比HCV感染的男性具有較高的病毒自我清除能力，并且對抗病毒治療的效果也不相同。如果對女性進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)[12-13]，年輕女性比老年女性獲得更高的持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答，但是青年男性和老年男性之間并無差別。對HCV感染的老年男性和老年女性研究發(fā)現(xiàn)[13]，經(jīng)過抗病毒治療的老年男性要比抗病毒治療的老年女性更易獲得持久病毒學(xué)應(yīng)答反應(yīng)，但是他們都不如絕經(jīng)前的女性更易獲得持久的病毒學(xué)應(yīng)答反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)，HIV感染的女性比男性具有較高的IFN-α水平，IFN-α上調(diào)CD8+T細(xì)胞上的CD38分子，這有利于免疫細(xì)胞的激活并且增加女性的死亡率[6-7，14]。

有研究表明[5，15]，女性比男性具有更強(qiáng)的抗病毒感染能力，這與雌激素具有增強(qiáng)免疫功能的作用有很大的關(guān)系，并且隨著年齡的增長，性激素水平下降，對免疫的調(diào)節(jié)作用減弱，導(dǎo)致老年人免疫力下降。有研究報(bào)道[16-17]，與對照的健康女性相比，TLR7激動(dòng)劑咪喹莫特(Imiquimod)刺激健康男性的PBMC不會(huì)增加IFNα的分泌。本次研究發(fā)現(xiàn)，健康青年女性比中老年女性具有較高的IFN-β表達(dá)水平，同時(shí)比青年男性具有較高的IFN-α和IFN-β基因表達(dá)水平。對于男性而言，健康青年男性比中老年男性具有較高的IFN-α和IFN-β基因表達(dá)水平。除此之外，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)中老年男性比中老年女性具有較高的IFN-α基因表達(dá)水平，但是IFN-β基因表達(dá)在兩者之間沒有差異，這可能與研究對象例數(shù)較少等原因有關(guān)，其具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

最近研究發(fā)現(xiàn)[18-19]，雌激素受體與Toll樣受體具有協(xié)同作用，共同參與病毒的識(shí)別和信號(hào)傳遞，雌激素通過經(jīng)典或非經(jīng)典途徑激活雌激素反應(yīng)元件，經(jīng)NF-kB因子的活化最終激活I(lǐng)型干擾素。從本文的研究結(jié)果可以看出，青年女性比男性具有更高的Ⅰ型干擾素表達(dá)水平，在一定程度上對女性的抗病毒和免疫功能的調(diào)節(jié)起到很大的作用，這可以為臨床上研究免疫相關(guān)性疾病的發(fā)病機(jī)制提供參考。

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Effect of age and gender on the expression of typeⅠinterferon gene in peripheral blood of healthy people.

NIU Zhi-li,ZHANG Ping-an,TONG Yong-qing.Department of Laboratory Science,Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan430060,Hubei,CHINA

ObjectiveTo explore the effects of gender and age on the expression of typeⅠinterferon by investigating the expression of typeⅠinterferon mRNA in peripheral blood mononuclear cells(PBMC)of healthy individuals.MethodsPeripheral blood samples were collected from113 healthy individuals,which consisted of54 middle-and old-aged participants[27 females and27 males,with the mean age of(63±8)years old]and59 young participants[30 females and29 males,with the mean age of(36±6)years old].Expression levels of interferon-α(IFN-α)and interferon-β(IFN-β)mRNA were detected by real-time quantitative PCR.ResultsThe mRNA expression of gene IFN-αand IFN-βwere significantly different between healthy middle-and old-aged males and young males(P＜0.05),and the gene expression of the former was25 and2.9 times lower than the latter,respectively.The mRNA expression of gene IFN-αand IFN-βshowed significant difference between healthy middle-and old-aged females and young females(P＜0.05),and the gene expression of the former was6.67 and3.57 times lower than the latter,respectively.The mRNA expression of gene IFN-αand IFN-βwere significantly different between healthy young males and young females(P＜0.05),and the gene expression of the former was4 and1.92 times lower than the latter,respectively.The mRNA expression of gene IFN-αwas significantly different between healthy males and females of middleand old-age(P＜0.05),and the gene expression of the former was16.67 times lower than the latter.However,the expression of IFN-βgene showed no statistically significant differences between middle-and old-aged males and females(P＜0.05).ConclusionGender and age discrepancies have a relationship with the expression of typeⅠinterferon,which may provide a theoretical basis for the pathogenesis of clinical studies of immune related diseases.

Healthy individuals;Peripheral blood mononuclear cells;TypeⅠinterferon;Real-time quantitative PCR

R446.6

A

1003—6350（2015）16—2400—03

2014-10-17)

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.16.0865

張平安。E-mail：zhangpingan@aliyun.com