郭藝鵬，王海儒，孫林琦，張晶晶，韓 超，秦韻婷，李建貴

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林業(yè)研究所，新疆烏魯木齊830052;2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，新疆紅棗工程技術(shù)研究中心，新疆烏魯木齊830052)

磷是植物營養(yǎng)中的三大要素之一，又是植物體內(nèi)有機化合物的重要組成成分，對其生長發(fā)育都起著不可忽視的作用［1-3］，中國有74% 的耕地土壤缺磷，土壤中95%的磷為無效形式，為了實現(xiàn)高產(chǎn)，每年都向土壤中反復(fù)施加大量可溶性磷肥，然而，由于土壤的固定等作用，作物對施入的磷肥當(dāng)季利用效率只有5% ～10%，大部分與土壤中的Ca2+，F(xiàn)e2+，F(xiàn)e3+，A13+結(jié)合形成難溶性磷酸鹽。土壤中存在大量具有解磷能力的微生物，能夠?qū)㈦y溶性的磷酸鹽如磷礦粉轉(zhuǎn)化為水溶性磷，提高土壤中的可溶性磷含量，從而改善植物磷素營養(yǎng)，提高作物產(chǎn)量［4-5］。新疆獨特的氣候條件和土壤類型，造就其土壤微生物資源及解磷微生物也有其特性。因此，從新疆紅棗根際土壤中分離、篩選高效溶磷細菌，研究高效微生物菌肥，對調(diào)節(jié)土壤磷素的供需矛盾，促進新疆紅棗產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。本試驗從新疆紅棗主產(chǎn)區(qū)的18個根際土壤樣品篩選解磷細菌，研究其對無機磷和有機磷的降解能力，獲得了20個代表性解磷菌株，并對其進行鑒定和分類，為今后研究新疆紅棗專用微生物肥料奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

原始土樣采自新疆和田、喀什、阿克蘇、庫爾勒和吐魯番等紅棗主產(chǎn)區(qū)的4 a生和8 a生駿棗及灰棗棗園。采樣時，鏟去表土，深挖10～20 cm，將根際土壤連同棗樹根一同裝入無菌袋，編號。

1.2 培養(yǎng)基的配制

細菌分離采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:牛肉膏3.0 g，蛋白胨 10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂 18.0 g，pH值為 7.0 ～7.2，蒸餾水 1 000 mL。

磷酸三鈣無機磷培養(yǎng)基(Ca3(PO4)2):葡萄糖10.0 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO41.0 g，Ca3(PO4)25.0 g，Agar 15.0 ～ 18.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 值為 7.0～7.5。該培養(yǎng)基的液體培養(yǎng)基中，不加瓊脂。

蒙金娜有機磷培養(yǎng)基(PVK):葡萄糖10.0 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.03 g，MnSO41.0 g，CaCO35.0 g，卵磷脂 2 g，Agar 15.0 ～18.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH值為 7.0～7.5。該培養(yǎng)基的液體培養(yǎng)基中，不加瓊脂。

1.3 解磷細菌的分離及篩選

1.3.1 分離 無菌條件下取棗根及黏附其上的根際土壤稱量后，溶于裝有90 mL無菌水的三角瓶中配成10-1稀釋液，28℃，170 r·min-1，振蕩 30 min，使微生物充分的分散。取1 mL稀釋液加入到9 mL無菌水中混勻配成10-2的稀釋液，然后將10-2的稀釋液取1 mL加入9 mL的無菌水中混勻，即為10-3的稀釋液，以此類推，制備 10-4，10-5，10-6等的一系列稀釋液。

用移液器吸取100 μL樣品稀釋液，將稀釋液分別涂布于無機磷培養(yǎng)基和卵磷脂培養(yǎng)基上，解有機磷細菌在28℃ 培養(yǎng) 3 d，解無機磷細菌培養(yǎng)7 d，分別記錄具有混濁圈和透明圈的菌落個數(shù)，并挑取單菌落進行純化培養(yǎng)。

純化培養(yǎng)時，將有代表性的單菌落分別接種到牛肉膏蛋白胨斜面上及其液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)1～2 d，斜面培養(yǎng)物在4℃保存，液體培養(yǎng)物加甘油(終體積分?jǐn)?shù)為20%)，保存在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 平板初篩 取分離出的代表性菌株活化24 h后制成菌懸液，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用打孔器在卵磷脂平板和磷灰石平板上打孔，每板3個，每孔接種30 μL，重復(fù)3個平板，28℃培養(yǎng)24 h后，觀察有無溶磷圈，并根據(jù)在平板上形成的混濁圈(或透明圈)直徑，比較其解磷能力的大?。?］。

1.3.3 搖瓶復(fù)篩 取代表性菌株接種于50 mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液中，于30℃，170 r·min-1培養(yǎng)24 h;取2 mL菌液分別接種于滅菌的磷酸三鈣無機磷和蒙金娜有機磷液體培養(yǎng)基中，以不接菌為對照，3 次重復(fù)，30 ℃，170 r·min-1培養(yǎng) 6 d，測定有效磷的含量和 pH［7］。數(shù)據(jù)使用 DPS軟件進行LSD法多重比較。

1.4 16S rDNA序列測定與系統(tǒng)發(fā)育分析

1.4.1 16S rDNA的 PCR擴增反應(yīng) 根據(jù)細菌16S rDNA的保守序列，合成一對細菌特異性引物(通用引物):27 F(5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’)和 1492 R(5’-GGTTACCTTACGACTT-3’)。PCR 反 應(yīng) 體 系 為 50 μL:5 μL 10 × buffer;1.0 μL 10 mmol·L-1dNTPs;10 mmol·L-1引物27 F 和1492 R 各1 μL;2.0 μL 細菌基因組 DNA;2U TaqDNA聚合酶。PCR擴增條件:94℃，3 min;94 ℃，1 min;52℃，1 min;72 ℃1 min，30 個循環(huán);72℃，10 min，PCR反應(yīng)產(chǎn)物4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物，在1% 瓊脂糖凝膠中電泳，分析PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果［8］。將PCR擴增產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行測序。將所得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列進行Blast分析比對，鑒定其種屬，并上傳所得序列。

1.4.2 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 采用 CLUSTALX 1.83軟件進行序列比對，用MEGA 5.0軟件以鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap值為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 初篩

采用磷酸三鈣無機磷和蒙金娜有機磷培養(yǎng)基分離和田、喀什、阿克蘇、庫爾勒和吐魯番等地區(qū)18個根際土樣品的解磷細菌，共計獲得176個菌株，其中從磷酸三鈣無機磷培養(yǎng)基分離得到79個，從蒙金娜有機磷培養(yǎng)基分離得到97個。

將分離得到的菌株純化培養(yǎng)后接種到磷灰石板和卵黃板上，培養(yǎng)24 h后，有63個菌株產(chǎn)生了明顯的溶磷圈，有76個菌株溶磷圈不夠明顯，剩下的菌株則沒有發(fā)現(xiàn)溶磷圈。從63個菌株中又進一步驗證初篩出了解磷能力穩(wěn)定的20個代表性菌株，結(jié)果如表1所示。

表1 表1不同解磷菌株在固體Ca3(PO4)2和PVK培養(yǎng)基上的溶磷情況Table 1 The clear halos of different PSMs on Ca3(PO4)2and PVK agar medium

由表1可知，初篩出的菌株，有17個在以磷酸三鈣為磷源的磷灰石板上形成透明圈，15個在以卵磷脂為磷源的卵黃板上形成混著圈，這些菌株具有解磷能力，可以溶解菌落周圍的磷酸三鈣或卵磷脂，且解磷能力越大，透明圈或混著圈越大，有7個菌株解無機磷能力較強，D/d ＞2，其中 P12，P16，P193個菌株D/d＞3;有13個菌株解有磷能力較強，D/d＞2，其中 P2，P42個菌株 D/d＞3;還有一些菌株能夠解有機磷和無機磷，如 P3，P4，P11，P19等，只是能力強弱不同。

2.2 復(fù)篩

將初篩選出的 20個菌株于 30℃，170 r·min-1培養(yǎng)24 h，分別取2 mL菌液接種于滅菌的磷酸三鈣無機磷和蒙金娜有機磷液體培養(yǎng)基中，以不接菌為對照，3次重復(fù)，30℃，170 r·min-1培養(yǎng)6 d，測定有效磷的含量和pH值。

將20個解磷菌株對磷酸三鈣的解磷量和培養(yǎng)液的pH值進行分析，結(jié)果如表2所示。初篩出來的20個菌株對磷酸三鈣均有不同程度的降解能力，其中P7，P13的能力最強，解磷量達到300 mg·L-1以上，P6的解磷能力也較強，但穩(wěn)定性相對較差［解磷量為(159.35 ±94.50)mg·L-1］。同時，培養(yǎng)6 d后，培養(yǎng)液的pH值呈下降的趨勢，pH值下降了0.45～1.79。將解磷量與培養(yǎng)液pH值進行相關(guān)性分析，得出菌株解磷量與培養(yǎng)液pH值的相關(guān)系數(shù) r=-0.84，P ＜0.01，達到極顯著水平，回歸分析后得出，Y=815.183-122.005 4 X。

將20個解磷菌株對蒙金娜培養(yǎng)基中卵磷脂的解磷量和培養(yǎng)液pH值進行分析，從表2中可以看出，僅有少數(shù)幾個菌株對卵磷脂有較強的解磷能力，P3，P7，P9與對照間差異顯著，P9菌株穩(wěn)定性較弱，P4，P6，P8，P16，P19也有一定的解磷能力，但與對照間無顯著性差異，培養(yǎng)液的pH值維持在一個較高水平，與對照相比，pH值最大下降了1.17，有8個培養(yǎng)液的pH與對照無顯著性差異。將數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析后r=-0.61，P＜0.01達到顯著水平，回歸分析后得出 Y=7.453-0.067 8 X。

通過以上分析得出，P7，P13的解無機磷能力最強，P7，P3解有機磷能力最強，P7能同時降解無機磷和有機磷，效果最佳。

表2 解磷菌株培養(yǎng)6 d后對Ca3(PO4)2和PVK的解磷量及培養(yǎng)后培養(yǎng)液的pHTable 2 Amounts of phosphorus dissolved from Ca3(PO4)2and PVK after liquid cultivation for 6 days and the resulting pH values of media

表3 棗解磷細菌16 S rDNA序列的Blast檢索結(jié)果Table 3 Blastn search results for the 16 S rDNAs of different phosphate-solubilizing bacteria

2.3 16 S rDNA測序和系統(tǒng)發(fā)育樹分析

以20個代表性菌株的DNA為模板進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物測序結(jié)果拼接后，與GeneBank數(shù)據(jù)庫中的已有序列進行比對，結(jié)果如表3所示:

由表3可知，篩選出的20個菌株主要是Bacillus sp.，Acinetobacter sp.、Pseudomonas sp.、Enterobacter sp.等4個屬的細菌，同源性達到99%，以上屬的菌株都有過報道［9-11］。

采用CLUSTALX 1.83軟件進行序列比對，用MEGA5.0軟件以鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖1所示，測序的20個菌株序列可以分為4大類，其中 P5，P8，P11，P12，P13，P15為 1 類，與 Acinetobacter sp.(C25JX177 713.1)和 Acinetobacter sp.S3.(MAC.013HM063 913.1)等相似度最高;P4，P6，P7，P20為一類，屬于 Bacillus sp.，其中 P7與 Bacillus sp.WP09-2(KF719 307.1)等相似性達99%;P2，P16，P18，P19為 1 類，與 Enterobacter sp.VITNC1(JQ398 852.1)等相似性最高，達99%以上;P9，P10，P14，P17等為1 類，屬于 Pseudomonas sp，與 Pseudomonas sp.5 060(KC236 637.1)等相似性達99%，P1與Rhizobium sp.XGL136(JQ041 733.1)相似性達99%，P3與Bacillus subtilis strain F111(HQ647 257.1)相似性達99%。

3 討論

本試驗分離篩選出了具有代表性的20個解磷細菌菌株，主要 4大類，分別是Bacillus sp.，Acinetobacter sp.，Pseudomonas sp.，Enterobacter sp.等。RODRIGUEZ等人［12］研究認(rèn)為，根際土壤分離的Bacillus sp.和Pseudomonas sp.有較強的解無機磷能力，本試驗中解無機磷能力最強的P7屬于Bacillus sp.，P13屬于 Acinetobacter sp.。解無機磷菌株在培養(yǎng)過程中pH值均有不同程度降低，可能是由于釋放了有機酸或者NH+4使培養(yǎng)液中酸度升高造成的。MOLLA等［13］也發(fā)現(xiàn)有機磷細菌有多種 ，包括 Bacillus sp.，Pseudomonas sp.，Micrococcaceae-Pribram，Serratia，Proteus等。試驗中，解有機磷較強的菌株P(guān)3屬于Bacillus subtilisstrain F111，P7屬于Bacillus sp.，P9屬于 Pseudomonas sp.，可見解無機磷和有機磷細菌之間沒有明顯的界限，解磷細菌在蒙金娜培養(yǎng)基培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)液的pH值總體上沒有明顯的下降，解磷能力較強的菌株P(guān)7，P9的pH值相對較低，然而P3的pH值與對照相差不大，研究認(rèn)為微生物降解有機磷主要是通過土壤微生物分泌的酸性或堿性磷酸酶，將植酸鹽、磷脂等有機磷化物水解，轉(zhuǎn)化為簡單的無機化合物為植物所吸收利用［14］。本研究認(rèn)為有些解磷細菌的解磷能力不穩(wěn)定，在復(fù)篩過程中，在解無機磷培養(yǎng)液中P6，P13，P20的磷含量波動較大，如P6在解無機磷過程中的解磷量為(159.35 ± 94.50)mg·L-1，3 次數(shù)值之間的差異較大;在解有機磷培養(yǎng)液中P3，P7，P9的磷含量的變化情況也是如此，如P9在解有機磷過程中解磷量(7.81 ±9.88)mg·L-1。

圖1 棗解磷細菌的16S rDNA序列為基礎(chǔ)的發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree showing the relationship of jujube phosphate-solubilizing bacteria and related strain based on 16 S rDNA sequence

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