史麗娟，彭勝，鄭陽，王志宏，彭密軍

(吉首大學(xué) 林產(chǎn)化工工程湖南省重點實驗室，杜仲湖南省工程實驗室，湖南 張家界 427000)

離子液體(IL)近年來被越來越多的學(xué)者應(yīng)用于提取領(lǐng)域。Zhang［1］用［C4mim］［PF6］超聲波輔助法提取厚樸中厚樸酚，Du［2］用酸化［C4mim］Br 微波輔助法提取楊梅中楊梅黃酮和槲皮素，Yang Lei［3］用［C4mim］Br 超聲波輔助法提取刺五加中的刺五加苷b 和e。

杜仲系杜仲科杜仲屬多年生落葉喬木植物，其性甘、味微辛，具有提高機(jī)體抗缺氧耐力［4-5］等功效。杜仲中的主要活性成分包括環(huán)烯醚萜［6］、木脂素類［7］、苯丙素類［8］和黃酮類等［9］。其中木脂素類化合物具有抗腫瘤、舒血管作用［10］和降血壓作用［11-12］等活性。已報道的杜仲木脂素類化合物有28 種［13-15］，例如松脂醇二葡萄糖苷(PDG)。本實驗采用離子液體超聲波輔助法提取杜仲皮總木脂素，用響應(yīng)面法對工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為杜仲的工業(yè)生產(chǎn)提供一定參考。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

杜仲皮;離子液體［C2mim］Br、［C4mim］Br、［C6mim］Br、［C4mim］Cl、［C4mim］BF4均為化學(xué)純;松脂醇二葡萄糖苷(PDG)、甲醇、變色酸、濃硫酸均為分析純;蒸餾水。

XO-5200DT 超聲波清洗機(jī);U-3900 紫外可見分光光度計;AEG-220 萬分之一天平;BM400 型數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋。

1.2 杜仲皮總木脂素提取

杜仲皮50 ℃烘干，粉碎。準(zhǔn)確稱取2.00 g 杜仲皮粉于50 mL 錐形瓶中，加入濃度0.68 mol/L 的離子液體溶液，液料比15∶1 mL/g，充分?jǐn)嚢韬蠼? h。50 ℃下超聲提取30 min。過濾，并定容到100 mL。測定吸光度，計算總木脂素得率。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作［16］

準(zhǔn)確稱取PDG 標(biāo)準(zhǔn)品6.1 mg，用甲醇溶解，分別配制不同濃度的PDG 標(biāo)準(zhǔn)溶液(0. 0，95. 3，190.6，381.3，762.5，1 525.0，3 050.0 μg/mL)，用變色酸比色法［17-18］測定吸光度。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

杜仲皮總木脂素的測定方法同PDG 標(biāo)準(zhǔn)溶液。標(biāo)準(zhǔn) 曲 線 方 程A = 0. 000 2C + 0. 006 1，R2=0.999 5。A 為吸光度，C 為標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度。線性范圍95.3 ～3 050.0 μg/mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 ILs 種類對總木脂素得率的影響 實驗條件為濃度0.68 mol/L，液料比15∶1 mL/g，浸泡時間2 h，提取溫度50 ℃，提取時間30 min，提取1 次，考察ILs種類對杜仲總木脂素得率的影響，結(jié)果見表1。

表1 ILs 種類對總木脂素得率的影響Table 1 The influence of variety of ILs on the yield of total lignans

由表1 可知，從［C2mim］Br 到［C4mim］Br，總木脂素得率隨著碳鏈長度的增加而增大，從［C4mim］Br到［C6mim］Br，總木脂素得率隨碳鏈長度的增加而降低。這可能是因為碳鏈過短，空間位阻太小，溶出目標(biāo)成分木脂素的同時也溶出大量非目標(biāo)成分;碳鏈過長，空間位阻太大，不利于木脂素的溶出。所以選擇［C4mim］+作為實驗提取溶劑的陽離子。

ILs 中的陰離子主要控制水溶性，陰離子對木脂素的多重交互作用如ρ-ρπ 鍵、氫鍵、溶劑效應(yīng)等各不相同，其水溶性也各不相同，因而對木脂素的水溶性也各不相同，鹽在3 種離子液體中提取杜仲皮總木脂素的得率最高，選擇［C4mim］BF4作為提取試劑。

2.1.2 液料比對總木脂素得率的影響 實驗條件為0.68 mol/L［C4mim］BF4溶液，浸泡時間2 h，提取溫度50 ℃，提取時間30 min，提取1 次，考察液料比對杜仲總木脂素得率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 液料比對總木脂素得率的影響Fig.1 The influence of liquid-solid ratio on the yield of total lignans

由圖1 可知，總木脂素得率隨著溶劑用量的增加而提高，當(dāng)液料比超過15∶1 mL/g 后總木脂素得率無明顯增加。這可能是因為杜仲皮的量一定，在一定程度上增大溶劑用量，會提高總木脂素得率，但當(dāng)液料比過高時，杜仲組織中的總木脂素幾乎全部溶出，故繼續(xù)增大液料比，總木脂素得率增加不顯著。因此，確定液料比為15∶1 mL/g。

2.1.3 ［C4mim］BF4濃度對總木脂素得率的影響實驗條件為15∶1 mL/g［C4mim］BF4溶液，浸泡時間2 h，提取溫度50 ℃，提取時間30 min，提取1 次，考察［C4mim］BF4濃度對杜仲總木脂素得率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 ［C4mim］BF4濃度對總木脂素得率的影響Fig.2 The influence of［C4mim］BF4’s concentrations on the yield of total lignans

由圖2 可知，隨［C4mim］BF4的濃度增加，總木脂素得率增長;［C4mim］BF4濃度＞0.68 mol/L，總木脂素得率變緩。其原因可能與溶液粘度有關(guān)。當(dāng)濃度進(jìn)一步增加，溶液粘度也會繼續(xù)增大，［C4mim］-BF4繼續(xù)滲透到杜仲組織的能力和總木脂素溶出的能力都降低，得率增加不顯著。為節(jié)約成本，［C4mim］BF4濃度選0.68 mol/L。

2.1.4 提取溫度對總木脂素得率的影響 實驗條件為0. 68 mol/L［C4mim］BF4溶 液，液 料 比15∶1 mL/g，浸泡時間2 h，提取時間30 min，提取1次，考察提取溫度對杜仲總木脂素得率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 提取溫度對總木脂素得率的影響Fig.3 The influence of ultrasonic temperatureon the yield of total lignans

由圖3 可知，隨著提取溫度的升高，總木脂素得率升高，＞50 ℃后變緩。這可能與超聲波提取技術(shù)的基本原理有關(guān)。超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈振動、強(qiáng)烈空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)、熱效應(yīng)等能破壞杜仲組織細(xì)胞，增大溶劑的運動頻率和速度，使溶劑滲透到杜仲組織細(xì)胞中，加速木脂素類物質(zhì)間的溶出，從而增加總木脂素得率。但溫度過高，對這些效應(yīng)及其協(xié)同作用的貢獻(xiàn)不大，因而其對總木脂素得率的貢獻(xiàn)不明顯。從總木脂素得率及節(jié)約能源的角度出發(fā)，提取溫度為50 ℃。

2.1.5 提取時間對總木脂素得率的影響 實驗條件 為0. 68 mol/L ［C4mim］BF4溶 液、液 料 比15∶1 mL/g，浸泡時間2 h，提取溫度50 ℃，提取1次，考察提取時間對杜仲總木脂素得率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 提取時間對總木脂素得率的影響Fig.4 The influence of ultrasonic time on the yield of total lignans

由圖4 可知，總木脂素得率隨著提取時間的增加而增加，30 min 后降低。因為總木脂素從杜仲組織中溶出時需要一定時間，故而延長超聲提取時間，溶解度增大，總木脂素得率會增大，但提取時間過長，有些木脂素可能會發(fā)生分解反應(yīng)，而雜質(zhì)會繼續(xù)溶出，從而使得木脂素的得率降低。從得率、節(jié)約能源、節(jié)約時間等方面考慮，提取時間為30 min。

2.1.6 浸泡時間對總木脂素得率的影響 實驗條件 為0. 68 mol/L ［C4mim］BF4溶 液，液 料 比15∶1 mL/g，提取溫度50 ℃，提取時間30 min，提取1次，考察浸泡時間對杜仲總木脂素得率的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 浸泡時間對總木脂素得率的影響Fig.5 The influence of soaking time on the yield of total lignans

由圖5 可知，總木脂素得率隨著浸泡時間的增加而增加;2 h 后，總木脂素得率逐漸趨于平緩。這可能是因為溶劑滲透到杜仲組織和總木脂素從杜仲組織中溶出均需要一定時間，故適當(dāng)延長浸泡時間，總木脂素得率會增加;繼續(xù)延長浸泡時間，溶劑滲透到杜仲組織和總木脂素從杜仲組織中溶出的過程都達(dá)到平衡，故得率增加不顯著。因此，浸泡時間選2 h。

2.1.7 提取次數(shù)對總木脂素得率的影響 實驗條件為0. 68 mol/L［C4mim］BF4溶 液，液 料 比15∶1 mL/g，浸泡時間2 h，提取溫度50 ℃，提取時間30 min，考察提取次數(shù)對杜仲總木脂素得率的影響，結(jié)果見表2。

表2 提取次數(shù)對總木脂素得率的影響Table 2 The influence of number of extractioncycles on the yield of total lignans

由表2 可知，隨提取次數(shù)的增加，杜仲總木脂素得率增加不顯著，因此，提取1 次即可。

2.2 響應(yīng)面實驗

2.2.1 響應(yīng)面實驗結(jié)果 參照單因素實驗結(jié)果，根據(jù)Box-Behnken 的設(shè)計原理，確定［C4mim］BF4濃度、液料比和提取溫度3 個因素為影響杜仲總木脂素得率比較顯著的因素，對其進(jìn)行3 因素3 水平實驗設(shè)計。各因素水平見表3，實驗結(jié)果見表4。

表3 響應(yīng)面因素水平表Table 3 Factors and levels of RSM analysis

表4 響應(yīng)面實驗結(jié)果Table 4 The experiment results of RSM

回歸模型為:Y =29. 161 54A +0. 776 41B +0.468 54C－0.260 58AB+0.511 06AC－3.010 00E-003BC－133.006 66A2－0.015 576B2－4.744 00E-003C2－11.537 90。其方差分析見表5。

表5 二次回歸模型方差分析Table 5 Variance analysis for the regression model

由表5 可知，該回歸模型F =28.27，概率P =0.000 1 ＜0.01，表明模型顯著，該實驗方法可行;確定系數(shù)R2=0.97，調(diào)整確定系數(shù)Radj2=0.94，說明回歸模型擬合度較好，線性關(guān)系比較好;失擬項F =4.10，概率P =0.10 ＞0.05，表明失擬項不顯著，那些未知因素對本實驗結(jié)果干擾比較小，可用該模型代替真實實驗點對實驗結(jié)果進(jìn)行分析;變異系數(shù)c.v. =1.78%，說明該回歸模型精密度比較好。由表5 以及回歸模型知，3 個因素對總木脂素得率的影響順序為:［C4mim］BF4濃度＞液料比＞提取溫度。

杜仲皮總木脂素得率的響應(yīng)曲面圖見圖6。

圖6 兩兩交互作用與總木脂素得率的三維響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plots for the interation of two factors on the yield of total lignans

2.2.2 驗證實驗 根據(jù)Box-Behnken 實驗結(jié)果以及回歸模型，利用Design Expert 8.0.6 軟件，得到最佳工藝條件:0.87 mol/L［C4mim］BF4溶液，液料比18.27∶1 mL/g，浸泡時間2 h，提取溫度54.28 ℃，提取時間30 min，提取1 次。考慮到實驗方便可行，改為0.87 mol/L［C4mim］BF4溶液，液料比18∶1 mL/g，提取溫度54 ℃，提取時間30 min，浸泡時間2 h，提取1 次。重復(fù)3 次，得率為11.03%，RSD=0.41%。表明該工藝重現(xiàn)性好。

2.3 與普通溶劑、傳統(tǒng)提取法的比較

采用乙醇-超聲輔助提取法［16］提取得到的杜仲總木脂素得率為7. 83%;采用乙醇-熱回流提取法［19］得到的杜仲總木脂素得率為10.07%;用［C4mim］BF4-超聲波輔助法提取得到的杜仲總木脂素得率為11.03%，比用乙醇熱回流法高9.53%，但縮短了83 min，說明離子液體超聲輔助提取法是一種快速、高效的提取法;比用乙醇超聲波輔助法提取時高40.87%。這是因為將離子液體用作溶劑時，超聲的空化效應(yīng)能加速離子液體［C4mim］BF4穿透植物組織，促進(jìn)植物組織內(nèi)的木脂素類物質(zhì)溶出，且［C4mim］BF4為陽離子表面活性劑，對杜仲皮總木脂素有增溶作用，同時［C4mim］BF4可能作為一種運載體將木脂素從植物細(xì)胞內(nèi)運出，增大了其溶出率，從而提高了杜仲總木脂素得率。這也可能是因為［C4mim］BF4的溶劑效應(yīng)很強(qiáng)，對糖苷的溶出起著關(guān)鍵性的作用。也可能是氫鍵和p-p π 鍵共同作用，有利于含糖苷和苯環(huán)等結(jié)構(gòu)的木脂素的溶出。

3 結(jié)論

用離子液體超聲波輔助法提取杜仲皮總木脂素較優(yōu)的離子液體為［C4mim］BF4，最優(yōu)的提取工藝為:濃度0. 87 mol/L［C4mim］BF4溶液，液料比18∶1 mL/g，浸泡時間2 h，提取溫度54 ℃，提取時間30 min，提取1 次，得率為11.03%。該工藝提取時間短、能耗低、操作簡便、提取效率高、所需溶劑少，為杜仲資源的深度開發(fā)利用提供了一定的依據(jù)。

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