史小玲，李燕，王曉燕，唐利，陳楓，鐘森，陳莊

（1.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，四川 瀘州646000；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都610075）

基因疫苗又稱(chēng)DNA疫苗，是近年來(lái)研究的一種新型疫苗，成分清楚，制備簡(jiǎn)單，可產(chǎn)生強(qiáng)烈而持久的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答，而成為免疫調(diào)節(jié)劑的較好選擇，在疫苗研究中倍受關(guān)注[1]。目前，已有4種DNA疫苗產(chǎn)品經(jīng)許可用于畜禽疾病治療，并且DNA疫苗正以更加優(yōu)化的結(jié)構(gòu)、更好的設(shè)計(jì)應(yīng)用于人類(lèi)疾病治療的臨床研究[2]。在之前的實(shí)驗(yàn)中，筆者將結(jié)核桿菌HSP70基因與人CD80基因拼接，并以pcDNA3.1（+）為載體構(gòu)建嵌合DNA真核表達(dá)質(zhì)粒[3]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)該嵌合DNA質(zhì)粒，對(duì)結(jié)核桿菌有很強(qiáng)的抑制作用，并能使IFN-γ 明顯增高[4]。在哮喘小鼠實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)它能有效減輕炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，且小鼠肺泡洗脫液中IFN-γ 明顯升高[5]。由于pcDNA3.1（+）含有氨卞霉素抗性篩選基因，不能用于人體實(shí)驗(yàn)。因此，本實(shí)驗(yàn)選用美國(guó)食品和藥品管理委員會(huì)（FDA）推薦唯一可用于人體實(shí)驗(yàn)的質(zhì)粒pVAX1作為載體重新構(gòu)建，并觀察其在體內(nèi)外的表達(dá)和免疫反應(yīng)，以期為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

pcDNA3.1-Hsp70/CD80真核表達(dá)質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建保存，質(zhì)粒pVAX1、感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α 購(gòu)于Invitrogen公司，人胚腎細(xì)胞293T細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，SPF級(jí)雌性健康BALB/c小鼠20只購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)[合格證號(hào)SCXK（渝）2007-0003]，限制性?xún)?nèi)切酶HindⅢ、XbaⅠ、T4連接酶購(gòu)自New England Biolabs，DNA膠回收試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司，Endofree Plasmid Giga Kit購(gòu)自Qiagen公司，Lipofectamine LTX and Plus Reagen購(gòu)于Invitrogen公司，鼠抗結(jié)核桿菌Hsp70單克隆抗體購(gòu)自Lifespan Biosciences公司，鼠抗人CD80單克隆抗體購(gòu)自Abcam公司，Western blot試劑購(gòu)自上海碧云天生物公司，總RNA提取試劑盒（離心柱型）購(gòu)自北京天根生化科技有限公司，TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0購(gòu)自大連寶生物公司；Sso FastEva Green Supermix購(gòu)自Bio-Rad公司，BIO-ROD核酸蛋白成像儀，iCycler iQ Real-time PCR擴(kuò)增儀。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒pVAX1-Hs p70/C D80 的構(gòu)建與鑒定 HindⅢ和XbaⅠ酶切既往構(gòu)建的質(zhì)粒pcDNA 3.1-Hsp70/CD80和載體PVAX1，將目的基因Hsp70/CD80定向連接入已酶切pVAX1中，構(gòu)建質(zhì)粒pVAX1-Hsp70/CD80，酶切鑒定后由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。將pVAX1-Hsp70/CD80質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入DH5α。用QIAGEN公司去內(nèi)毒素級(jí)質(zhì)粒大量提取試劑盒，按說(shuō)明書(shū)提取純化的質(zhì)粒DNA。

1.2.2 pVAX1-Hs p70/C D80 體外瞬時(shí)表達(dá) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，使細(xì)胞匯合度達(dá)到50%～80%時(shí)，按Lipofectamine LTX and Plus Reagen轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分別于轉(zhuǎn)染后24、48和72 h收獲細(xì)胞，加入裂解液釋放蛋白質(zhì)，離心取上清，與5×上樣緩沖液混勻并煮沸使蛋白質(zhì)變性。SDS-page電泳，轉(zhuǎn)膜。分別加入Hsp70、CD80一抗4℃孵育過(guò)夜，洗膜后二抗孵育1 h，加入化學(xué)發(fā)光試劑置于核酸蛋白成像儀成像。

1.2.3 pVAX1-Hs p70/C D80 體外穩(wěn)定表達(dá) 轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h，按1×104個(gè)/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，并進(jìn)行有限稀釋。培養(yǎng)24 h后加入1 000mg G418篩選。篩選10～14 d后，有大量細(xì)胞死亡，可見(jiàn)有抗性的克隆出現(xiàn)，以500mg G418維持，擴(kuò)增培養(yǎng)。獲得的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系命名為293T-HSP70/CD80。Western blot檢測(cè)Hsp70、CD80蛋白表達(dá)。方法同上。

1.2.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 近交系BALB/c小鼠20只，飼養(yǎng)于獨(dú)立通風(fēng)換氣籠具（individually ventilated cages，IVC）中。動(dòng)物按注射時(shí)間分為7 d組、15 d組、30 d組、180 d組，共5組（每組3只）。7 d組、15 d組、30 d組和180 d組小鼠股四頭肌分別注射pVAX1-Hsp70/CD80質(zhì)粒和7.5 g/L布比卡因混懸液（4∶1）125μl，含質(zhì)粒100μg，注射125μl生理鹽水代替。對(duì)照組小鼠分別于注射后7、15、30和180 d處死，并取眼球血以及肌肉、淋巴結(jié)、骨髓、脾、肝、肺、腎、胸腺組織冷凍儲(chǔ)存-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 R T-PCR 檢測(cè)Hs p70 和C D80 在小鼠體內(nèi)的表達(dá) 從肌肉、淋巴結(jié)、骨髓、脾、肝、肺、腎、胸腺組織中提取RNA，按總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。按TaKaRa RNA PCRKit說(shuō)明書(shū)制備cDNA模板，并進(jìn)行PCR反應(yīng)。引物序列：HSP70上游引物CGTCGTCTCGGTTCTGGAAGGTG，下游引物CATTG AAGTAGGCGGGCGTCGTG；CD80上游引物ACACG GAGGCAGGGAACATCACC，下游引物TGGGCGCAG AGCCAGGATCACA。PCR結(jié)果行瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.6 Real-time PCR 檢測(cè)小鼠脾臟組織中IFN-γ 和IL-4 表達(dá) 從脾臟中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA。進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)。引物序列：IFN-γ 上游引物：AACTCAAGTGGCATAGATGTGGAAG，下游引物：GACGCTTATGTTGTTGCTGATGG；IL-4上游引物：TTTTGAACGAGGTCACAGGAGAGG，下游引物：CCTTGGAAGCCCTACAGACGAG；β-actin上游引物：AGGGTGTGATGGTGGGAAT，下游引物：CTCGGTGAGCAGCACAGG。反應(yīng)完成后用Bio-Rad iQ5軟件進(jìn)行分析，按照Pfaffl法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間差異用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pVAX1-Hsp70/CD80構(gòu)建與鑒定

經(jīng)內(nèi)切酶HindⅢ和XbaⅠ雙酶切前后的瓊脂糖電泳，電泳結(jié)果符合預(yù)期，表明其建立成功。見(jiàn)圖1。送上海生工生物工程有限公司測(cè)序后證實(shí)該質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 Western blot檢測(cè)pVAX1-Hsp70/CD80轉(zhuǎn)染

293T細(xì)胞的蛋白質(zhì)真核瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)結(jié)果見(jiàn)圖2，轉(zhuǎn)染24、48、72 h后穩(wěn)定轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞均有33和72 kD左右的蛋白表達(dá)；轉(zhuǎn)染前293T細(xì)胞無(wú)表達(dá)。

2.3 pVAX1-Hsp70/CD80 mRNA體內(nèi)表達(dá)分布

RT-PCR檢測(cè)接種7和15 d肌肉、淋巴結(jié)、骨髓、脾、肝、肺、腎、胸腺組織均有Hsp70和CD80表達(dá)。接種30 d肌肉、肺和肝有Hsp70表達(dá)，未見(jiàn)CD80表達(dá)。180 d均未檢測(cè)出Hsp70/CD80表達(dá)，見(jiàn)圖3。

2.4 Real time PCR檢測(cè)IFN-γ 和IL-4基因表達(dá)

結(jié)果顯示，注射pVAX1-Hsp70/CD80質(zhì)粒7和15 d后IFN-γ 有高水平表達(dá)，且高于對(duì)照組（P<0.05）。注射pVAX1-Hsp70/CD80質(zhì)粒180 d后IFNγ 基因表達(dá)降低，與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖4。

圖1 重組質(zhì)粒pVAX1-Hsp70/CD80雙酶切電泳圖

圖2 pVAX1-Hsp70/CD80轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)

圖3 Hsp70和CD80在各組織中的表達(dá)

圖4 注射pVAX1-Hsp70/CD80質(zhì)粒后7、15、30和180 d IFN-γ 和IL-4基因表達(dá)量

3 討論

分枝桿菌熱休克蛋白70（heat shock protein70，HSP70）包含多個(gè)T細(xì)胞和B細(xì)胞表位，可激活效應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答，具有免疫優(yōu)勢(shì)抗原的特點(diǎn)。還具有結(jié)合和呈遞抗原肽的作用，能夠干擾多種細(xì)胞內(nèi)炎癥信號(hào)通路，從而抑制炎癥反應(yīng)[6]，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫平衡[7]。CD80（B7-1）表達(dá)于活化的B、T淋巴細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及外周血單核細(xì)胞，具有免疫活化功能，是重要的共刺激分子之一。CD80與其共刺激配體CD28和/或CTLA-4是活化T淋巴細(xì)胞時(shí)的刺激因子，在體液免疫和細(xì)胞免疫中發(fā)揮重要的全面活化作用[8]。有研究表明[9]，CD80與其配體CTLA-4結(jié)合會(huì)對(duì)致敏過(guò)程中變應(yīng)原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用。本實(shí)驗(yàn)中，將拼接的結(jié)核桿菌HSP70和人CD80編碼基因定向連接于pVAX1中，經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定構(gòu)建質(zhì)粒pVAX1-Hsp70/CD80成功。應(yīng)用陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)法將重組質(zhì)粒pVAX1-Hsp70/CD80轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞，經(jīng)G418篩選后，獲得陽(yáng)性克隆，通過(guò)Western blot鑒定，證實(shí)Hsp70和CD80在該細(xì)胞水平均有表達(dá)。

與傳統(tǒng)疫苗比較，DNA疫苗具有多方面的優(yōu)點(diǎn)[10]。但是DNA疫苗的安全性和有效性是在進(jìn)入臨床治療前必須首先滿(mǎn)足的要求。目前，研究大多數(shù)偏重于功能性DNA疫苗的構(gòu)建，而較少考慮到其安全性的問(wèn)題。本文在上述體外實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，檢測(cè)pVAX1-Hsp70/CD80接種小鼠后Hsp70和CD80在各組織的表達(dá)及小鼠的免疫反應(yīng)。結(jié)果顯示接種后7和15 d組肌肉、淋巴結(jié)、骨髓、脾、肝、肺、腎、胸腺組織均有Hsp70和CD80表達(dá)，且脾臟IFN-γ 基因有較高水平表達(dá)。說(shuō)明該質(zhì)粒能廣泛表達(dá)Hsp70和CD80，并能誘導(dǎo)IFN-γ 產(chǎn)生較高表達(dá)，對(duì)機(jī)體免疫反應(yīng)有明顯的調(diào)節(jié)作用。目前，涉及質(zhì)粒DNA廣泛生物分布的機(jī)制尚不清楚。據(jù)推測(cè)，可能是由于載體質(zhì)粒的運(yùn)輸或轉(zhuǎn)染細(xì)胞的運(yùn)輸作用[11]。然而，質(zhì)粒DNA在體內(nèi)廣泛分布不能只限于一個(gè)特定的機(jī)制或細(xì)胞類(lèi)型。裸DNA免疫機(jī)體后，它可以通過(guò)不同的細(xì)胞，如細(xì)胞CD11b+（2），CD11c（23，24），CD11c和CD19（3）到達(dá)遠(yuǎn)處的臟器[12]。同時(shí)，也不能排除質(zhì)粒DNA通過(guò)血液或淋巴系統(tǒng)運(yùn)輸。然而，接種30 d在肌肉、肺和肝有Hsp70表達(dá)，未見(jiàn)CD80表達(dá)，且脾臟IFN-γ 基因表達(dá)明顯降低。180 d后未檢測(cè)出表達(dá)，IFN-γ 基因表達(dá)幾乎降低到對(duì)照組水平。說(shuō)明其表達(dá)雖然廣泛但有一定時(shí)間性，不會(huì)長(zhǎng)期無(wú)限制表達(dá)而打亂機(jī)體自身免疫平衡，這為疫苗在后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究中奠定了理論基礎(chǔ)，也為該疫苗在臨床應(yīng)用提供了可能。

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