丁英鈞，梁文杰，龐金奎，劉洪斌，趙玉庸

(1.河北中醫(yī)學(xué)院，石家莊 050200;2.河北省中西醫(yī)結(jié)合肝腎病證重點實驗室，石家莊 050200; 3.河北省泊頭市醫(yī)院，河北泊頭 062150;4.河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，石家莊 050017)

腎消通絡(luò)方對糖尿病腎病大鼠腎臟TGF-β1/Smad信號傳導(dǎo)通路的影響?

丁英鈞1，2，梁文杰1，2，龐金奎3，劉洪斌4，趙玉庸1

(1.河北中醫(yī)學(xué)院，石家莊 050200;2.河北省中西醫(yī)結(jié)合肝腎病證重點實驗室，石家莊 050200; 3.河北省泊頭市醫(yī)院，河北泊頭 062150;4.河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，石家莊 050017)

目的:探討腎消通絡(luò)方對糖尿病腎病大鼠TGF-β1/Smad信號傳導(dǎo)通路的影響。方法:將實驗動物分為正常組、模型組、厄貝沙坦組及中藥組4組，免疫組化法測定腎組織TGF-β1蛋白表達，RT-PCR法測定TGF-β1mRNA表達，Western blot法測定Smad2/3及Smad7的表達。結(jié)果:中藥組和厄貝沙坦組TGF-β1蛋白的表達水平較模型組有所降低，TGF-β1 mRNA水平明顯低于模型組，Smad2/3水平明顯低于模型組，Smad7水平明顯高于模型組。結(jié)論:腎消通絡(luò)方可抑制TGF-β1mRNA及其蛋白的表達，同時抑制Smad2/3表達而提高Smad7的表達。

腎消通絡(luò)方;糖尿病腎病;TGF-β1;Smad;信號傳導(dǎo)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)常見并發(fā)癥之一，是DM患者的主要死亡原因之一。TGF-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是DN發(fā)病過程中的重要細胞因子，TGF-β1/Smads信號傳導(dǎo)通路激活是腎纖維化發(fā)生發(fā)展的重要機制［1］，故有效切斷TGF-β1的信號傳導(dǎo)是減輕和終止纖維化的關(guān)鍵?！澳I消通絡(luò)方”是在前期研究方劑“腎絡(luò)通”的基礎(chǔ)上優(yōu)化而成，由黃芪、元參、黃連、丹參、鬼箭羽、金雀根、紅曲、蟬蛻、地龍、烏梢蛇等組成，經(jīng)前期臨床和實驗證實有改善腎功能、減輕腎臟組織病理改變等作用。本研究采用腹腔注射鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)法復(fù)制DM大鼠模型，研究腎消通絡(luò)方對糖尿病腎病大鼠腎臟TGF-β1/Smad信號傳導(dǎo)通路的影響，以探索腎消通絡(luò)方的腎保護作用機制，從而為臨床提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物及用藥

雄性清潔級SD大鼠50只，體質(zhì)量(200±20) g，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供(合格證編號129014)。腎消通絡(luò)方各藥材購自國藥河北樂仁堂醫(yī)藥連鎖有限公司，每付藥物共177 g浸泡30 min后共煎，煎煮2次每次30 min，將2次煎出藥液混合，濃縮至約90 ml，約為含生藥2 g/ml。厄貝沙坦由賽諾菲(杭州)制藥有限公司生產(chǎn)，調(diào)制濃度為2.5 mg/ml備用。

1.2 主要試劑及儀器

鏈脲佐菌素(STZ)，美國Sigma公司;TGF-β1抗體，美國 Santa Cruz公司;Smad2/3抗體，美國Santa Cruz公司;Smad7抗體，美國Santa Cruz公司; CTGF抗體，美國Santa Cruz公司;PE9600型PCR擴增儀，美國PE公司;RM2245型切片機，德國LEICA公司;SIM-F140AY65型制冰機，日本SANYO公司; BX53型顯微鏡，日本奧林巴斯公司。

2 方法

2.1 動物模型及分組

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機抽取10只為正常組，其余40只為造模組。造模組按空腹體質(zhì)量一次性腹腔注射1%STZ 50 mg/kg制作DM模型，正常組注射等量緩沖液。72 h后，尾靜脈取血測定造模組空腹血糖，高于16.7 mmol/L者為成功DM模型。對成模的33只大鼠進行隨機分組:模型組、厄貝沙坦組、中藥組，每組各11只。次日起灌服給藥，每日8∶00，每日1次，中藥組按生藥20 g/ (kg·d);厄貝沙坦組按25 mg/(kg·d)給藥，共12周。模型組和正常組給予等量蒸餾水，自由飲食。試驗期間，模型組大鼠死亡3只，厄貝沙坦組、中藥組各死亡2只。

2.2 指標檢測

2.2.1 免疫組化 采用SABC法測定腎組織TGF-β1的表達，使用 BX53型顯微鏡和 Adobe photoshop 7.1軟件采集圖像。

2.2.2 RT-PCR 采用Trizol一步法提取腎組織RNA、RT反應(yīng)，測試管中分別加入引物Rat TGF-β1(301 bp);上游:5′-GTCAACTGTGGAGCAACACG-3，下游:5′-CATGAGGAGCAGGAAGGGTC-3′;Rat GAPDH(594 bp):上游:5′-CCTTCATTGACCTCA ACTAC-3′，下游:5′-GGAAGGCCATGCCAGTGAGC-3′。按反應(yīng)條件進行擴增，然后95℃預(yù)變性5 min，94℃變性60 s，根據(jù)引物不同要求退火，72℃延伸60 s，72℃終末延伸10 min，共30循環(huán)，電泳后紫外燈下觀察結(jié)果。Quantity One凝膠軟件分析目的電泳條帶，以 GAPDH電泳條帶為參照，待測條帶與GAPDH進行對比，表示相對表達水平。

2.2.3 Western blot 測定腎組織中Smad2/3、Smad7的表達。稱取500～600 mg腎組織，加蛋白抽提緩沖液1ml勻漿離心取上清。將此樣品加入等體積2×SDS上樣緩沖液，100℃ 3～5 min，-20℃保存待用。將8 μl樣品加入預(yù)制的10%SDS-聚丙酰胺凝膠中電泳分離，采用水浴式電印跡將凝膠中的蛋白電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜(NC膜)上。將膜置于封閉液中靜止過夜，加入第一抗體，室溫緩慢搖動2 h洗膜，加入第二抗體，室溫緩慢搖動1 h洗膜。而后DAB顯色、照相分析，使用凝膠分析軟件測定各條帶的平均光密度值(OD值)，待測蛋白質(zhì)表達量與GAPDH表達量比值，表示蛋白質(zhì)的相對表達水平。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)值變量以均數(shù)±標準差(±s)表示。數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，組間比較采用SNK檢驗，所有假設(shè)檢驗方法顯著性水準以P＜0.05為準。

3 結(jié)果

3.1 腎消通絡(luò)方對DN大鼠腎組織TGF-β1蛋白表達的影響

圖1顯示，免疫組化結(jié)果顯示，正常組TGF-β1在腎小球、腎小管處均有少量表達;模型組、厄貝沙坦組、中藥組TGF-β1的表達水平明顯高于正常組;模型組在腎小球內(nèi)可見TGF-β1大量表達，在內(nèi)皮細胞、系膜細胞處均呈現(xiàn)表達增高，在細胞外基質(zhì)也有散在陽性表達;厄貝沙坦組和中藥組TGF-β1的表達水平較模型組有所降低，部分腎小球出現(xiàn)表達增高，整體水平較模型組呈現(xiàn)下調(diào)，厄貝沙坦組和中藥組之間差異不明顯。

3.2 腎消通絡(luò)方對 DN大鼠腎組織 TGF-β1mRNA表達的影響

表1圖2顯示，模型組、厄貝沙坦組、中藥組TGF-β1 mRNA水平較正常組明顯升高(P＜0.05)，模型組較厄貝沙坦組、中藥組TGF-β1 mRNA水平明顯升高(P＜0.05)，厄貝沙坦組、中藥組之間TGF-β1 mRNA水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

3.3 腎消通絡(luò)方對 DN大鼠腎臟 Smad2/3、Smad7表達的影響

表1圖3顯示，模型組的Smad2/3水平明顯高于正常組(P＜0.05)，厄貝沙坦組、中藥組的Smad2/3水平明顯低于模型組 (P＜0.05)，而正常組、厄貝沙坦組、中藥組之間Smad2/3水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。厄貝沙坦組、中藥組的Smad7水平明顯高于正常組、模型組(P＜0.05)，且中藥組Smad7水平較厄貝沙坦組明顯升高(P＜0.05)，正常組、模型組之間Smad7水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 各組大鼠腎臟TGF-β1 mRNA、Smad2/3、Smad7水平的表達(±s)

表1 各組大鼠腎臟TGF-β1 mRNA、Smad2/3、Smad7水平的表達(±s)

注:與正常組比較:▲P＜0.05;與模型組比較:*P＜0.05;與厄貝沙坦組比較:^P＜0.05

組別 例數(shù) TGF-β1 mRNA/GAPDH Smad2/3/GAPDH Smad7/GAPDH正 常 組 10 0.4788±0.00473 0.2961±0.01224*0.2678±0.0284模 型 組 8 1.4668±0.01761▲ 0.7606±0.16494 0.3178±0.03413厄 貝 沙 坦 組 9 0.8158±0.3856＊▲ 0.3629±0.05336* 0.4679±0.04626＊▲中 藥 組 9 1.0152±0.1583＊▲ 0.4664±0.05475* 0.5243±0.02824＊▲^

圖1 各組大鼠腎組織TGF-β1蛋白表達(10×40)

圖2 各組腎組織TGF-β1mRNA的表達

圖3 各組大鼠腎臟Smad2/3、Smad7水平的表達

4 討論

腎消通絡(luò)方是基于DN“熱傷氣陰，腎絡(luò)瘀阻”基本病機［2-3］，以“益氣養(yǎng)陰，清熱通絡(luò)”為治法組方而成。方中黃芪益氣健脾、利水消腫;元參滋陰清熱;黃連、地錦草清熱瀉火解毒，藥理研究二者具有降低血糖的作用;丹參、鬼箭羽、金雀根活血化瘀，金雀根藥理研究具有免疫抑制、抗炎、降壓等作用，可降低蛋白尿;紅曲藥食兩用，健脾化痰，活血化瘀，具有降脂之功;蟬蛻、地龍、烏梢蛇等藥化瘀通絡(luò)，本方特點為采用多種蟲類藥，蟲類走竄，入絡(luò)搜剔，具有攻沖之性，善入細微孔隙之處，對于瘀血阻絡(luò)、正虛邪深之痼疾其效尤著。

4.1 腎消通絡(luò)方可抑制TGF-β1 mRNA及蛋白的表達

TGF-β1作用于腎細胞產(chǎn)生ECM，終致纖維化發(fā)生。TGF-β1/Smad途徑是TGF-β1主要的作用途徑［1］，因此抑制 TGF-β1表達的中藥可有效拮抗TGF-β1/Smads信號傳導(dǎo)通路，從而發(fā)揮抗纖維化作用。在多種DN的模型中，TGF-β1 mRNA及TGF-β1表達均明顯升高，并伴有腎臟肥大和細胞外基質(zhì)增多，臨床研究顯示［4］下調(diào)或抑制腎臟TGF-β1表達水平是降壓藥物發(fā)揮DN防治作用的重要途徑。本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠 TGF-β1 mRNA及 TGF-β1表達明顯升高，其含量與腎臟病理損傷程度明顯相關(guān)，表明TGF-β1參與了DN的發(fā)生和進展。腎消通絡(luò)方有明顯的調(diào)節(jié)作用，提示對TGF-β1的干預(yù)是腎消通絡(luò)方的重要作用靶點。

4.2 腎消通絡(luò)方降低Smad2/3表達水平，提高Smad7表達水平

TGF-β1/Smads信號傳導(dǎo)通路由TGF-β、TGF-β受體(transforming growthfactor-β receptor，TβR)及受體底物Smad蛋白家族信號分子組成。TGF-β1與TβR形成受體復(fù)合物，激活Smads蛋白，將信號傳導(dǎo)至細胞核行使轉(zhuǎn)錄因子的功能。Smads可分為3型:①受體調(diào)節(jié)型(R-Smad)，包括Smad1、2、3、5、8、9;②共同介質(zhì)型(Co-Smad)，即Smad4;③抑制型(ISmad)，即Smad6、7。其中Smad2和Smad3直接被Ⅰ型受體激酶在-SXSC末端基序的2個絲氨酸殘基磷酸化，與Smad4結(jié)合成為復(fù)合物，轉(zhuǎn)入核內(nèi)調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄并產(chǎn)生效應(yīng)［5］。Smad6、7為逆向調(diào)控因子［6］，可抑制TβRI對Smad 2和Smad 3的磷酸化，阻抗TGF-β1/Smads的信號傳導(dǎo)，抑制纖維化。Smads蛋白家族是TGF-β1信號傳導(dǎo)通路中的關(guān)鍵分子，是將信號從細胞質(zhì)傳導(dǎo)細胞核的中轉(zhuǎn)分子。研究發(fā)現(xiàn)［7］，DM大鼠腎組織TGF-β1的表達顯著增加，Smad7的表達減少;經(jīng)胰島素控制血糖后，TGF-β1的表達減少，Smad7顯著上調(diào)，大鼠腎纖維化病變明顯改善。Smad基因敲除，可以預(yù)防或逆轉(zhuǎn)DM狀態(tài)小鼠腎臟纖維化［8］。本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠Smad2/3表達水平明顯升高，而Smad7表達水平較低，表明TGF-β1/Smad信號通路是DN發(fā)生的關(guān)鍵機制;中藥組的Smad2/3表達水平顯著降低，而Smad7表達水平升高，表明腎消通絡(luò)方可以Smads為靶點調(diào)控TGF-β1/Smad信號通路。

總之，腎消通絡(luò)方可抑制 TGF-β1 mRNA及TGF-β1的表達，同時可降低Smad2/3表達水平，提高Smad7表達水平，提示對TGF-β1/Smad信號通路的干預(yù)可能是腎消通絡(luò)方的作用機制之一。

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Effects of Shenxiao Tongluo Prescription on the TGF-1/Smad Signal Transduction Pathway in the Kidney of Diabetic Nephropathy Rats

DING Ying-jun1，2，LIANG Wen-jie1，2，PANG Jin-kui3，LIU Hong-bin4，ZHAO Yu-yong1
(1．Hebei University of Traditional Chinese Medicine，Hebei Shijiazhuang 050200，China;2．Hebei Key Laboratory of Integrative Medicine on Liver-kidney patte，Hebei Shijiazhuang 050200，China;3．Hebei Botou City Hospital，Hebei Botou 062150，China;4．Graduate School of Hebei Medical University，Hebei Shijiazhuang 050017，China)

Objective:To study the effects of Shenxiao Tongluo Decoction on TGF-β1/Smad signaling pathway in rats with diabetic nephropathy.Methods:The experimental animals were divided into 4 groups:normal group，model group，irbesartan group，and Shenxiao Tongluo group. The expression of TGF-β1 in renal tissue was examined by immunohistochemical technique.The expressions of TGF-β1mRNA was detected by RT-PCR.The expressions of Smad2/3 and Smad7 were examined by Western blot.Results:The expressions of TGF-β1 in irbesartan group and shenxiao Tongluo group was lower than model group，and the expressions of TGF-β1 mRNA significantly lower than model group.The expressions of Smad2/3 was significantly lower than model group.Smad7 was significantly higher than model group. Conclusions:Shenxiao Tongluo decoction can inhibit the expressions of TGF-β1 mRNA and protein，and inhibit the expressions of Smad2/3 but promote the expression of Smad7.

Shenxiao Tongluo decoction;Diabetic nephropathy;TGF-β1;Smad;Signal transduction

R285.5

:B

:1006-3250(2015)09-1099-03

2015-02-26

河北省自然科學(xué)基金資助項目(C2011206054);河北省中醫(yī)藥管理局科研計劃項目(2011001)

丁英鈞(1972-)，男，河北無極人，教授，醫(yī)學(xué)博士，從事中醫(yī)糖尿病腎臟病的臨床與研究。