王 琳， 李 敏， 魏啟舜， 張洪海， 周 影， 趙荷娟

(1.江蘇丘陵地區(qū)南京農(nóng)業(yè)科學研究所，江蘇 南京210046;2.南京農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，江蘇 南京210095;3.金壇市農(nóng)林局)

堆肥是一個好氧能自身產(chǎn)熱并通過微生物對有機物降解的固態(tài)發(fā)酵過程［1-4］。雙孢蘑菇培養(yǎng)料發(fā)酵是一個類似堆肥的過程。目前國內(nèi)雙孢蘑菇培養(yǎng)料的制備主要采用二次發(fā)酵技術，一次發(fā)酵在發(fā)酵槽內(nèi)進行，持續(xù)時間9 ～16 d，中間倒倉2 ～3 次，一次發(fā)酵過程中溫度升高，促使堆料物質(zhì)發(fā)生轉(zhuǎn)化，發(fā)酵結束后，干物質(zhì)減少30%左右。二次發(fā)酵在隧道內(nèi)進行，是一個控溫的過程，首先經(jīng)歷12 h 的巴氏消毒階段，然后降溫至50 ℃左右恒溫發(fā)酵4 ～5 d，在高溫菌的作用下物料轉(zhuǎn)化成有利于蘑菇菌絲吸收利用的沒有病原菌的選擇性栽培基質(zhì)。在這一過程中，各種嗜熱微生物的生理代謝和群落演替發(fā)揮至關重要的作用。

關于堆肥中的微生物群落演替和多樣性的研究較多，利用傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法從堆肥發(fā)酵初期分離出的細菌大多數(shù)屬于Actinobacteria 和Bacilli［5-7］，高溫階段分離出的主要種群是Thermus thermophilus，結束階段分離出的細菌多為 Pseudomonasa 和 Xanthomona［8］。然而對雙孢蘑菇培養(yǎng)料發(fā)酵過程中微生物群落變化信息相對較少［9］，尤其對一次發(fā)酵階段微生物群落結構變化的研究更少，因為相對二次發(fā)酵，一次發(fā)酵過程較慢，且發(fā)酵進程相對不可控制［10］。

微生物群落演替是決定雙孢蘑菇培養(yǎng)料發(fā)酵成功與否的關鍵因素之一，微生物群落演變過程受到培養(yǎng)料原材料特性和一次發(fā)酵環(huán)境條件的影響，季節(jié)的變化不僅影響了堆溫也影響了原材料的質(zhì)量。本研究以PCR-DGGE 技術為基礎，結合基因克隆等技術，探討冬季和春季2 批培養(yǎng)料在一次發(fā)酵的不同階段和二次發(fā)酵結束時的細菌群落結構，希望利用現(xiàn)代分子生態(tài)學的方法能夠快速、準確地對培養(yǎng)料發(fā)酵過程中的微生物群落結構進行動態(tài)的檢測，為今后培養(yǎng)料發(fā)酵的質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 培養(yǎng)料的制作和取樣

本試驗的培養(yǎng)料取自江蘇金壇市銀湖食用菌有限公司，培養(yǎng)料的配方為:稻草20 000 kg、麥草10 000 kg、牛糞肥6 000 kg、復合肥300 kg、過磷酸鈣800 kg、菜餅300 kg、石灰750 kg、石膏粉750 kg。培養(yǎng)料的一次發(fā)酵采用槽式發(fā)酵，發(fā)酵槽(寬4 m、長8 m、高4 m)配備強制通風系統(tǒng)，一次發(fā)酵翻堆3 次后轉(zhuǎn)移至密閉的具有強制通風系統(tǒng)的二次發(fā)酵隧道內(nèi)，二次隧道寬4 m、長6.5 m、高4 m，溫度升至58 ℃時維持8 h，降溫至48 ℃，保持5 d，此時培養(yǎng)料的氨氣濃度小于1.0 ×10-7cm3/m3，pH 為7.6。

取樣時間分別為:預濕后、一次翻堆后、二次翻堆后、三次翻堆后、二次發(fā)酵結束時。一次發(fā)酵過程包括一次翻堆、二次翻堆、三次翻堆。分別在冬季和春季各取1 批料，春季采樣的時間為:2014 年5 月19 日、2014 年5 月25 日、2014 年5 月30 日、2014年6 月5 日、2014 年6 月10 日;冬季采樣的時間為:2013 年12 月3 日、2013 年12 月10 日、2013 年12月16 日、2013 年12 月21 日、2013 年12 月28 日。

取樣方法:樣品取自表面以下50 cm，隨機取3個點，每個點取樣200 g，混勻后采用四分法，將樣品液氮速凍后-70 ℃保存。

1.2 雙孢蘑菇培養(yǎng)料樣品DNA 的提取與分析

培養(yǎng)料樣品DNA 的提取使用MP 公司的FastDNA SPIN Kit for Soil 試劑盒，提取方法按照說明書進行，取0.2 g 培養(yǎng)料進行提取。將提取好的DNA 作為PCR 的模板，對細菌16S rDNA 的V3 區(qū)進行擴增，使用引物為含有GC 夾子的GC338F:5'-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGGCGGGGCGGGGGCGCGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3'和518 R:5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'。PCR 反 應 程 序 為:94 ℃預變性2 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸l min，35 個循環(huán);72 ℃延伸5 min。PCR反應的產(chǎn)物用1.5%(質(zhì)量體積比)瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3 變性梯度凝膠電泳(DGGE)

DGGE 程序按照文獻［11］進行，10%丙烯酰胺凝膠，變性劑線性梯度為40% ～60%，1 ×TAE 緩沖液，上樣量為每孔20 μl，220 V 電泳10 min 后60 V 60 ℃電泳16 h，電泳完畢后進行硝酸銀染色。

DGGE 膠的主要條帶分析按照以下程序:將主要條帶切割下來浸入40 μl 無菌的DEPC 水中，4 ℃靜置12 h，用于PCR 擴增，取1 μl 作為模板，用不含GC 夾338F 和518 R 引物擴增，將50 μl PCR 產(chǎn)物進行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，然后使用Axygen 公司的膠回收試劑盒割膠回收?；厥蘸蟮腜CR 產(chǎn)物溶于20 μl TE (pH 8.0)緩沖液-20 ℃保存用于后續(xù)的酶連與轉(zhuǎn)化。TA 克隆使用全式金生物公司的pEASY-T3 Cloning Kit。每個條帶送3 個克隆子至南京思普金生物科技有限公司測序分析。

為了獲得培養(yǎng)料中主要細菌種群的分類信息，對主要條帶的16S rDNA V3 基因進行克隆測序與生物信息學分析。對不同發(fā)酵階段的11 個條帶(分別命名A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K)進行割膠回收、測序及BLAST 比對。

1.4 數(shù)據(jù)分析

序列在GenBank 數(shù)據(jù)庫中進行Blast 比對，檢索相近序列。對本試驗獲得的序列及數(shù)據(jù)庫中的相近序列應用Clustal X 軟件計算其親緣關系，用Mega4軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。DGGE 條帶的比對和系統(tǒng)發(fā)育樹的構建使用Quantity One(Bio-Rad)軟件完成。用Quantity one 軟件對DGGE 圖譜進行分析，粗細不同的條帶反映了DGGE 膠中樣品的聚集密度，通過統(tǒng)計不同樣品的條帶數(shù)，計算樣品細菌群落豐富度R 值(泳道上的條帶數(shù)除以圖譜中的總條帶數(shù))。

2 結果

2.1 DGGE 分析

從圖1 可以看出，培養(yǎng)料發(fā)酵過程中不同時間段樣品的16S rRNA V3 片段都得到了很好的分離，每一條帶由16S rDNA 序列解鏈特性相近的細菌物種組成，代表不同的細菌種群［12］，電泳條帶越多說明細菌種群數(shù)量越多［13］。整個培養(yǎng)料發(fā)酵過程中細菌多樣性較為豐富，并且存在明顯的演替過程，建堆初期的帶譜與一次翻堆后的帶譜差異明顯，一次發(fā)酵結束時的帶譜與二次發(fā)酵結束時的帶譜差異最為明顯，一次翻堆后、二次翻堆后、三次翻堆后(一次發(fā)酵期間)的DGGE 條帶相似性較高，其中優(yōu)勢條帶B 和C 在一次發(fā)酵過程中都存在。二次發(fā)酵過程中存在一些特異性條帶如條帶G、條帶F、條帶J 和條帶K。在發(fā)酵的每個階段都有特有的細菌種類(圖1)。本次研究培養(yǎng)料發(fā)酵過程中的細菌群落結構至少經(jīng)歷了3 個階段的演替，即建堆初期、一次發(fā)酵階段和二次發(fā)酵階段。

春季和冬季培養(yǎng)料在一次發(fā)酵過程中DGGE圖譜條帶數(shù)的變化呈現(xiàn)的趨勢比較一致(圖2)，一次翻堆后有所增加，隨著發(fā)酵時間的增加有所降低。但是二次發(fā)酵之后，冬季培養(yǎng)料的DGGE 圖譜條帶數(shù)減少而春季培養(yǎng)料的DGGE 圖譜條帶數(shù)增加。樣品不同時期細菌的豐富度(R)和DGGE 圖譜的條帶數(shù)變化趨勢是一致的。

對不同樣品間細菌群落相似性聚類分析(圖3)，10 個樣品大致可以分為3 類:第1 類是樣品8和樣品9，第2 類是樣品5 和樣品10，第3 類是樣品2、樣品3、樣品4、樣品6 和樣品7。說明培養(yǎng)料中細菌群落相似性與發(fā)酵的溫度及進程是密切相關的。

圖1 春季和冬季培養(yǎng)料發(fā)酵不同階段的16S rDNA V3 PCR 產(chǎn)物DGGEFig.1 DGGE profiles of 16S rDNA V3 fragments from compost samples of two composting cycles(spring and winter)

圖2 不同時間段培養(yǎng)料樣品的多樣性指數(shù)Fig.2 Bacteria diversity index(R)of the mushroom compost during different fermentation stages

條帶B、條帶C、條帶D、條帶E 在2 批料的一次發(fā)酵過程中均存在，目的條帶B、條帶C 一次發(fā)酵期間濃度較大，到了二次發(fā)酵結束后消亡，目的條帶D 在一次發(fā)酵中很明顯而到二次發(fā)酵結束逐漸減弱。條帶F 在春季培養(yǎng)料一次發(fā)酵過程中出現(xiàn)而在冬季培養(yǎng)料中不明顯。二次發(fā)酵結束后春季和冬季培養(yǎng)料中的DGGE 條帶的數(shù)目有一些差異，但通過樣品間細菌群落相似性的聚類分析(圖3)發(fā)現(xiàn)樣品5 和樣品10 被歸在一組，說明2 批料發(fā)酵結束之后細菌種群之間具有較大的相似性。

圖3 不同樣品細菌群落相似性的聚類分析Fig.3 Clustering analysis of bacterial community in different soil samples

2.2 DGGE 圖譜中主要條帶的序列測定

DGGE 分析方法通過條帶測序可以直接與日益豐富的數(shù)據(jù)庫中的序列直接進行比較，從而較為精確地了解微生物種群結構［14］，割膠測序之后獲得系統(tǒng)發(fā)育信息(表1)。一般情況下認為，2 種細菌16S rDNA 序列同源性為95.10% ～98. 00% 時屬于不同種，而同源性為93.1% ～95. 0%時，則屬于不同的屬［15］，這11 個優(yōu)勢條帶所代表的細菌屬于厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、高溫異常球菌門(Deinococcus-Thermus)和放線菌門(Actinobacteria)以及未知分類地位的細菌種群。

表1 目的條帶的序列比對結果Table 1 Phylogenetic affiliations of DNA identified by DGGE

一次發(fā)酵過程與二次發(fā)酵過程中細菌群落的多樣性差異較大，有些條帶在一次發(fā)酵中存在但在二次發(fā)酵中消失，一次發(fā)酵中的細菌主要為芽孢桿菌(Bacillus)、黃桿菌(Flavobacterium)、假單胞菌(Pseudomonas fragis、Solibacillus silvestris)和高溫菌(Thermus thermophilus)，其中高溫菌在二次發(fā)酵中一直存在，二次發(fā)酵過程的微生物多數(shù)為不可培養(yǎng)的細菌種群。

將11 條序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖4 所示，其中有一類分支包括條帶A、條帶C、條帶F，以Bacillus 屬為代表的Bacilli 綱，該分支的細菌主要活躍在一次發(fā)酵階段。另一分支其細菌類群較為復雜，條帶B 代表的細菌和Flavobacterium spp.黃桿菌序列100%同源，條帶G 代表了一類不可培養(yǎng)的細菌，條帶E 代表的細菌和Pseudomonas fragi 假單胞菌的序列98%同源，條帶D 代表的細菌和Thermus thermophilus 序列的同源性為94%，條帶H 代表的Thermobifida fusca 和條帶J 代表的細菌均是Actinobacteria 門的成員;條帶I、條帶K 所代表的一類細菌目前尚未獲得培養(yǎng)。

圖4 DGGE 主要條帶的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.4 Phylogenetic analysis of the predominant bands based on DGGE profile

3 討論

本研究利用DGGE 分析了2 個不同季節(jié)雙孢蘑菇培養(yǎng)料一次發(fā)酵不同階段和二次發(fā)酵結束后細菌的菌落結構，發(fā)現(xiàn)雙孢蘑菇培養(yǎng)料中具有豐富的細菌群落，其中細菌組成要遠遠豐富于人們用傳統(tǒng)的分離方法所獲得的類群［16］。在發(fā)酵的不同階段，堆溫和物料的理化性狀不斷地發(fā)生變化，培養(yǎng)料中的細菌群落結構也在發(fā)生變化。不同的季節(jié)雙孢蘑菇培養(yǎng)料發(fā)酵的不同階段的細菌結構有一些不同，春季培養(yǎng)料的細菌多樣性大于冬季培養(yǎng)料，因為培養(yǎng)料中細菌的生長繁殖和更替會受到環(huán)境溫度的影響從而影響發(fā)酵進程。但不同季節(jié)，細菌的豐度和多樣性的變化趨勢較為一致。Anna J. Székely 等使用DGGE 方法，同時采用基于內(nèi)切酶BsuRⅠ和Hin6Ⅰ酶切的T-RFLP 的方法對冬季和夏季蘑菇培養(yǎng)料進行菌落結構分析，發(fā)現(xiàn)由于夏季的環(huán)境溫度高，所以培養(yǎng)料中高溫菌比冬季早出現(xiàn)［9］。

對DGGE 主要條帶的測序分析可以了解到培養(yǎng)料中細菌的主要優(yōu)勢種屬在發(fā)酵進程中的演變。有些嗜溫菌如Psedomaonas 是生長迅速、生態(tài)幅比較廣泛的細菌種屬，因此在本研究的蘑菇培養(yǎng)料中也有發(fā)現(xiàn)。除此以外，本研究發(fā)現(xiàn)一些具有木質(zhì)纖維素降解功能的細菌菌種，如高溫菌Thermus thermophilus 在一次發(fā)酵和二次發(fā)酵中均存在，因為二次發(fā)酵過程中經(jīng)過巴氏消毒后環(huán)境溫度控制在48 ～50 ℃維持4 ～5 d，所以這種高溫菌容易成為主導菌群。何麗鴻等［16］在二次發(fā)酵剛開始和即將結束的雙孢蘑菇培養(yǎng)料中也分別檢測到了Thermus thermophilus。Anna J.Székely 等人利用DGGE 檢測到雙孢蘑菇培養(yǎng)料發(fā)酵的高溫階段的主要菌群為Thermus thermophilus［9］，該菌能夠產(chǎn)生木聚糖降解酶參與半纖維素的降解［17］。大量研究結果表明，在堆肥高溫期，主要微生物是鏈霉菌和微單胞桿菌，其中87%的高溫菌屬于桿菌屬［18］，且多數(shù)細菌具有纖維素降解能力。二次發(fā)酵過程中檢測到屬于Actinobacteria 門的Thermobifida(條帶H 和條帶J)也具有較強的纖維素和半纖維素降解能力［19］。細菌在培養(yǎng)料的發(fā)酵過程中起著重要的作用，根據(jù)細菌的種類和作用，調(diào)節(jié)發(fā)酵的工藝控制培養(yǎng)料中細菌的類群，充分發(fā)揮有益菌種的協(xié)同作用，杜絕有害菌的生長，對于提高雙孢蘑菇培養(yǎng)料質(zhì)量從而增加蘑菇產(chǎn)量有重要意義。

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