呂 莉，王繼紅，張 艷，孫曉紅，肖 蓉，李慶偉* (.遼寧師范大學(xué)海洋生物功能基因與蛋白質(zhì)組學(xué)研究所，遼寧 大連 6029;2.大連醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，遼寧 大連 6044;.中國(guó)人民解放軍第20 醫(yī)院，遼寧 大連 602)

重組日本七鰓鰻RGD 毒素蛋白rLj－RGD3是源自日本七鰓鰻口腔腺的可溶性RGD 毒素蛋白，分子量為13 600，由118 個(gè)氨基酸組成，其一級(jí)結(jié)構(gòu)中含有3 個(gè)RGD 模體。前期研究表明，rLj－RGD3 符合RGD 毒素蛋白的特性，憑借其分子中含有的3 個(gè)RGD(Arg－Gly－Asp)模體而具有抗血小板聚集功能［1－2］。本研究旨在研究其保護(hù)凝血酶誘發(fā)的小鼠肺栓塞死亡作用并與肝素比較其出血傾向。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

重組日本七鰓鰻RGD 毒素蛋白rLj－RGD3，由遼寧師范大學(xué)海洋生物功能基因與蛋白質(zhì)組學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)室提供;肝素鈉(Heparin)，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品;牛凝血酶，沈陽(yáng)拜英生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

昆明種小鼠，雄性，18 ～22 g，由大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，清潔級(jí)，許可證號(hào)SCXK(遼)2008－0002，飼養(yǎng)溫度(20 ±1)℃，濕度30% ～50%。

1.2 rLj－RGD3 對(duì)凝血酶誘發(fā)小鼠肺栓塞死亡的保護(hù)作用

按文獻(xiàn)［3］方法，稍作調(diào)整確定凝血酶攻擊劑量為2 500 IU/kg。取小鼠70 只，隨機(jī)分為7 組:NS 組，rLj－RGD3 0.13、0.25、0.5、1.0、2.0 mg/kg 組以及陽(yáng)性對(duì)照藥Heparin 200.0 IU/kg 組。給藥組小鼠腹腔注射(i.p)不同受試藥物，NS 組小鼠i.p 等容量NS(0.02 mL/g)，藥后10 min 自尾靜脈注射凝血酶2 500 IU/kg進(jìn)行攻擊，觀察并記錄15 min 內(nèi)小鼠是否死亡，以15 min 內(nèi)未死亡小鼠占本組受試鼠總數(shù)的百分?jǐn)?shù)，作為rLj－RGD3 對(duì)抗凝血酶誘發(fā)小鼠肺栓塞死亡的保護(hù)百分率，并計(jì)算rLj－RGD3 對(duì)抗凝血酶誘發(fā)小鼠肺栓塞死亡的保護(hù)作用的ED50。

1.3 等效劑量肝素與rLj－RGD3 對(duì)小鼠出血時(shí)間的影響

由1.2 項(xiàng)下結(jié)果計(jì)算得，對(duì)凝血酶誘發(fā)的小鼠肺栓塞死亡的保護(hù)百分率為40% 的肝素劑量為200.0 IU/kg，rLj－RGD3 劑量為0.30 mg/kg，實(shí)驗(yàn)采用此等效劑量，比較二者的出血不良反應(yīng)傾向。取小鼠30 只，隨機(jī)分為3 組:肝素200 IU/kg 組、rLj－RGD3 0.30 mg/kg 組及NS 空白對(duì)照組。小鼠腹腔注射不同受試藥物后10 min，距尾尖2.0 mm 切斷，每隔30 s用濾紙輕拭尾尖斷端，記錄自斷尾開(kāi)始至不再能吸到血液為止的時(shí)間，即出血時(shí)間(BT)［4］，以空白對(duì)照組為基準(zhǔn)，計(jì)算BT 延長(zhǎng)%。

2 結(jié) 果

2.1 rLj－RGD3 對(duì)凝血酶誘發(fā)小鼠肺栓塞死亡的保護(hù)作用

結(jié)果如圖1 所示，NS 組小鼠存活數(shù)為0/10，而rLj－RGD3 由低劑量到高劑量小鼠存活數(shù)分別為2/10、3/10、6/10、7/10 和9/10，保護(hù)百分率分別為20%、30%、60%、70%和90%，呈劑量依賴性。陽(yáng)性對(duì)照藥Heparin 200.0 IU/kg 組小鼠的存活數(shù)為4/10，保護(hù)百分率為40%(P ＜0.01)。

將保護(hù)百分率換算成概率單位(Y)與對(duì)數(shù)劑量(X)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y = 1.754 0X +5.666 0(r = 0.988 7)，計(jì)算得rLj－RGD3 對(duì)抗凝血酶誘發(fā)小鼠肺栓塞死亡的保護(hù)作用的ED50為0.42 mg/kg。

圖1 響腹腔注射不同劑量rLj-RGD3 對(duì)凝血酶誘發(fā)小鼠肺栓塞死亡的保護(hù)作用

2.2 等效劑量肝素與rLj-RGD3 對(duì)小鼠尾BT 影響

由表1 可知，與NS 組相比，200.0 IU/kg 肝素和0.30 mg/kg rLj－RGD3 BT 延長(zhǎng)%分別為323.8%和78.1%(P ＜0.01)，rLj－RGD3 組BT 延長(zhǎng)%是等效劑量肝素組的24.1%(P ＜0.01)。

表1 腹腔注射等效劑量rLj-RGD3 和肝素對(duì)小鼠尾BT的影響(±s，n=10)

表1 腹腔注射等效劑量rLj-RGD3 和肝素對(duì)小鼠尾BT的影響(±s，n=10)

與NS 組比較，* P ＜0.01;與Heparin 組相比，#P ＜0.01

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3 討 論

本實(shí)驗(yàn)以凝血酶攻擊復(fù)制小鼠肺栓塞模型，是于靜脈內(nèi)注入凝血酶激活凝血系統(tǒng)及血小板，形成血栓，栓塞于肺部，造成小鼠循環(huán)衰竭、缺氧甚至死亡，形成的栓子主要成分為纖維蛋白和血小板，因此該模型也可作為研究抗栓藥物的經(jīng)典動(dòng)物模型［3］。研究結(jié)果表明，rLj－RGD3 呈劑量依賴性地保護(hù)小鼠免受凝血酶誘發(fā)肺栓塞死亡，對(duì)凝血酶攻擊誘發(fā)的小鼠肺栓塞具有抑制作用。RGD 毒素蛋白可通過(guò)其分子中的RGD 模體專一性地與血小板糖蛋白GPⅡb/Ⅲa結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性地拮抗纖維蛋白原與血小板的結(jié)合，防止血小板的活化和GPⅡb/Ⅲa 受體構(gòu)象的改變，從而抑制血小板聚集的最終共同通路，產(chǎn)生抗血栓形成作用［5］。因此，受試rLj－RGD3 因其含有3 個(gè)RGD 模體而具有抗血小板聚集的生物學(xué)活性［2］，可抑制凝血酶誘發(fā)的小鼠肺栓塞形成。

肝素與rLj－RGD3 均具有抗栓活性，使用劑量過(guò)大可能造成出血等不良反應(yīng)。本研究表明，等效(對(duì)凝血酶誘發(fā)小鼠肺栓塞死亡的保護(hù)%同為40%)劑量的肝素與rLj－RGD3 使小鼠BT 分別延長(zhǎng)323.8%和78.1%，rLj－RGD3 延長(zhǎng)BT 作用是肝素的24.1%(P ＜0.01)，相當(dāng)于肝素出血作用的1/4。說(shuō)明rLj－RGD3 的出血不良反應(yīng)明顯低于肝素，作用更安全，具有良好開(kāi)發(fā)前景。

［1］ Careya CM，Bueno R，Gutierrez DA，et al.Recombinant rubistatin (r－Rub)，an MVD disintegrin，inhibits cell migration and proliferation，and is a strong apoptotic inducer of the human melanoma cell line SK－Mel－28［J］.Toxicon，2012，59(2):241－248.

［2］ Wang Jihong，Han Xiaoxi，Yang H，et al.A novel RGD－toxin protein，Lj－RGD3，from the buccal gland secretion of Lampetra japonica impacts diverse biological activities［J］.Biochimie，2010，92(10):1387－1396.

［3］ Paul W，Gresele P，Momi S，et al.The effect of defibrotide on thromboembolism in the pulmonary vasculature of mice and rabbits and in the cerebral vasculature of rabbits［J］.Br J Pharmacol，1993，110(4):1565－1571.

［4］ Sheffield WP，Eltrinqham－Smith LJ，Gataiance S，et al.A long－lasting，plasmin－activatable thrombin inhibitor aids clot lysis in vitro and does not promote bleeding in vivo［J］.Thromb Haemost，2009，101(5):867－877.

［5］ Sánchez EE，Galán JA，Russell WK，et al.Isolation and characterization of two disintegrins inhibiting ADP－induced human platelet aggregation from the venom of Crotalus scutulatus scutulatus (Mohave Rattlesnake)［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2006，212(1):59－68.