孫方博，白金權(quán) ，王 瑤，趙 斌，佟瑤瑤，張曉霞 (吉林醫(yī)藥學(xué)院:.臨床醫(yī)學(xué)院，2.附屬醫(yī)院肛腸外科，吉林 吉林 3203)

結(jié)直腸癌是嚴(yán)重威脅人類健康的惡性疾病，其發(fā)病率及死亡率呈逐年上升趨勢，隨著化療藥物和分子靶向藥物的開發(fā)與應(yīng)用，結(jié)腸癌的治療效果較以往有所提高，但療效仍不能令人滿意，且化療藥物帶來的毒副作用及耐藥事件的發(fā)生，導(dǎo)致化療的失敗一直是困擾著醫(yī)生的一個(gè)難題［1］。故探索高效低毒的抗腫瘤藥物已成為目前研究的熱點(diǎn)話題。本實(shí)驗(yàn)主要研究芝麻素對人結(jié)腸癌細(xì)胞是否具有誘導(dǎo)凋亡及抗腫瘤作用，并探究可能的抗腫瘤機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料及設(shè)備

人結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞株購自中科院上海生物細(xì)胞庫。芝麻素購自成都曼思特生物科技有限公司(產(chǎn)品編號:A0174-20 mg，Purity:≥98% HPLC)，4 ℃保存，使用時(shí)將芝麻素加入Trichloromethane 中溶解，再溶于DMEM 液中配制成所需濃度。DMEM 培養(yǎng)液、NCS、凋亡雙染檢測試劑盒、免疫組化試劑盒購自中生華美(北京)科技有限公司。其他設(shè)備有倒置顯微鏡，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，超凈工作臺，電熱恒溫水浴箱，超低溫冰柜，離心機(jī)，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，光學(xué)顯微鏡，冰箱，立式高壓蒸汽滅菌器等。

1.2 MTT 比色法檢測SW480 細(xì)胞株增殖抑制率

實(shí)驗(yàn)檢測開始前24 h 行常規(guī)細(xì)胞換液，取對數(shù)生長期SW480 細(xì)胞株，經(jīng)消化后制備成單細(xì)胞懸液并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)(細(xì)胞濃度為1 ×106/mL)，將細(xì)胞接種在96 孔板內(nèi)180 μL，細(xì)胞貼壁48 h 后將每孔分別加入芝麻素終濃度達(dá)20、40、60、80、100、120、140 mg/L 20 μL，另設(shè)空白對照組(只加培養(yǎng)液)和對照組(只加SW480 細(xì)胞株和培養(yǎng)液)，培養(yǎng)48 h 后將每孔分別加入MTT 溶液5 g/L 20 μL，經(jīng)37 ℃孵育4 h后，棄去上清液，將二甲基亞砜(DMSO)分別加入每孔中150 μL，輕輕振蕩10 min，取酶標(biāo)儀測量波長490 nm 處吸光度(D 值)，利用NDST 軟件計(jì)算，細(xì)胞增殖抑制率計(jì)算公式:抑制率(%)=(1 －芝麻素組D 值/對照組D 值)×100%;將芝麻素組藥物濃度接近半數(shù)抑制濃度(IC50)為參考，進(jìn)行后續(xù)研究。

1.3 倒置顯微鏡下觀察SW480 細(xì)胞株形態(tài)

將處于對數(shù)生長期的SW480 細(xì)胞株加入芝麻素終濃度(IC50)，設(shè)對照組，將培養(yǎng)瓶置入37 ℃CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后，利用倒置顯微鏡觀察SW480 細(xì)胞株的形態(tài)學(xué)變化并隨機(jī)拍照記錄。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞早期凋亡率

取對數(shù)生長期的SW480 細(xì)胞株，經(jīng)消化后制備成含細(xì)胞懸液(1 ×106個(gè)細(xì)胞)3 mL，置于25 mL 的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后每個(gè)培養(yǎng)瓶中再各加2.7 mL 含10% NCS DMEM 培養(yǎng)液，再分別加入0.3 mL 芝麻素終濃度(IC50)，對照組加入等體積不含10% NCS DMEM 培養(yǎng)液，將培養(yǎng)瓶置入37 ℃CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后，棄去上清液，用PBS液(pH 為7.2 ～7.4)洗滌1 次，消化5 min 后，取含10% NCS DMEM 培養(yǎng)液終止消化，輕柔吹打使其成為細(xì)胞懸液，600 g 離心5 min，棄去上清收集細(xì)胞，用PBS 液重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)(取1 ×106重懸的細(xì)胞)，600 g離心5 min，棄去上清，加入Annexin V-FITC 結(jié)合液195 μL 重懸細(xì)胞;加入Annexin V-FITC 5 μL 混勻，23 ℃避光孵育10 min;600 g 離心5 min，棄去上清，加入Annexin V-FITC 結(jié)合液190 μL 重懸細(xì)胞;再加入碘化丙啶(PI)染色液10 μL，避光混勻;上機(jī)檢測細(xì)胞早期凋亡率。

1.5 免疫細(xì)胞化學(xué)染色

細(xì)胞爬片濃度1 × 105/mL，用10% 甲醛溶液23 ℃條件下固定30 min，PBS 液(pH 7.2 ～7.6)沖洗;30%雙氧水1 份+純甲醇50 份混合，23 ℃條件下孵育30 min，PBS 液沖洗;滴入10%正常山羊血清封閉非特異性抗原，23 ℃條件下孵育20 min;分別滴入caspase-3、caspase-8 一抗工作液50 μL，置入37 ℃CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h，PBS 液沖洗2 min×3 次;滴入二抗工作液50 μL，置入37 ℃CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h，PBS 液沖洗2 min ×3 次;滴入三抗工作液50 μL 37 ℃CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h，PBS 液沖洗2 min×3 次;滴入DAB 顯色劑，23 ℃條件下顯色，顯微鏡觀察，陽性顯色顯著時(shí)用蒸餾水沖洗;蘇木素染色劑輕度復(fù)染;利用水溶性封片劑進(jìn)行封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察，并用照相機(jī)隨機(jī)拍照記錄。觀察當(dāng)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕色顆粒的為陽性細(xì)胞，細(xì)胞輕微著色的或未著色的為陰性細(xì)胞。陰性對照用PBS 液(pH 7.2 ～7.6)代替一抗工作液，陽性對照取已知陽性物質(zhì)的大腸癌免疫組織化學(xué)染色切片。在光學(xué)顯微鏡下觀察(放大400 倍)，于每張爬片上觀察10 個(gè)視野，將每個(gè)視野中分別計(jì)算出陽性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)。細(xì)胞陽性表達(dá)率(%)= 陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間均數(shù)比較采用t 檢驗(yàn)，以P ＜0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MTT 比色法檢測SW480 細(xì)胞株增殖抑制率

結(jié)果顯示各濃度芝麻素均對人結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞株具有增殖抑制的作用，在藥物作用時(shí)間不變的前提條件下，隨著藥物濃度的遞增SW480 細(xì)胞呈現(xiàn)出增殖抑制作用加強(qiáng)，芝麻素組與對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P ＜0.01(圖1)。其中芝麻素100 mg/L 最接近IC50，所以將此濃度的芝麻素作為后續(xù)研究。

2.2 倒置顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察

倒置顯微鏡下觀察，對照組SW480 細(xì)胞株形態(tài)為橢圓形或多邊形，貼壁牢固，密集生長，細(xì)胞膜完整，胞質(zhì)豐富且分布均勻，可見核分裂相，細(xì)胞間距較小，細(xì)胞體積較大;芝麻素100 mg/L 組作用48 h 后，SW480 細(xì)胞體積縮小，皺縮變圓，細(xì)胞之間的間距變大，細(xì)胞數(shù)量較對照組有所減少，部分細(xì)胞漂浮，細(xì)胞貼壁不牢固，細(xì)胞膜完整，胞質(zhì)分布不均勻，核分裂相較對照組有所減少，視野中細(xì)胞凋亡明顯(圖2)。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞早期凋亡率

芝麻素100 mg/L 組作用48 h 后，行Annexin VFITC/PI 檢測細(xì)胞早期凋亡率，結(jié)果與對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P ＜0.01(見圖3)。

2.4 免疫細(xì)胞化學(xué)染色

芝麻素100 mg/L 組作用48 h 后，經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色在光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與對照組相比caspase-3 和caspase-8 表達(dá)增高，有明顯的差異，P ＜0.01(參見表1，圖4 ～5)。

圖1 芝麻素對人結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞株增殖抑制率

圖2 芝麻素IC50濃度作SW480 細(xì)胞株48 h 后圖像

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞早期凋亡率(%)

表1 芝麻素作用48 h 后caspase-3 和caspase-8 表達(dá)(%)

3 討 論

圖4 人結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞Caspase-3 表達(dá)(SABC，400 ×)

圖5 人結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞Caspase-8 表達(dá)(SABC，400 ×)

結(jié)腸癌是常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率逐年上升，化學(xué)藥物已成為晚期結(jié)腸癌主要的治療手段之一，但由于部分腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥、藥物生物利用度低及藥物對正常組織細(xì)胞毒性較強(qiáng)等原因，常常影響其治療效果［2］，故研發(fā)新型抗結(jié)腸癌藥物已勢在必行。芝麻素具有抗氧化、調(diào)節(jié)脂質(zhì)及膽固醇代謝、促進(jìn)乙醇代謝及保護(hù)肝臟、抗高血壓、降血糖、抗菌等作用，同時(shí)還具有抑制腫瘤作用［3-4］。

本實(shí)驗(yàn)采用MTT 法測得芝麻素對人結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞株具有很好的增殖抑制作用，結(jié)果顯示，藥物作用48 h 后芝麻素100 mg/L 增殖抑制率為49.95%接近IC50，芝麻素對SW480 細(xì)胞株的最大抑制率為79.21%，因此以接近IC50為參考進(jìn)行后續(xù)研究。利用倒置顯微鏡觀察到，芝麻素濃度接近IC50作用SW480 細(xì)胞48 h 后，呈現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡特征性形態(tài)學(xué)變化，提示芝麻素具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡作用。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)采用Annexin V-FITC 與PI 雙染法來測定細(xì)胞早期凋亡率是目前較為可靠的檢測方法，結(jié)果顯示芝麻素組出現(xiàn)早期凋亡細(xì)胞，提示芝麻素具有早期抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用。

細(xì)胞凋亡又稱程序性死亡(Programmed Cell Death，PCD)指的是在一定生理或者病理?xiàng)l件下主動遵循自身程序，結(jié)束生命的一個(gè)過程［5］。caspase-3和caspase-8 是重要的caspase 家族成員，它們參與了細(xì)胞凋亡過程中至關(guān)重要的環(huán)節(jié)，在細(xì)胞凋亡和caspase 家族成員的激活主要涉及到以下三條通路:第一條即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)Ca2+的儲存庫，一旦內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，將造成大量Ca2+釋放，當(dāng)胞漿內(nèi)Ca2+濃度一旦升高便引發(fā)caspase 級聯(lián)放大效應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡事件的發(fā)生，而第二條即死亡受體通路，第三條即線粒體通路也參與其中［6-7］。本研究對caspase 家族成員中caspase-3 和caspase-8 進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，芝麻素作用SW480 細(xì)胞株48 h 后caspase-3 和caspase-8 表達(dá)與陰性對照組比較均有較顯著的增高，推測芝麻素誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡現(xiàn)象的發(fā)生可能與其激活了caspase-3 和caspase-8 有關(guān)，進(jìn)而引發(fā)caspase 級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

綜上所述，芝麻素對人結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞株具有抗增殖及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，其機(jī)制可能是通過激活caspase-3 和caspase-8 從而影響凋亡通路實(shí)現(xiàn)。研究結(jié)果提示芝麻素具有抗結(jié)腸癌細(xì)胞作用。

［1］ Peeters M，Price TJ，Cervantes A，et al.Randomized phase III study of panitumumab with fluorouracil，leucovorin，and irinotecan (FOLFIRI)compared with FOLFIRI alone as second-line treatment in patients with metastatic colorectal cancer［J］.Clin Oncol，2010，28(31):4706-4713.

［2］ 劉曉康，韓欣冶，林英嘉，等.樺木醇對人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖和凋亡的影響［J］.吉林大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2015，41(1):39-43.

［3］ 陳鳳香，曹文明，曹國武，等.芝麻木脂素研究進(jìn)展［J］.糧食與油脂，2012(6):1-6.

［4］ 白金權(quán)，車成日.芝麻素的提取及藥理作用研究現(xiàn)狀［J］.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)報(bào)，2012，35(3):229-232.

［5］ Habib MR，Joel AH，Qing F.Modulation of apoptosis by nitric oxide:implications in myocardial ischemia and heart failure［J］.Pharmacol Ther，2005，106(2):147-162.

［6］ Apáti A，Jánossy J，Brózik A，et al.Effects of intracellular calcium on cell survival and the MAPK pathway in a human hormone-dependent leukemia cell line (TF-1)［J］.Ann N Y Acad Sci，2003，1010:70-73.

［7］ Dudits D，Abrahám E，Miskolczi P，et al.Cell-cycle control as a target for calcium，hormonal and developmental signals:the role of phosphorylation in the retinoblastoma-centred pathway［J］.Ann Bot，2011，107(7):1193-1202.