唐銳先，張 穎，李 偉，張 巍* (.吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，吉林 吉林 303;.永吉縣醫(yī)院婦產(chǎn)科，吉林吉林 300)

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)惡性腫瘤之一。對(duì)其常規(guī)治療方法是癌細(xì)胞減滅術(shù)和放、化療等［1］。此病在早期常無(wú)自覺(jué)癥狀，一旦出現(xiàn)臨床癥狀時(shí)往往已失去了最佳手術(shù)治療期［2］。而一些老人、體衰且伴有其他嚴(yán)重基礎(chǔ)病的患者對(duì)根治手術(shù)及傳統(tǒng)放、化療方案不能耐受等原因，嚴(yán)重影響了卵巢癌治療的療效及愈后［3］。因此，尋找高效、低毒等醫(yī)治手段及藥物成為卵巢癌治療的熱點(diǎn)［4］。本研究是通過(guò)白藜蘆醇(Res)對(duì)人類卵巢癌SKOV-3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響及其增殖抑制作用的研究，為白藜蘆醇應(yīng)用于卵巢癌的治療尋找實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT，美國(guó)Amerso 公司);倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司);二甲基亞砜(DMSO);酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(DNM-9602 型，北京普朗新技術(shù)有限公司)。純度為95%白藜蘆醇粉末(天津邁迪瑞康生物醫(yī)藥科技公司)，人卵巢癌細(xì)胞SKOV-3 系(吉林醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心保存);RPMI 1640 培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco 公司);胎牛血清(吉林血研所);CO2培養(yǎng)箱(MCO-15AC 型，日本)。

1.2 白藜蘆醇實(shí)驗(yàn)濃度的配制

白藜蘆醇以DMSO 溶解后，用RPMI 1640 培養(yǎng)基配成100 mg/L 的儲(chǔ)存液并置于－20 ℃低溫冰箱保存。臨用前用含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液分別稀釋成所需的白藜蘆醇實(shí)驗(yàn)濃度。

1.3 細(xì)胞的培養(yǎng)

將SKOV-3 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的無(wú)菌RPMI 1640 培養(yǎng)基中，置于37 ℃，5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育，細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后分瓶傳代培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及MTT 法檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV-3 細(xì)胞，用胰酶消化制成密度為1 ×105個(gè)/mL 細(xì)胞懸液，按100 μL/每孔接種于96 孔培養(yǎng)板。含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液加入白藜蘆醇配制成20、40、80 μmol/L 的不同濃度組繼續(xù)培養(yǎng)。同時(shí)設(shè)置不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)液的空白對(duì)照組與不加藥物，而作為各濃度處理組的細(xì)胞對(duì)照組。以上每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃，5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72 h。期間使用倒置顯微鏡觀察不同濃度白藜蘆醇對(duì)SKOV-3 細(xì)胞影響，評(píng)估細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)速度。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加入20 μL 四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)，置5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min 后，用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)為570 nm處測(cè)定吸光度值(OD 值)，并通過(guò)下列公式計(jì)算出不同濃度的白藜蘆醇對(duì)SKOV-3 細(xì)胞的增殖抑制率。［增殖抑制率(%)=［1 －(實(shí)驗(yàn)組OD 值－空白對(duì)照組OD 值)/(對(duì)照組OD 值－空白對(duì)照組OD值)］×100%，計(jì)算出半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.5 Hoechest 33258 熒光染色

另取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SKOV-3 細(xì)胞，培養(yǎng)24 h 后，吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2 次，每次2 min;加入多聚甲醛固定15 min，吸出固定液，用PBS 洗2 次，每次2 ～3 min;每孔加入1 mL Hoechst 33258 工作液，避光染色5 min，熒光顯微鏡下檢測(cè)細(xì)胞核形態(tài)。隨機(jī)觀察5 個(gè)視野，取效果良好的作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)處理

2 結(jié) 果

2.1 白藜蘆醇對(duì)SKOV-3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響

見(jiàn)圖1，對(duì)照組卵巢癌細(xì)胞SKOV-3 細(xì)胞緊貼瓶底，細(xì)胞密集，細(xì)胞間連接緊密，細(xì)胞形態(tài)飽滿，邊界清晰;細(xì)胞核為卵圓形，染色質(zhì)豐富。與對(duì)照組比較，20 μmol/L 白藜蘆醇組細(xì)胞形態(tài)變化不明顯;40 μmol/L白藜蘆醇組細(xì)胞較為稀疏，附壁疏松，脫壁細(xì)胞由橢圓形變圓，細(xì)胞腫脹;80 μmol/L 白藜蘆醇組細(xì)胞皺縮變小，細(xì)胞邊緣毛糙不規(guī)則，胞質(zhì)致密，細(xì)胞核變形，細(xì)胞質(zhì)中顆粒較多。

2.2 白藜蘆醇對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV-3 增殖影響

表1 是對(duì)照組和不同濃度白藜蘆醇觀察組作用不同時(shí)間后測(cè)得的OD 值。如表所示，白藜蘆醇各觀察組作用于SKOV-3 細(xì)胞后OD 值與對(duì)照OD 值相比，均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05 或P ＜0.01)。

表2 是白藜蘆醇各觀察組對(duì)SKOV-3 細(xì)胞的增殖抑制率于不同時(shí)間、濃度的比較。計(jì)算出IC50為37.81 μmol/L。

圖1 不同濃度的白藜蘆醇對(duì)SKOV-3 細(xì)胞形態(tài)的影響

2.3 白藜蘆醇對(duì)卵巢癌SKOV-3 細(xì)胞核形態(tài)影響

熒光顯微鏡觀察顯示，對(duì)照組SKOV-3 細(xì)胞大小均一，成彌散均勻的淡藍(lán)色弱熒光;經(jīng)40 μmol/L 白藜蘆醇組處理24 h 后，SKOV-3 細(xì)胞胞核皺縮明顯，并可見(jiàn)致密強(qiáng)熒光，存在核碎裂和凋亡小體等強(qiáng)熒光團(tuán)塊(圖2)。

表1 白藜蘆醇對(duì)SKOV-3 細(xì)胞的吸光度值(×10 －2)

表2 不同條件白藜蘆醇對(duì)SKOV-3 細(xì)胞的增殖抑制率

圖2 白藜蘆醇對(duì)SKOV-3 細(xì)胞核形態(tài)影響

3 討 論

白藜蘆醇是葡萄、虎杖等植物在遇到真菌感染、紫外線照射等惡劣環(huán)境下自身分泌的一種天然多酚類抗毒素［5］。近年來(lái)經(jīng)研究表明白藜蘆醇作為一生物還原劑，對(duì)炎性反應(yīng)及應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生的炎性介質(zhì)及細(xì)胞因子有良好的清除作用，其抗腫瘤的作用也得到眾多學(xué)者的重視［6］。白藜蘆醇顯著抑制多種腫瘤的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，如人肝母細(xì)胞瘤、前列腺癌、乳腺癌、白血病、肺癌等［7-9］。

我們?cè)诎邹继J醇對(duì)人卵巢癌SKOV-3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響研究中發(fā)現(xiàn)在相同的處理時(shí)間里，隨白藜蘆醇濃度的增高，人卵巢癌SKOV-3 細(xì)胞由細(xì)胞間連接緊密、細(xì)胞形態(tài)飽滿、邊界清晰、細(xì)胞核為卵圓形，染色質(zhì)豐富變?yōu)榧?xì)胞皺縮變小，細(xì)胞邊緣毛糙不規(guī)則，胞質(zhì)致密，細(xì)胞核變形，細(xì)胞質(zhì)中顆粒較多，產(chǎn)生凋亡小體等明顯改變。

MTT 比色法因其快速、簡(jiǎn)便、靈活等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛用于生物因子的活性檢測(cè)、腫瘤放射敏感性測(cè)定、細(xì)胞毒性試驗(yàn)、抗癌藥物對(duì)腫瘤增殖活性的影響等方面［10］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于對(duì)照組，各白藜蘆醇濃度組作用于SKOV-3 細(xì)胞后的OD 值明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。且在同一作用時(shí)間下，濃度較高組的抑制率高于濃度較低組的抑制率;在同一濃度白藜蘆醇作用下，作用時(shí)間較長(zhǎng)組的抑制率高于作用時(shí)間較短組的抑制率。綜上所述白藜蘆醇對(duì)SKOV-3 細(xì)胞的增殖抑制作用呈現(xiàn)劑量-時(shí)間依賴性，這與其他相類似研究結(jié)果相同［11］。

熒光染料Hoechst 33258 染色原理是因?yàn)镠oechst 33258 可少量通過(guò)正常細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使其染上淺藍(lán)色。但隨著凋亡細(xì)胞的膜通透性增強(qiáng)，進(jìn)入凋亡細(xì)胞中的Hoechst 33258 比進(jìn)入正常細(xì)胞的量增多，此外在凋亡早期細(xì)胞的染色體DNA 的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，使Hoechst 33258 染料能更有效地與DNA 結(jié)合，從而被染成亮藍(lán)色［12］。根據(jù)IC50值，本研究選取與其接近的40 μmol/L 白藜蘆醇做人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞凋亡早期實(shí)驗(yàn)，以期能客觀地反映白藜蘆醇抑制人卵巢癌細(xì)胞SKOV-3 增殖擴(kuò)展的能力。結(jié)果顯示40 μmol/L 白藜蘆醇可使人卵巢癌SKOV-3 細(xì)胞核形態(tài)發(fā)生改變，可促進(jìn)人卵巢癌SKOV-3 細(xì)胞的早期凋亡。而白藜蘆醇促進(jìn)人卵巢癌SKOV-3 細(xì)胞凋亡機(jī)制則有待進(jìn)一步研究。

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