宋 敏，王建寧，孟慶齊，包紅雨，楊 杰

(1.南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液科，江蘇 南京 210011；2.江蘇省中醫(yī)藥研究院，江蘇 南京 210028)

·論 著·

siRNA沉默c-FLIP對(duì)K562/ADR耐藥性的影響

宋 敏1，王建寧1，孟慶齊1，包紅雨1，楊 杰2

(1.南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液科，江蘇 南京 210011；2.江蘇省中醫(yī)藥研究院，江蘇 南京 210028)

目的 探討c-FLIP siRNA干擾c-FLIP mRNA水平對(duì)阿霉素耐藥細(xì)胞K562/ADR的耐藥性的影響及作用機(jī)制。方法應(yīng)用siRNA干擾的方法抑制K562及K562/ADR細(xì)胞c-FLIP的表達(dá)，通過熒光定量PCR的方法檢測c-FLIP mRNA表達(dá)及對(duì)多藥耐藥基因MDR1 mRNA水平的影響。MTT法檢測c-FLIP干擾與否對(duì)K562及K562/ADR細(xì)胞增殖的影響，Annexin V/7-ADD雙染研究c-FLIP干擾與否對(duì)K562及K562/ADR細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果與陰性siRNA轉(zhuǎn)染組相比較，c-FLIP siRNA轉(zhuǎn)染下調(diào)K562細(xì)胞中c-FLIP的mRNA后，K562細(xì)胞增殖受到一定程度的抑制(P＜0.05)，但是并未顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，c-FLIP干擾與否K562細(xì)胞48 h增殖率分別為(69.14±1.82)%和(60.69±2.23)%，凋亡率分別為(1.7±0.3)%和(1.8±0.2)%。與陰性siRNA轉(zhuǎn)染組相比較，c-FLIP siRNA轉(zhuǎn)染抑制K562/ADR細(xì)胞中c-FLIP的mRNA后，K562/ADR細(xì)胞增殖顯著被抑制(P＜0.05)，并顯著誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡增加(P＜0.05)，c-FLIP干擾與否K562/ADR細(xì)胞48 h增殖率分別為(-6.07±0.71)%和(-37.45±3.53)%，凋亡率分別為(5.2±0.4)%和(9.2±0.4)%。并且c-FLIP siRNA下調(diào)c-FLIP mRNA水平后，K562/ADR細(xì)胞中的多藥耐藥基因MDR1的mRNA表達(dá)水平也被顯著下調(diào)(P＜0.05)。結(jié)論c-FLIP siRNA下調(diào)K562/ADR細(xì)胞中c-FLIP的mRNA水平抑制了多藥耐藥基因MDR1的表達(dá)，從而抑制了K562/ADR細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥性。

c-FLIP siRNA；MDR1；K562/ADR；阿霉素耐藥

腫瘤細(xì)胞對(duì)一種藥物具有耐藥性的同時(shí)，對(duì)化學(xué)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞靶點(diǎn)不同的抗癌藥物同時(shí)產(chǎn)生耐藥的現(xiàn)象稱為多藥耐藥(Multidrug resistance，MDR)，是化療失敗的主要原因之一[1]。目前白血病的藥物治療已經(jīng)取得了很大進(jìn)展,然而由化療藥物引起的MDR常導(dǎo)致療效降低和疾病復(fù)發(fā)。阿霉素(Adriamycin，ADR)對(duì)治療白血病有良好效果，但在臨床使用中常受到自身毒性以及易產(chǎn)生耐藥性的限制。因此研究阿霉素耐藥的機(jī)理并尋找能逆轉(zhuǎn)阿霉素耐藥的策略已成為亟待解決的問題[2]。細(xì)胞凋亡(Apoptosis)是指細(xì)胞遵循自身基因有序調(diào)控的主動(dòng)自殺過程，凋亡障礙是白血病和腫瘤發(fā)病和對(duì)化療抵抗的原因之一，凋亡抑制蛋白c-FLIP的在介導(dǎo)白血病化療耐藥中起重要作用[3]。

本文以人白血病細(xì)胞K562及其阿霉素耐藥株K562/ADR為研究對(duì)象,研究c-FLIP siRNA干擾c-FLIP的表達(dá)對(duì)K562/ADR細(xì)胞耐阿霉素的逆轉(zhuǎn)作用，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 凋亡檢測試劑盒購自Millipore公司，MTT購自Sigma公司。阿霉素購自南京凱基生物公司。RPMI-1640培養(yǎng)基，胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)，胰酶消化液(0.25%胰酶+0.02%EDTA)均購自美國Invitrogen公司。Real-time PCR引物由南京金斯瑞公司合成，c-FLIP siRNA引物由廣州銳博生物公司合成。細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自Millipore公司，其他化學(xué)試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞來源及培養(yǎng) 人慢性白血病細(xì)胞K562細(xì)胞來源于中科院上海細(xì)胞庫，采用含10%的胎牛血清，青霉素、鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基置于37℃，5%CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。阿霉素耐藥白血病細(xì)胞K562/ADR細(xì)胞購自南京凱基生物公司，培養(yǎng)液在K562培養(yǎng)基中加入1 000 ng/ml阿霉素。根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)及時(shí)換液，傳代。

1.3 c-FLIP siRNA轉(zhuǎn)染K562或K562/ADR細(xì)胞 轉(zhuǎn)染分組：(1)空白對(duì)照組：不轉(zhuǎn)染siRNA組；(2)陰性siRNA轉(zhuǎn)染組；(3)c-FLIP siRNA轉(zhuǎn)染組。將對(duì)數(shù)生長期的2×105的K562或K562/ADR細(xì)胞接種于六孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。將5 μl的Lipfectamine 2 000逐滴加入25 μl的無血清Opti-MEM培養(yǎng)基中，吹打混勻，室溫靜置5 min，用無血清Opti-MEM培養(yǎng)基將c-FLIP的siRNA稀釋一定濃度，然后將轉(zhuǎn)染試劑和siRNA混勻，配成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將上述轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入培養(yǎng)有K562或K562/ADR細(xì)胞的六孔板中，前后左右搖晃混勻。將上述六孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后取一部分細(xì)胞接種于96孔板，繼續(xù)培養(yǎng)24 h或48 h后MTT檢測細(xì)胞增殖率。另一部分細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析及熒光定量PCR分析MDR及c-FLIP mRNA水平的改變。

1.4 MTT檢測細(xì)胞增殖率 取對(duì)數(shù)生長期的K562或K562/ADR細(xì)胞，用相應(yīng)的培養(yǎng)基配制成細(xì)胞懸液按照1×104個(gè)細(xì)胞100 μl每孔接種到96孔板內(nèi)。用含1 000 ng/ml阿霉素的培養(yǎng)基將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞稀釋成一定濃度的細(xì)胞懸液并按照1×104個(gè)細(xì)胞100 μl每孔接種到96孔板內(nèi)。繼續(xù)于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h或48 h。使用MTT法用酶聯(lián)免疫檢測儀測定波長為570 nm和630 nm處的吸光度值，以每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔吸光值的平均值作為各濃度的平均值。根據(jù)下列公式計(jì)算轉(zhuǎn)染c-FLIP與否的K562或K562/ ADR細(xì)胞的增殖率，細(xì)胞增殖率(%)=(A570nm-A630nm)實(shí)驗(yàn)組/(A570nm-A630nm)對(duì)照組×100%。

1.5 流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 將K562或K562/ADR細(xì)胞種到24孔板，每孔加入5×104個(gè)細(xì)胞，0.5 ml培養(yǎng)液，37℃和5%CO2過夜培養(yǎng)。c-FLIP或陰性siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后離心收集細(xì)胞，并用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次。然后將細(xì)胞按照1×106/ml的濃度重懸到凋亡檢測結(jié)合緩沖液中，將100 μl的溶液轉(zhuǎn)移到新的1.5 ml的EP管中。加入凋亡檢測試劑，混合均勻，避光室溫孵育15 min后再加入400 μl的結(jié)合緩沖液混勻，用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率。

1.6 熒光定量PCR檢測K562及K562/ADR細(xì)胞c-FLIP mRNA水平及多藥耐藥基因MDR1的mRNA水平 轉(zhuǎn)染c-FLIP與否的K562/ADR細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，使用Trizol提取RNA并溶解于30 μl RNA酶滅活的雙蒸水，立即進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)或置于-80℃低溫冰箱凍存。c-FLIP上游引物：5'-TTTACCACCCAGAGACACGC-3'，下游引物：5'-AGAACCTCTGCCTGCTGAAC-3'。MDR1上游引物5'-ACCTGTGAAGAGTAGAACATGAAGA-3'，下游引物：5'-AATGTTCTGGCTTCCGTTGC-3'。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：根據(jù)Super Script?ⅢFirst-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR Kits的說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：5℃10 min，50℃30 min，85℃5 min，然后加入1 μl的E.coliRNase H在37℃保溫20 min。定量PCR反應(yīng)條件為50℃2 min，95℃3 s，60℃30 s，總共40個(gè)循環(huán)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2 結(jié) 果

2.1 c-FLIP siRNA下調(diào)了K562及K562/ADR細(xì)胞c-FLIP的mRNA水平 K562及K562/ADR細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染陰性siRNA及c-FLIP siRNA 48 h后，提取細(xì)胞總RNA，熒光定量PCR檢測c-FLIP的mRNA水平，檢測c-FLIP siRNA的干擾效果。如圖1所示，c-FLIP siRNA轉(zhuǎn)染K562及K562/ADR細(xì)胞均能顯著下調(diào)c-FLIP的mRNA水平(P＜0.05)。

圖1 c-FLIP siRNA轉(zhuǎn)染K562(左)或K562/ADR(右)細(xì)胞48 h后，兩種細(xì)胞中c-FLIP的mRNA表達(dá)水平

2.2 c-FLIP干擾誘導(dǎo)了K562/ADR細(xì)胞增殖抑制 K562及K562/ADR細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染siRNA及c-FLIP siRNA24 h、48 h后通過MTT細(xì)胞活力檢測兩種細(xì)胞在轉(zhuǎn)染siRNA前后的增殖率。如表1中所示。在K562細(xì)胞中，陰性siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)K562的增殖沒有影響，而在K562/ADR細(xì)胞中轉(zhuǎn)染陰性siRNA抑制了K562/ADR細(xì)胞增殖(P＜0.05)，可能是由于K562/ADR細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)染試劑及轉(zhuǎn)染過程比較敏感。c-FLIP siRNA轉(zhuǎn)染K562后與陰性siRNA轉(zhuǎn)染組比較，24 h及48 h增殖率均受到一定程度的抑制(P＜0.05)，但細(xì)胞仍然繼續(xù)增殖(增殖率為正值)，只是速率減緩。c-FLIP siRNA轉(zhuǎn)染K562/ADR后與陰性siRNA轉(zhuǎn)染組比較，24 h及48 h增殖率均呈負(fù)值，抑制了細(xì)胞生長(P＜0.05)。K562/ADR對(duì)照組細(xì)胞能在含1 000 ng/ml的阿霉素的培養(yǎng)基中正常增殖，K562/ADR轉(zhuǎn)染c-FLIP siRNA后同樣的培養(yǎng)條件卻誘導(dǎo)了細(xì)胞生長抑制，表明其對(duì)阿霉素的敏感性增加，耐藥濃度的阿霉素抑制了細(xì)胞生長。

表1 c-FLIP siRNA轉(zhuǎn)染后K562及K562/ADR細(xì)胞增殖率(%，±s)

表1 c-FLIP siRNA轉(zhuǎn)染后K562及K562/ADR細(xì)胞增殖率(%，±s)

注：表示與空白對(duì)照組比較，p<0.05;表示與陰性siRNA轉(zhuǎn)染組比較，p<0.05.

組別空白對(duì)照組陰性siRNA轉(zhuǎn)染組c-FLIP siRNA轉(zhuǎn)染組K562 (RPMI-1640正常培養(yǎng)基) 24 h 53.22±3.98 53.62±4.07 45.60±3.09ab48 h 67.13±2.80 69.14±1.82 60.69±2.23abK562/ADR (RPMI-1640培養(yǎng)基中添加1 000 ng/ml阿霉素) 24 h 43.36±3.75 9.72±0.61a-14.41±2.94ab48 h 30.92±4.57 -6.07±0.71a-37.45±3.53ab

2.3 c-FLIP干擾誘導(dǎo)了K562/ADR細(xì)胞凋亡 為了進(jìn)一步揭示c-FLIP siRNA轉(zhuǎn)染K562/ADR細(xì)胞導(dǎo)致其增殖被抑制是否是由于誘導(dǎo)了K562/ADR細(xì)胞發(fā)生凋亡。通過Annexin V/7-ADD雙染的方法檢測了K562及K562/ADR細(xì)胞轉(zhuǎn)染c-FLIP siRNA后細(xì)胞凋亡情況。如圖2中所示，K562轉(zhuǎn)染c-FLIPsiRNA并不誘導(dǎo)K562細(xì)胞發(fā)生凋亡，而在K562/ADR中轉(zhuǎn)染c-FLIP siRNA[早期凋亡率為(9.2±0.4)%]與轉(zhuǎn)染陰性siRNA[(早期凋亡率為(5.2±0.4)%]相比明顯誘導(dǎo)了其發(fā)生凋亡(P＜0.05)。以上結(jié)果均表明，K562/ADR轉(zhuǎn)染c-FLIP siRNA后增加了K562/ADR對(duì)阿霉素的敏感性，本身對(duì)K562/ADR耐藥濃度的阿霉素誘導(dǎo)了細(xì)胞發(fā)生凋亡并抑制細(xì)胞增殖，逆轉(zhuǎn)了K562/ADR對(duì)阿霉素的耐藥。

2.4 c-FLIP siRNA干擾c-FLIP的表達(dá)對(duì)多藥耐藥基因MDR1 mRNA水平的影響 由于白血病化療失敗的主要原因是白血病細(xì)胞的多藥耐藥性(MDR1)，其中多藥耐藥基因(MDR1)的表達(dá)在決定白血病細(xì)胞耐藥中起了關(guān)鍵作用。因此我們推測c-FLIP siRNA轉(zhuǎn)染K562/ADR細(xì)胞誘導(dǎo)其增殖抑制及細(xì)胞發(fā)生凋亡的可能原因是影響了MDR1的表達(dá)。因此我們研究了c-FLIP siRNA轉(zhuǎn)染K562/ADR細(xì)胞對(duì)MDR1基因表達(dá)水平的影響，如圖3中所示，c-FLIP siRNA轉(zhuǎn)染顯著下調(diào)了c-FLIP的mRNA水平，MDR1的mRNA水平也顯著地被下調(diào)了(P＜0.05)。

圖2 c-FLIP siRNA轉(zhuǎn)染K562或K562/ADR細(xì)胞48 h后，AnnexinV/7-ADD雙染法檢測細(xì)胞的凋亡率

圖3 c-FLIP siRNA轉(zhuǎn)染K562/ADR細(xì)胞48 h后，熒光定量PCR檢測MDR1的mRNA水平

3 討論

腫瘤多藥耐藥的機(jī)制十分復(fù)雜，主要有藥物外排泵(MDR1/Pgp、MRP等)的過度表達(dá)、藥物作用靶點(diǎn)的改變、DNA修復(fù)機(jī)制活性增強(qiáng)和藥物解毒、消除酶的表達(dá)增多、凋亡通路阻滯等[4]。在異常的腫瘤微環(huán)境中，一方面腫瘤細(xì)胞存活、凋亡通路中的激酶和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子能誘導(dǎo)解毒、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(如Pgp等)的表達(dá)與活化[5]，降低了腫瘤細(xì)胞內(nèi)的藥物蓄積濃度；另一方面藥物解毒、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的過量表達(dá)又改變了細(xì)胞膜的組成、通透性和細(xì)胞內(nèi)的pH值等，這些變化能抑制細(xì)胞的凋亡。因此腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性，是腫瘤細(xì)胞凋亡水平的異常改變和其他腫瘤多藥耐藥機(jī)制共同作用的結(jié)果[6]。

細(xì)胞型Fas相關(guān)死亡區(qū)域蛋白樣白介素-1β轉(zhuǎn)換酶抑制蛋白(c-FLIP)，是一種新近發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白，能強(qiáng)效抑制Fas(CD95/APO-1)、TRAIL(腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體)-R1/R2(DR4/5)、TNFR1(腫瘤壞死因子受體)等死亡受體(DR)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[7]。研究表明：持續(xù)的c-FLIP高表達(dá)為腫瘤細(xì)胞耐受DR4/5誘導(dǎo)的凋亡和耐藥的主要決定因素[8]。使用RNA干擾(RNAi)技術(shù)，利用特定的si-RNA使c-FLIP基因沉默，能恢復(fù)腫瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL介導(dǎo)的凋亡敏感性和化療敏感性。此外，研究表明，c-FLIP還在NF-κB、MAPK、PI3-K等細(xì)胞增殖、存活通路中亦同樣起著重要的調(diào)節(jié)功能，故稱其為“細(xì)胞生死存亡(Death and life)的分子開關(guān)”[9-10]。

在耐藥逆轉(zhuǎn)的研究中，除了以藥物外排泵(MDR1/Pgp為代表)等為靶點(diǎn)外，鑒于大多數(shù)化療藥物最終通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)揮治療作用，我們以凋亡通路關(guān)鍵調(diào)控蛋白c-FLIP作為靶點(diǎn)恢復(fù)腫瘤細(xì)胞的凋亡敏感性是非常可行的治療策略。因此本研究通過RNAi手段抑制蛋白c-FLIP，研究干擾c-FLIP的表達(dá)對(duì)阿霉素耐藥K562/ADR細(xì)胞的耐藥性改變，以期揭示c-FLIP在介導(dǎo)白血病細(xì)胞對(duì)阿霉素耐藥過程中的作用機(jī)理。

本研究顯示：c-FLIP siRNA轉(zhuǎn)染K562及K562/ ADR細(xì)胞下調(diào)c-FLIP的表達(dá)后，K562細(xì)胞增殖受到一定程度的抑制(P＜0.05)，但是并未顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，卻明顯下調(diào)了K562/ADR細(xì)胞中耐藥基因MDR1的表達(dá)水平，并引起了K562/ADR細(xì)胞對(duì)阿霉素耐藥性的改變，顯著地誘導(dǎo)了K562/ADR細(xì)胞凋亡及增殖抑制。即c-FLIP正常表達(dá)情況下，K562/ADR細(xì)胞對(duì)阿霉素(1 000 ng/ml)耐藥，當(dāng)通過RNAi使c-FLIP表達(dá)下調(diào)后，耐藥基因MDR1水平也被下調(diào)，引起了K562/ADR細(xì)胞對(duì)阿霉素耐藥性降低，敏感性增加，從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖抑制及細(xì)胞凋亡。

K562/ADR細(xì)胞培養(yǎng)條件始終是RPMI-1640+ 10%FBS+1 000 ng/ml阿霉素。在同樣的細(xì)胞培養(yǎng)條件下，干擾c-FLIP表達(dá)導(dǎo)致MDR1表達(dá)下調(diào)的K562/ADR細(xì)胞與正常的K562/ADR細(xì)胞相比對(duì)1 000 ng/ml阿霉素敏感性增加了，所以這個(gè)濃度的阿霉素能誘導(dǎo)干擾c-FLIP表達(dá)導(dǎo)致MDR1表達(dá)下調(diào)的K562/ADR細(xì)胞增殖抑制及細(xì)胞凋亡。即干擾c-FLIP能逆轉(zhuǎn)K562/ADR細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥。

為什么c-FLIP siRNA轉(zhuǎn)染K562及K562/ADR細(xì)胞下調(diào)c-FLIP的表達(dá)后對(duì)K562細(xì)胞的凋亡沒有顯著地影響?與陰性siRNA轉(zhuǎn)染組比較，K562細(xì)胞24 h及48 h增殖率均有受到一定程度的抑制(P＜0.05)，但細(xì)胞仍然繼續(xù)增殖(增殖率為正值)，只是速率減緩。筆者考慮：實(shí)驗(yàn)對(duì)K562及K562/ADR細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染陰性siRNA及c-FLIP siRNA 48 h后，檢測c-FLIP siRNA的干擾效果結(jié)果表明c-FLIP siRNA轉(zhuǎn)染K562及K562/ADR細(xì)胞均能顯著地下調(diào)c-FLIP的mRNA水平(P＜0.05)，但其實(shí)c-FLIP并沒有被完全干擾掉，只是相對(duì)明顯地下調(diào)了。也許這些改變還不足以明顯地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，而腫瘤的發(fā)生、發(fā)展亦是多種因素、多種途徑促成的，增殖過度、分化阻滯和凋亡受抑都會(huì)引起機(jī)體的病理狀態(tài)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑也是紛繁復(fù)雜，考慮是否還存在著其他的途徑、機(jī)理或者其他的干擾因素，使其還不足以非常顯著地抑制白血病細(xì)胞的凋亡和完全的負(fù)增殖。但在耐藥細(xì)胞的培養(yǎng)基里是含阿霉素的，使用RNAi，c-FLIP表達(dá)受抑制，卻促進(jìn)了阿霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，c-FLIP siRNA體現(xiàn)了作為阿霉素誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡的增敏劑的作用，逆轉(zhuǎn)了阿霉素耐藥。

綜上所述，本研究揭示了c-FLIP及MDR1在介導(dǎo)K562/ADR對(duì)阿霉素耐藥中所起的關(guān)鍵作用，初步闡釋了c-FLIP siRNA逆轉(zhuǎn)K562/ADR對(duì)阿霉素耐藥的機(jī)制是通過下調(diào)c-FLIP以及多藥耐藥基因MDR1的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。本研究對(duì)于闡釋白血病的預(yù)后因素、阿霉素耐藥機(jī)制以及尋找有應(yīng)用價(jià)值的治療選擇性標(biāo)志物均具有著十分重要的意義。

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Effect of siRNA-mediated silencing of c-FLIP on adriamycin-resistance of K562/ADR cells.

SONG Min1,WANG Jian-ning1,MENG Qing-qi1,BAO Hong-yu1,YANG Jie2.1.Department of Hematology,the Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210011,Jiangsu,CHINA;2.Jiangsu Province Institute of Traditional Chinese Medicine,Nanjing 210028,Jiangsu,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of silenced c-FLIP mRNA level by small interfering RNA (siRNA)on adriamycin-resistance of K562/ADR cells.Methodsc-FLIP siRNA and negative siRNA were transfected into K562 and K562/ADR cell lines respectively,and mRNA expression of c-FLIP and multi-drug resistance gene 1 (MDR1)were detected by quantitative PCR.Cell proliferation rate was detected by MTT assay,and cell apoptosis rate was assayed by Annexin V/7-ADD double-staining method.ResultsCompared with negative siRNA transfection group,siRNA transfection significantly decreased c-FLIP mRNA expression in K562 cells(P＜0.05)and slightly inhibited the proliferation of K562 cell(not enough to induce K562 cell apoptosis).The 48 h proliferation rates of K562 cells were(69.14±1.82)%and(60.69±2.23)%in negative siRNA transfection group and siRNA transfection group, and the apoptosis rate were(1.7±0.3)%and(1.8±0.2)%,respectively.c-FLIP siRNA transfection significantly inhibited K562/ADR proliferation and induced cell apoptosis(P＜0.05).The 48 h proliferation rate of K562/ADR cells were (-6.07±0.71)%and(-37.45±3.53)%in negative siRNA transfection group and siRNA transfection group,and the apoptosis rate were(5.2±0.4)%and(9.2±0.4)%,respectively.In addition,MDR1 mRNA expression of K562/ADR was significantly decreased(P＜0.05)upon c-FLIP siRNA transfection(P＜0.05).Conclusionc-FLIP siRNA transfection significantly decreases mRNAexpression of MDR1 and inhibites the adriamycin-resistance of K562/ADR cells.

Small interfering RNA(siRNA);Multi-drug resistance gene 1(MDR1);K562/ADR;Adriamycin resistance

R96

A

1003—6350（2015）11—1561—05

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.11.0560

2014-12-17)

南京醫(yī)科大學(xué)科技發(fā)展基金重點(diǎn)項(xiàng)目(編號(hào)：2010NJMUZ49)

宋 敏。E-mail:songmin218@163.com