潘衛(wèi)兵，曹石金，謝禮仁，朱 斌，金 巖

（深圳市坪山新區(qū)人民醫(yī)院泌尿外科，廣東 深圳 518118）

大鼠糖尿病性勃起功能障礙模型的制備

潘衛(wèi)兵，曹石金，謝禮仁，朱 斌，金 巖

（深圳市坪山新區(qū)人民醫(yī)院泌尿外科，廣東 深圳 518118）

目的 探討理想糖尿病性勃起功能障礙(ED)大鼠模型的制備方法。方法90只SD大鼠，隨機(jī)分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三組各30只，每組再分為正常組(CN)和糖尿病組(DM)，每組各15只，DM組腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ，65 mg/kg)誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型，CN組腹腔注射等量體積的檸檬酸鹽緩沖液。成模8周、12周及16周注射阿樸嗎啡(APO，80μg/kg)觀察大鼠陰莖勃起情況，制備糖尿病性ED大鼠模型。結(jié)果Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三組中的糖尿病大鼠在8、12、16周注射阿樸嗎啡后勃起次數(shù)分別為(1.0±0)次、(1.0±0)次、(1.0±0)次，勃起率分別為33.3%、21.4%、14.3%，ED發(fā)生率分別為66.7%、78.6%、85.7%。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三組中的正常大鼠勃起次數(shù)分別為(2.2±0.8)次、(2.3±0.8)次、(2.0±0.7)次，勃起率均為100%，ED發(fā)生率為0。各組間勃起率比較差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)論采用STZ 65 mg/kg腹腔注射建立糖尿病大鼠模型方法安全有效，頸部皮下注射APO 80 μg/kg篩選糖尿病ED大鼠可行可靠。

糖尿病；勃起功能障礙；鏈脲佐菌素

近年來(lái)，糖尿病(Diabetes mellitus，DM)發(fā)病率呈逐年增高態(tài)勢(shì)，全球已確診糖尿病患者1.5億人，預(yù)測(cè)2025年將增至3億[1]。糖尿病導(dǎo)致神經(jīng)血管病變，與勃起功能障礙(Erectile dysfunction，ED)關(guān)系密切，ED在糖尿病患者中的發(fā)病率較同齡非糖尿病患者高3倍[2]。且糖尿病患者ED的發(fā)生比正常人群早，并隨病程的延長(zhǎng)而增加[3]，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。目前，DMED的病因和發(fā)病機(jī)制至今不完全明確有待繼續(xù)深入研究，而構(gòu)建DMED動(dòng)物模型是研究該疾病的必要條件。本文旨在探討構(gòu)建DMED大鼠模型的最佳方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及器材 鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ，Sigma公司)，阿樸嗎啡(Apomorphine，APO，Sigma公司)，檸檬酸與檸檬酸三鈉(上?；ぴ噭┕?，ONETOUCH血糖儀及試紙(強(qiáng)生公司)，0.22 μm濾菌器(Corning公司)。

1.2 主要溶液的配制

1.2.1 檸檬酸鈉緩沖液配制 將2.10 g檸檬酸加入雙蒸水100 ml配成檸檬酸母液，稱為A液；將2.94 g檸檬酸三鈉加入雙蒸水100 ml配成檸檬酸鈉母液，稱為B液；將A、B液按1:1.32比例混合，pH計(jì)測(cè)定pH值，調(diào)定溶液pH=4.0，即是所需配制STZ的0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液。

1.2.2 STZ溶液的配制 將STZ溶于0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液中，新鮮配制成10 g/L濃度的STZ溶液，并用0.22 μm濾菌器過(guò)濾除菌。注意避光配制，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 8周齡雄性無(wú)特定病原體SD大鼠90只(體重250～300 g，納入研究前與發(fā)情期雌鼠交配證實(shí)具有正常的性功能。由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。隨機(jī)分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三組各30只，每組又分為正常組(CN)和糖尿病組(DM)，每組各15只。所有大鼠均以SPF級(jí)鼠料，標(biāo)準(zhǔn)籠飼養(yǎng)。兩組大鼠實(shí)驗(yàn)期間自由進(jìn)食飲水。12 h/12 h晝夜照明，室內(nèi)通風(fēng)良好，相對(duì)濕度為50%～70%，氨濃度＜20 ppm，室溫保持在18℃～20℃。

1.4 建模方法 所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)2周，造模前禁食24 h，DM組按65 mg/kg·體重腹腔注射1% STZ溶液(pH 4.0)，CN組腹腔注射等量體積的檸檬酸鹽緩沖液。

1.5 血糖與體重的測(cè)定 STZ誘導(dǎo)72 h后剪尾取其尾靜脈血，采用血糖儀檢測(cè)大鼠血糖，血糖水平≥16.7 mmol/L定義為糖尿病大鼠。每周測(cè)量一次血糖和體重。血糖尚未達(dá)標(biāo)者可追加半劑量STZ至成模。

1.6 DMED大鼠模型的篩選

1.6.1 APO溶液的配制 稱取APO，溶解于0.9%氯化鈉溶液及0.5 mg/kg的維生素C，調(diào)整體積為5 ml/kg，4℃冰箱冷藏備用。

1.6.2 陰莖勃起功能的評(píng)估 成模8周(Ⅰ)、12周(Ⅱ)、16周(Ⅲ)周時(shí)稱重后將大鼠放在代謝籠中，適應(yīng)環(huán)境10 min，保持室內(nèi)安靜，應(yīng)用阿樸嗎啡80 μg/kg在大鼠頸項(xiàng)皮膚松軟處皮下注射，每只大鼠注射后觀察30 min，并記錄陰莖有無(wú)勃起及勃起次數(shù)。龜頭充血及末端陰莖體露出為陰莖勃起1次，無(wú)陰莖勃起者為DMED大鼠。每組大鼠中有陰莖勃起者百分比為勃起率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用方差分析處理數(shù)據(jù)，以P＜0.05表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ糖尿病組注射STZ 3 d后測(cè)血糖各有1只尚未達(dá)DM模型標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)追加半劑量STZ后復(fù)測(cè)血糖均達(dá)標(biāo)。CN組的大鼠飲水少，尿量少，皮毛干凈，有光澤，體重持續(xù)穩(wěn)步增長(zhǎng)。DM大鼠建模成功后逐漸出現(xiàn)典型的“三多一少”糖尿病癥狀。隨著病程的進(jìn)展，糖尿病大鼠毛色逐漸出現(xiàn)干枯發(fā)黃、污穢無(wú)光澤、體重下降、反應(yīng)遲鈍等現(xiàn)象，誘導(dǎo)糖尿病8周后陸續(xù)出現(xiàn)白內(nèi)障。Ⅱ及Ⅲ組DM大鼠各死亡1只。

2.2 各組大鼠血糖、體重及注射APO后陰莖勃起情況 CN組血糖波動(dòng)在3.1～5.0 mmol/L，DM組血糖范波動(dòng)在16.7～31.0 mmol/L，兩組間比較差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。DM組體重隨病程進(jìn)展逐漸降低，而CN組體重穩(wěn)步增長(zhǎng)。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三組中的糖尿病大鼠ED發(fā)生率分別為66.7%、78.6%、85.7%，勃起次數(shù)及勃起率隨病程延長(zhǎng)而逐漸降低，與對(duì)照組比較差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血糖、體重及注射APO后陰莖勃起情況(±s)

表1 各組大鼠血糖、體重及注射APO后陰莖勃起情況(±s)

注：與CN組比較，aP＜0.01，bP＜0.01。

項(xiàng)目 Ⅰ組 Ⅱ組 Ⅲ組血糖（mmol/L）體重(g)勃起次數(shù)（次）DM 27.1±2.7a260.56±21.23a1.0±0.0aCN 3.4±0.7 581.73±10.5 2.2±0.8 DM 28.1±2.2a231.23±19.7a1.0±0.0aCN 3.5±0.6 680.56±12.37 2.3±0.8 DM 28.9±2.3a195.42±26.8a1.0±0.0aCN 3.4±1.2 712.49±10.3 2.0±0.7

3 討論

糖尿病性勃起功能障礙是糖尿病常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，為研究其發(fā)病機(jī)理和尋找有效的治療方法，首先需建立可靠的DMED動(dòng)物模型?？捎糜谥苽銬MED模型的動(dòng)物很多，如大鼠、狗、貓、兔、小鼠等[4-5]。而SD大鼠因抗感染力強(qiáng)、繁殖周期短、易于獲得、價(jià)格低廉，在對(duì)盆腔、陰莖的血管及神經(jīng)解剖、受體分布、性反射等方面都與人相似，備受研究者青睞[6]。因此，我們選擇SD大鼠用于制備DMED動(dòng)物模型。

糖尿病動(dòng)物模型的構(gòu)建方法有很多，包括實(shí)驗(yàn)性糖尿病動(dòng)物模型、自發(fā)性糖尿病動(dòng)物模型和轉(zhuǎn)基因糖尿病動(dòng)物模型等。其中，實(shí)驗(yàn)性糖尿病動(dòng)物模型是目前最常采用的方法。STZ為一種含硝基的廣譜抗生素，具有抗菌、抗腫瘤作用，且對(duì)動(dòng)物胰島B細(xì)胞具有高度特異性的毒性作用，引起胰島素合成和分泌減少，現(xiàn)已成為目前廣泛采用的糖尿病動(dòng)物模型化學(xué)誘導(dǎo)藥物。STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型因給藥方式不同，其成模效率也可能不同，如果采用小劑量分次注射的給藥方法，則建立與人類2型糖尿病表現(xiàn)相似的大鼠模型，如果采用較大劑量一次性注射的給藥方法，則建立與人類1型糖尿病表現(xiàn)相似的大鼠模型，其機(jī)制可能與胰島的損傷程度有關(guān)。STZ的給藥途徑較多，如腹腔注射、尾靜脈注射以及皮下注射等，劑量為35～75 mg/kg。尾靜脈注射及皮下注射操作較繁瑣，且易出現(xiàn)誤差，而腹腔注射操作簡(jiǎn)便快捷。研究表明，65 mg/kg STZ腹腔注射制備糖尿病動(dòng)物模型是一種簡(jiǎn)單易行的方法[7-8]。我們以STZ 65 mg/kg單次腹腔注射，3 d后檢測(cè)血糖成模率達(dá)93.3%(42/45)，在成模后12及16周期間各死亡一只大鼠，死亡率為4.44%(2/45)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，我們選用SPF級(jí)雄性SD大鼠，以65 mg/kg劑量通過(guò)單次腹腔注射STZ的方法可成功構(gòu)建糖尿病大鼠的動(dòng)物模型。建模后大鼠血糖值始終處于高血糖水平上波動(dòng)，并隨著病程延長(zhǎng)有所提高，持續(xù)觀察至16周，高血糖狀態(tài)未見(jiàn)轉(zhuǎn)復(fù)，出現(xiàn)典型“三多一少”的糖尿病癥狀，這與人類2型糖尿病在臨床表現(xiàn)及病理改變上都極為相似。我們認(rèn)為采用STZ制備糖尿病大鼠模型是可靠的實(shí)驗(yàn)方法。

陰莖勃起實(shí)質(zhì)上是在神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控下的一系列神經(jīng)血管活動(dòng)，糖尿病導(dǎo)致神經(jīng)血管病變，是與ED關(guān)系最為密切的疾病之一。APO是一種多巴胺受體激動(dòng)劑，它可通過(guò)刺激下丘腦室旁核處的多巴胺受體而引起陰莖勃起，并通過(guò)骶副交感神經(jīng)叢擴(kuò)張陰莖海綿體血管而引起陰莖勃起。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)頸部皮下注射APO 80μg/kg的方法評(píng)估大鼠的勃起功能，我們發(fā)現(xiàn)正常大鼠在注射APO后均有陰莖勃起，勃起率達(dá)100%，而在8、12、16周糖尿病大鼠勃起率分別為33.3%、21.4%、14.3%，勃起率顯著降低，可證實(shí)糖尿病是導(dǎo)致ED的重要因素。糖尿病ED是糖尿病全身病變?cè)诰植勘憩F(xiàn)，既往研究大多數(shù)時(shí)限在8～10周，可節(jié)省成本，但不能充分顯示疾病的發(fā)展過(guò)程，本研究將病程延長(zhǎng)至16周，可更好地反映糖尿病的病理改變。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，隨著病程延長(zhǎng)，糖尿病大鼠的勃起功能進(jìn)行性降低，設(shè)想早期進(jìn)行治療干預(yù)可能會(huì)延緩疾病進(jìn)展，這將是我們下一步研究的方向。

綜上所述，應(yīng)用STZ 65 mg/kg單次腹腔注射建立糖尿病大鼠模型安全有效。8周后采用頸部皮下注射APO 80 ug/kg進(jìn)行陰莖勃起功能實(shí)驗(yàn)的方法來(lái)篩選DMED大鼠模型可行可靠，為我們后續(xù)研究DMED病理生理機(jī)制和探索有效的治療方法提供了理想的動(dòng)物模型。

[1]Lawal M.Management of diabetes mellitus in clinical practice[J]. Br J Nurs,2008,17(17):1106-1113.

[2]Lue TF.Physiolgly of penile erection and pathophysioloy of erectile dysfunction[M]//Wein AJ,Kavoussi LR,Novick AC,et al.Campbell Walsh Urology.9thed.Philadelphia,Saunders,2008:718.

[3]Hamdan F,Al-Matubsi H.Assessment of erectile dysfunction in diabetic patients[J].Int JAndrol,2009,32(2):176-185.

[4]Xie D,Odronic SI,Wu F,et al.Mouse model of erectile dysfunction due to diet-induced diabetes mellitus[J].Urology,2007,70(1): 196-201.

[5]Gianduzzo TR,Colombo JR,EI-Gabry E,et al.Anatomical and electrophysiological assessment of the canine periprostatic neurovascular anatomy:perspectives as a nerve sparing radical prostatectomy model[J].J Urol,2008,179(5):2025-2029.

[6]Mehta N,Sikka S,Rajasekaran M.Rat as an animal model for male erectile function evaluation in sexual medicine research[J].J Sex Med,2008,5(6):1278-1283.

[7]Nelson E,Bennett,Jang H,et al.Improvement in erectile dysfunction after neurotrophic factor gene therapy in diabetic rats[J].J Urol,2005,173(5):1820-1824.

[8]Fan M,Xu X,He X,et al.Protective effects of hydrogen-rich saline against erectile dysfunction in a streptozotocin induced diabetic rat model[J].J Urol,2013,190(1):350-356.

Establishment of diabetic rat models with erectile dysfunction.

PAN Wei-bing,CAO Shi-jin,XIE Li-ren,ZHU Bin, JIN Yan.Department of Urology,Pingshan People's Hospital of Shenzhen,Shenzhen 518118,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the ideal method for establishing diabetic rats model with erectile dysfunction(ED).MethodsNinety male SD rats were randomly divided into 3 groups(groupⅠ,Ⅱ,Ⅲ),each with 30 rats.Each group were further divided into control(CN)subgroup and diabetes mellitus(DM)subgroup equally,with 15 rats in each subgroup.SD rats were injected intraperitoneally with 65 mg/kg streptozotocin(STZ)to make experimental models of DM(DM subgroup),and equal volume of citrate buffer was injected in the CN subgroup.Injected with apomorphine,penile erection of the rat models were observed 8(groupⅠ),12(groupⅡ),and 16 weeks(groupⅢ)after establishment of models.ResultsThe times of penis erection in DM subgroups of groupⅠ,Ⅱ,Ⅲwere (1.0±0),(1.0±0),(1.0±0),respectively,and the rates of penis erection were only 33.3%,21.4%,14.3%,with the incidences of ED of 66.7%,78.6%,85.7%.The times of penis erection in CN subgroups of groupⅠ,Ⅱ,Ⅲwere(2.2±0.8), (2.3±0.8),(2.0±0.7),respectively,and the rates of penis erection were all 100%,with the incidences of ED of 0.There was statistically significant differences in the rates of penis erection between the DM subgroup and the CN subgroup (P＜0.01).ConclusionIntraperitoneal injection with STZ(65 mg/kg)is a safe method for establishment of diabetic rat model.Subcutaneous injection with apomorphine(80 μg/kg)is effective to screen diabetic rat model with erectile dysfunction.

Diabetes mellitus;Erectile dysfunction;Streptozotocin

R-332

A

1003—6350（2015）05—0629—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.05.0227

2014-08-07)

深圳市坪山新區(qū)醫(yī)療衛(wèi)生發(fā)展孵化資助資金項(xiàng)目(編號(hào)：201206)；深圳市科技創(chuàng)新委員會(huì)知識(shí)創(chuàng)新計(jì)劃基礎(chǔ)研究(編號(hào)：201404163000117)

潘衛(wèi)兵。E-mail:szys67@sina.com