張麗娜 舒東嬌 劉莉莉 馬玥 曹子晶

(哈爾濱市疾病預(yù)防控制中心 黑龍江 哈爾濱 150056)

菌種保藏方法有很多種，實(shí)驗(yàn)室常規(guī)采用的方法普遍存在保存時(shí)間短、需頻繁傳代等缺點(diǎn)，若要實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期保存，則需購置專用設(shè)備，費(fèi)用較高，且操作較復(fù)雜，不利于廣泛應(yīng)用。為能建立一種操作簡(jiǎn)便、保存時(shí)間長(zhǎng)、菌種穩(wěn)定性好的保藏方法，本文對(duì)三種簡(jiǎn)便的菌種保藏方法進(jìn)行了比較性研究。

1.材料與方法

1.1 菌株

標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌8099、金黃色葡萄球菌ATCC6538、銅綠假單胞菌15442、產(chǎn)氣腸桿菌45102、銅綠假單胞菌10104、傷寒沙門菌50071、福氏志賀菌51573、宋內(nèi)志賀菌51334、溶血性鏈球菌32210 購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院。標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌25922、金黃色葡萄球菌26003、表皮葡萄球菌26069、糞腸球菌ATCC29212、溶血性鏈球菌CICC10373，購自廣東環(huán)凱微生物有限公司。

1.2 保藏方法

1.2.1 鮮牛奶法

將鮮牛奶500 mL，煮沸后靜置冷卻，除去上層脂肪，反復(fù)3 次，然后用脫脂棉反復(fù)3 次過濾后，115℃，15 min 壓力蒸氣滅菌后分裝于無菌2 mL 塑料離心管中，每管1 mL ，質(zhì)控合格后備用［1］。將需保存的菌種37℃培養(yǎng)18 h 后，大量接種于此管中制備成濃菌液，置于普通冰箱的－20℃冷凍室保存。定期將保存菌株取出接種增菌肉湯中，35 ℃孵育18～24h ，再將菌懸液劃線接種血瓊脂培養(yǎng)基，觀察菌株的存活情況及其菌落特征，并檢驗(yàn)其生化特性。

1.2.2 濾紙片法

用打孔器將新華濾紙制成直徑6 mm 圓形小紙片，放入玻璃平皿中，經(jīng)高壓蒸汽滅菌后備用。將待保存菌種在血平板上大量分離純化后，用無菌小鑷子夾住濾紙片，在平板上刮取菌落，放入無菌塑料離心管，封口后置于普通冰箱的－20 ℃冷凍室保存［2］。定期將保存菌株取出1－2片，放入增菌肉湯中，35 ℃孵育18～24h ，再將菌懸液液劃線接種血瓊脂培養(yǎng)基，觀察菌株的存活情況及其菌落特征，并檢驗(yàn)其生化特性。

1.2.3 商品化菌種保藏管

根據(jù)使用說明書將需保存的菌種37 ℃培養(yǎng)18 h 后在CRYOBANK 菌種保藏管中制備成菌懸液，顛倒混勻，置于普通冰箱的－20 ℃冷凍室保存。定期取一粒小珠滾動(dòng)接種于血瓊脂培養(yǎng)基，35 ℃孵育18～24h ，觀察菌株的存活情況及其菌落特征，并檢驗(yàn)其生化特性。

1.3 菌株復(fù)蘇及鑒定

將全部菌株于保存后第3、6、9、12 個(gè)月進(jìn)行菌種復(fù)蘇，觀察菌株污染情況以及菌落特征及鏡下形態(tài)以及溶血性、抗原凝集特性等特征，根據(jù)《常見細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》鑒定特征性生化反應(yīng)，與保存之前進(jìn)行比較驗(yàn)證保存效果。并采用梅里埃API20E、API20NE 及API20S 生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)一步復(fù)核鑒定，判斷菌種保藏質(zhì)量。

2.結(jié)果

于保存后第3、6、9、12月將各菌株復(fù)蘇并進(jìn)行生化鑒定，各存活菌株的生化鑒定結(jié)果均與保藏前一致，詳見表1。

表1 三種保藏方法菌株存活情況

3.討論

菌種是一種重要的生物資源，成功進(jìn)行菌種保藏對(duì)于菌株的分子生物學(xué)特征研究和耐藥性變遷監(jiān)測(cè)，以及醫(yī)院感染病原學(xué)調(diào)查、新藥研究等至關(guān)重要，也是研究、推廣、開發(fā)和實(shí)際應(yīng)用科研成果的基礎(chǔ)［3］。

常規(guī)的菌種保存方法主要有冷凍真空干燥法和半固體培養(yǎng)基保存法，由于冷凍真空干燥法保存菌株存活率雖高，但操作繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、成本高，給實(shí)際工作帶來諸多不便，而半固體培養(yǎng)基保存法雖操作簡(jiǎn)單但具有保存期短、占用空間大、需反復(fù)傳代易導(dǎo)致細(xì)菌發(fā)生變異等缺點(diǎn)，因此尋找一種簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的菌種保存方法十分必要。

通過三種保藏方法的結(jié)果比較，苛氧菌的長(zhǎng)期保存應(yīng)選用CRYOBANK 菌種保藏管或鮮牛奶法，苛氧菌的短期保存及非苛氧菌的保存采用三種方法效果一致。三種保藏方法都具有操作簡(jiǎn)單、不需特殊設(shè)備、保存空間小等優(yōu)點(diǎn)，但CRYOBANK 菌種保藏管造價(jià)高，而鮮牛奶法和濾紙片法具有取材方便、操作簡(jiǎn)單、成本低廉的特點(diǎn)，從經(jīng)濟(jì)實(shí)用的角度出發(fā)，尤其適合于基層實(shí)驗(yàn)室，具有推廣應(yīng)用價(jià)值。

［1］ 徐雅娟，陳森洲，袁桂峰，駱耐香，劉菁，鐘毓娟.介紹一種新鮮牛奶保存菌種的好方法［J］.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2002，20(1):139－141.

［2］ 郭志勤.介紹一種簡(jiǎn)易的菌種保存方法［J］.臨床檢驗(yàn)雜志，2002，20(5):281.

［3］ 張愛梅，郭大城，王建麗，張保華，陳豪敏.病原微生物保藏研究進(jìn)展［J］.中國(guó)地方病防治雜志，2012，20(5):342－344.