喬芬 程橋 凡浙錄

手術(shù)切口的疼痛處理日益引起廣泛關(guān)注[1-2]。為了術(shù)后更充分的鎮(zhèn)痛，專家學(xué)者們根據(jù)術(shù)后疼痛的機(jī)制提出了多模式鎮(zhèn)痛的方法。而切口部位的局部浸潤麻醉是術(shù)后鎮(zhèn)痛的常用方法，超前鎮(zhèn)痛的理念也廣泛應(yīng)用于臨床麻醉過程中。有研究證明，0.5%羅哌卡因局部浸潤麻醉促進(jìn)GM-CSF表達(dá)，利于傷口愈合[3-4]。而地佐辛作為一種阿片受體混合激動(dòng)拮抗劑，鎮(zhèn)痛效果強(qiáng)而不良反應(yīng)少，用于臨床麻醉即術(shù)前或術(shù)后鎮(zhèn)痛[5-8]。但其對GM-CSF表達(dá)及傷口愈合的影響尚不明確。本實(shí)驗(yàn)擬研究地佐辛及兩種藥物復(fù)合使用對GM-CSF表達(dá)及傷口愈合的影響，為臨床用藥提供新的思路，現(xiàn)具體報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔雄性昆明小鼠100只（由山西省腫瘤醫(yī)院動(dòng)物房提供），體重25~30 g，采用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為生理鹽水浸潤組（NS組）、0.5%羅哌卡因局部浸潤組（L組）、地佐辛術(shù)前腹腔注射組（D組）、0.5%羅哌卡因局部浸潤復(fù)合地佐辛術(shù)前腹腔注射組（Y組），每組25只。將小鼠單籠飼養(yǎng)，每籠編號(hào)，依次為1~100號(hào)。

1.2 方法

1.2.1 切口痛模型制備 將小鼠腹腔注射6%戊巴比妥鈉（0.01 mL/g）麻醉，俯臥位固定于具有保溫設(shè)施的實(shí)驗(yàn)臺(tái)，背部脫毛消毒，于背部近頸側(cè)以脊柱為中線切除約0.8 cm×0.8 cm大?。s占體表面積的1.2%，由Meech-Rub-ner公式計(jì)算）皮膚全層切口。L組、D組、Y組分別于切皮前10 min皮下注射羅哌卡因（海南斯達(dá)制藥有限公司）1 mL/kg，腹腔注射地佐辛（揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司）5 mg/kg，皮下注射羅哌卡因1 mL/kg、腹腔注射地佐辛5 mg/kg。L組、D組、NS組不注射藥物部分注射等劑量生理鹽水。

1.2.2 創(chuàng)面愈合率及GM-CSF濃度測定 于傷后72 h在不同處理組中按完全隨機(jī)原則分別選取20只小鼠，行頸椎脫位術(shù)將小鼠處死，處死后取小鼠組織前用相機(jī)拍攝創(chuàng)面，所得圖像用Photoshop軟件進(jìn)行創(chuàng)面大小計(jì)算，以便測定傷后各組創(chuàng)面愈合率。照相后取材，切取包括4 mm的正常創(chuàng)緣的創(chuàng)面組織，超聲波粉碎后，制成組織勻漿，將制備好的勻漿離心留上清液，采用雙抗體一步夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測GM-CSF濃度（試劑盒購于北京四正柏生物科技有限公司），同時(shí)用BCA法測上清液蛋白濃度（試劑盒購于北京普利萊基因技術(shù)有限公司），為減小取材誤差，以二者之比表示GM-CSF濃度進(jìn)行比較，具體操作如下。

1.2.2.1 ELISA操作方法 （1）標(biāo)準(zhǔn)品液配制：使用前加入蒸餾水混勻，配成200 ng/mL的溶液。設(shè)標(biāo)準(zhǔn)管8管，第1管加標(biāo)本稀釋液900 μL，第2~8管加入標(biāo)本稀釋液500 μL，在第1管中加入200 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液100 μL混勻后用加樣器吸出500 μL，移至第2管。如此反復(fù)做對倍稀釋，從第7管中吸出500 μL棄去。第八管為空白對照。（2）10×標(biāo)本稀釋液用蒸餾水做1∶10倍稀釋。（3）洗滌液：用重蒸水1∶20稀釋。（4）加樣：設(shè)空白孔1個(gè)，標(biāo)準(zhǔn)孔7個(gè)，待測樣品54個(gè)。每孔各加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100 μL，將反應(yīng)板充分混勻后置37 ℃ 120 min。（5）洗板：用稀釋后洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4次，向?yàn)V紙上印干。（6）每孔中加入第一抗體工作液100 μL。將反應(yīng)板充分混勻后置37 ℃ 60 min。（7）洗板：再用稀釋后洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4次，向?yàn)V紙上印干。（8）每孔加入底物工作液100 μL，置37 ℃暗處反應(yīng)15 min。（9）每孔加入100 μL終止液混勻。（10）30 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm處測OD值。

1.2.2.2 ELISA測定結(jié)果的計(jì)算與判斷 （1）所有OD值都應(yīng)該減除空白值后再進(jìn)行計(jì)算。（2）以標(biāo)準(zhǔn)品20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312、0 ng/mL 為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上作圖，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品及對應(yīng)的OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計(jì)算出對應(yīng)的樣品濃度。

1.2.2.3 BCA法 （1）取0.8 mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)配置液加入到一管蛋白標(biāo)準(zhǔn)（20 mg BSA）中，充分溶解后配置成25 mg/mL的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液。（2）取適量25 mg/mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋至終濃度為0.5 mg/mL。（3）根據(jù)樣品數(shù)量，按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B（50∶1）配制適量BCA工作液，充分搖勻。（4）將標(biāo)準(zhǔn)品按 0、1、2、4、8、12、16、20 μL加到 96孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補(bǔ)足到20 μL。（5）加適當(dāng)體積樣品到96孔板的樣品孔中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液到20 μL。（6）各孔加入200 μL BCA工作液，37 ℃放置30 min。（7）測定A562，540~595 nm之間的波長也可接受。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的標(biāo)準(zhǔn)濃度。

1.3 觀察指標(biāo) （1）創(chuàng)面愈合時(shí)間：每組未處死5只小鼠，記錄創(chuàng)面達(dá)到完全愈合所需時(shí)間；（2）創(chuàng)面愈合率：創(chuàng)面愈合率=[（創(chuàng)面原有面積-各時(shí)相點(diǎn)創(chuàng)面測得面積）/創(chuàng)面原有面積]×100%；（3）GM-CSF表達(dá)：用ELISA法測得的GM-CSF濃度與BCA法測得的上清液蛋白濃度之比表示GM-CSF濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組小鼠創(chuàng)面愈合率及GM-CSF濃度比較 L、D、Y組切口愈合率、GM-CSF濃度均高于NS組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。D組切口愈合率、GMCSF濃度與L組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；Y組切口愈合率及GM-CSF濃度均高于L組且高于D組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

表1 四組小鼠創(chuàng)面愈合率及GM-CSF濃度比較（x-±s）%

2.2 四組小鼠切口愈合時(shí)間比較 NS、L、D、Y組的切口愈合時(shí)間分別為（17.8±1.30）、（12.0±1.23）、（11.6±0.89）、（9.8±0.87）d，L、D、Y 組切口愈合時(shí)間均較NS組短，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。D組切口愈合時(shí)間與L組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；Y組切口愈合時(shí)間短于D組及L組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

臨床上羅哌卡因局部浸潤和地佐辛靜脈注射均可產(chǎn)生良好的鎮(zhèn)痛作用，且有實(shí)驗(yàn)證明0.5%羅哌卡因局部浸潤麻醉有促進(jìn)傷口愈合的作用，而地佐辛對傷口愈合的影響不明確。GM-CSF是細(xì)胞中的粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞譜系的成熟和功能的重要調(diào)節(jié)劑，其參與了皮膚組織的創(chuàng)傷愈合，小鼠切口痛后72 h皮膚組織GM-CSF表達(dá)增加達(dá)峰值[9-11]。因此本研究選擇0.5%羅哌卡因和地佐辛進(jìn)行麻醉鎮(zhèn)痛，術(shù)后72 h測定GMCSF濃度。

本研究結(jié)果表明，0.5%羅哌卡因術(shù)前局部浸潤麻醉有促進(jìn)GM-CSF表達(dá)的作用，地佐辛超前鎮(zhèn)痛也有促進(jìn)GM-CSF表達(dá)的作用且二者復(fù)合使用促進(jìn)GMCSF表達(dá)的作用更佳，但0.5%羅哌卡因與地佐辛二者促進(jìn)GM-CSF表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。GM-CSF對傷口愈合的4個(gè)時(shí)相（止血、炎癥反應(yīng)、增殖和組織重塑）都有促進(jìn)的作用[6]。（1）止血階段：血管收縮，凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)的啟動(dòng)及所形成的止血栓共同起到了止血作用。已有報(bào)道從GM-CSF的注射部位打孔活檢組織觀察到GM-CSF注射部位的止血速度要比其他部位快。（2）炎癥反應(yīng)階段：吞噬細(xì)胞需要清除存在于創(chuàng)面的壞死的物質(zhì)，細(xì)胞的碎片和各種有害微生物。GM-CSF借以通過對中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的增殖和活化能力的促進(jìn)作用，來提高其吞噬活性還有其殺菌的能力，同時(shí)GM-CSF也可以刺激巨噬細(xì)胞分泌有利于創(chuàng)面愈合的一些細(xì)胞因子，如PDGF、FGF、TGF、EGF、VEGF等。（3）增殖階段：膠原基質(zhì)形成、肉芽組織形成及角質(zhì)上皮增殖，爬行覆蓋創(chuàng)傷表面及進(jìn)一步分化。GM-CSF可刺激增加成纖維細(xì)胞中α-肌動(dòng)蛋白的產(chǎn)生，而后者是肉芽組織形成所必需的。GM-CSF同時(shí)刺激新生角質(zhì)化上皮的增殖反應(yīng)。且在粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子注射部位的表皮蛋白、角蛋白等物質(zhì)產(chǎn)生均有所增加，而且這些蛋白的表達(dá)增加，正好是角質(zhì)化上皮細(xì)胞迅速分化的結(jié)果。（4）組織重塑階段：傷口收縮，膠原纖維有序重排和創(chuàng)口上皮的抗張力強(qiáng)度增加。粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子不但可以使傷口的收縮增加，也可增強(qiáng)傷口周圍組織的抗張力強(qiáng)度。研究證明，治療用rhGM-CSF影響了潰瘍性黏膜組織炎性細(xì)胞因子，降低了口腔黏膜潰瘍，也對深Ⅱ度燒傷的傷口清創(chuàng)愈合有促進(jìn)作用[9，12]。rhGM-CSF凝膠可促進(jìn)糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合，引起皮膚組織中微小RNA明顯差異性表達(dá)，這可能是其促進(jìn)創(chuàng)面愈合在基因轉(zhuǎn)錄后水平上的靶點(diǎn)，且對糖尿病傷口經(jīng)促炎因子水平的上調(diào)及新毛細(xì)血管的生成，從而促進(jìn)傷口愈合[13-14]。同時(shí)，GMCSF的應(yīng)用可以減少膠原蛋白的沉積，減少瘢痕的形成且可對傷口重塑和促進(jìn)聲帶再生[15-16]。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明，與生理鹽水組比較，其他三組小鼠傷口痛模型72 h后，GM-CSF均增加，且傷口愈合時(shí)間縮短，傷口愈合率提高，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。推測為0.5%羅哌卡因局部浸潤麻醉和地佐辛靜脈注射可以促進(jìn)GM-CSF的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)傷口愈合。

綜上所述，0.5%羅哌卡因術(shù)前局部浸潤麻醉能促進(jìn)GM-CSF表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)傷口愈合，地佐辛超前鎮(zhèn)痛也能使GM-CSF表達(dá)增加并促進(jìn)傷口的愈合且兩者復(fù)合使用對GM-CSF表達(dá)及傷口愈合作用更佳。但0.5%羅哌卡因與地佐辛促進(jìn)傷口愈合及GM-CSF表達(dá)的效果比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

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