張豫明 班素芬 余雙霞 曾方銀

靈芝孢子油是從靈芝孢子中提取出的具有生物活性的油狀脂質(zhì)物，含有諸如多糖、三萜類、脂肪酸及微生物等。已有研究證實，靈芝孢子具有提高免疫、抗病毒、降血脂以及抗炎和清除自由基等作用[1-4]。近期研究進(jìn)一步顯示，靈芝孢子油不僅具有抑制腫瘤生長、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，而且還抑制腫瘤的遷移和血管生成[5-11]。前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，近年來隨著生活水平的提高和人的預(yù)期壽命不斷延長，前列腺癌的發(fā)病率呈顯著上升趨勢。其中，雄激素受體在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中占有重要地位[12-14]。本研究探討靈芝孢子油對雙氰睪酮（Diydrotestoserone，DHT）誘導(dǎo)的前列腺癌LNCaP增殖、雄激素受體AR的激活和轉(zhuǎn)錄活性及相關(guān)激酶的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清（Hyclone），PKD1（A-20） 和 AR抗體（Santa Cruz），PKD磷酸化抗體（s744/748）和AR磷酸化抗體（pAR）購自CST；Beta-actin 抗 體（C4）：SC-47778（Santa Cruz），Lipofectamine2000（LIFE公司），雙氫睪酮（DHT）（Sigma公司），聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）所需丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、SDS、Tris及甘氨酸等超純生化試劑等（Promega公司）。人類雄激素受體結(jié)合的熒光素酶報告質(zhì)粒pMMTV-luc（鹿特丹大學(xué)醫(yī)學(xué)中心Dr.Brinkmann惠贈），海腎熒光素酶報告內(nèi)參照質(zhì)粒pRL-SV40（Promega公司），雙色熒光素酶報告基因檢測試劑盒（Dual luciferase reporter assay試劑盒）購自Promega公司。

1.2 細(xì)胞株和細(xì)胞培養(yǎng) LNCaP細(xì)胞（購自上海細(xì)胞庫）培養(yǎng)于DMEM完全培養(yǎng)基（10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 ng/mL鏈霉素）中，培養(yǎng)條件為37 ℃，5% CO2。

1.3 細(xì)胞增殖檢測 采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性。簡述如下：LNCaP細(xì)胞消化鋪至96孔板中，100 μL/孔，細(xì)胞數(shù)量為1000/孔。將培養(yǎng)板在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)過夜，每孔1∶100加入CCK-8溶液，放置培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2~4 h后Bio-Rad model 680 microplate reader酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定吸光度（OD），按如下公式計算細(xì)胞活性：細(xì)胞增殖活力/%=（處理組OD值-空白對照組OD值）/（對照組OD值-空白對照組OD值）×100%。

1.4 實驗處理及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 將LNCaP細(xì)胞分三組，即Control組、DHT處理組、DHT和靈芝孢子油共同處理組（DHT+Oil）。將對數(shù)期生長的LNCaP細(xì)胞按合適的密度和上述分組分別接種于24孔板或6孔板中，過夜后：（1）按上述處理組分別加入Control組（DMSO）、DHT（10 nM）、DHT（10 nM）+Oil（20 μg/mL），24 h后CCK-8檢測細(xì)胞增殖活性，Western blot檢測蛋白表達(dá)；（2）分別熒光素酶報告質(zhì)粒pMMTV-luc及海腎熒光素酶報告質(zhì)粒pRL-SV40轉(zhuǎn)染上述三組細(xì)胞，12 h后分別加入Control組（DMSO）、DHT（10 nM）、DHT（10 nM）+Oil（20μg/mL）處理24 h，收集細(xì)胞裂解液進(jìn)行雙螢光素酶報告基因活性檢測。

1.5 Western blot 收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液于冰上裂解30 min，于4 ℃ 12 000 r/min離心20 min，取上清Bradford法測定蛋白濃度。取等量的蛋白進(jìn)行SDSPAGE電泳并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入多克隆抗體，4 ℃過夜。將膜移至HRP標(biāo)記的二抗（1∶2000）中，室溫孵育1 h。膜置于化學(xué)發(fā)光液中，曝光、顯影及定影。

1.6 熒光素酶報告質(zhì)粒pMMTV-AR轉(zhuǎn)錄活性檢測 參照Promega的Dual-Luciferase雙螢光素酶報告基因檢測系統(tǒng)的說明書分別測定熒光素酶報告質(zhì)粒pMMTV-luc和海腎熒光素酶報告質(zhì)粒pRL-SV40的熒光素酶活性，以兩者的相對比值作為熒光素酶相對活性單位（Relative luciferase unit，RLU）。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 條圖的制作和統(tǒng)計均使用Graphpad Prism 5.0軟件，比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 靈芝孢子油降低DHT誘導(dǎo)的LNCaP細(xì)胞的增殖和存活 為了探討靈芝孢子油對雄激素依賴的前列腺癌LNCaP細(xì)胞生長的抑制作用，筆者檢測了DHT刺激作用下，有無靈芝孢子油處理對前列腺癌LNCaP細(xì)胞生長的影響，結(jié)果如圖1所示，CCK-8檢測腫瘤細(xì)胞增殖活性表明，二氫睪酮（DHT，10 nM）刺激作用下明顯增加LNCaP細(xì)胞的增殖活性，而靈芝孢子油處理（20 μg/mL）則明顯降低DHT刺激的LNCaP細(xì)胞的增殖活性，與DHT組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。

圖1 靈芝孢子油降低DHT刺激的LNCaP細(xì)胞的增殖活性*與DHT組比較，P<0.01

2.2 靈芝孢子油降低DHT誘導(dǎo)的 LNCaP細(xì)胞中AR的磷酸化激活 雄激素受體（Androgen receptor，AR）的激活是DHT誘導(dǎo)的LNCaP細(xì)胞增殖及下游靶基因表達(dá)的關(guān)鍵。為了明確靈芝孢子油是否抑制DHT誘導(dǎo)的AR的磷酸化激活，筆者同樣檢測了DHT刺激作用下，有無靈芝孢子油處理對前列腺癌LNCaP細(xì)胞AR的表達(dá)及磷酸化活性的影響，結(jié)果表明：DHT刺激明顯增加雄激素受體（AR）的磷酸化活性，而同時靈芝孢子油處理則明顯降低DHT誘導(dǎo)的AR磷酸化激活，而對AR的表達(dá)水平無影響，提示靈芝孢子油可能是通過抑制AR的磷酸化而抑制前列腺癌LNCaP細(xì)胞的增殖，見圖2。

2.3 靈芝孢子油降低DHT刺激的LNCaP細(xì)胞中蛋白激酶D的磷酸化激活 為了探討靈芝孢子油是否抑制DHT誘導(dǎo)的前列腺癌細(xì)胞中蛋白激酶D（Protein kinase D，PKD）的磷酸化活性，筆者也檢測了有無靈芝孢子油處理作用下對PKD磷酸化活性的影響，與AR作用相似，DHT刺激明顯增加PKD（ser744/748）的磷酸化活性，而靈芝孢子油處理則明顯降低DHT誘導(dǎo)PKD（ser744/748）的磷酸化活性，對PKD的蛋白表達(dá)水平無影響，見圖3。

圖2 靈芝孢子油降低DHT誘導(dǎo)的雄激素受體（AR）

圖3 靈芝孢子油降低DHT誘導(dǎo)的PKD（ser744/748）的磷酸化活性

2.4 靈芝孢子油抑制DHT誘導(dǎo)的LNCaP細(xì)胞中AR的轉(zhuǎn)錄活性 由于靈芝孢子油明顯降低前列腺癌LNCaP細(xì)胞中DHT誘導(dǎo)的AR磷酸化激活，而對AR的表達(dá)水平無影響，進(jìn)而筆者利用熒光素酶報告基因檢測了靈芝孢子油是否抑制DHT誘導(dǎo)的LNCaP細(xì)胞中AR的轉(zhuǎn)錄激活。如圖4所示，DHT刺激可增強LNCaP細(xì)胞中AR的轉(zhuǎn)錄活性，而靈芝孢子油則明顯抑制DHT誘導(dǎo)的LNCaP細(xì)胞中AR的轉(zhuǎn)錄激活活性，與DHT組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。

圖4 靈芝孢子油抑制DHT誘導(dǎo)的LNCaP細(xì)胞中AR的轉(zhuǎn)錄激活活性*與DHT組比較，P<0.01

3 討論

前列腺癌是老齡男性最常見的非皮膚癌惡性腫瘤，在美國位居男性腫瘤死亡的第二位，而在我國其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。雄激素受體（AR）的激活是前列腺癌由雄激素依賴性轉(zhuǎn)變?yōu)樾奂に胤且蕾囆匝葸M(jìn)過程的關(guān)鍵。雄激素受體是由配體激活的一種轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)無配體結(jié)合時，AR在胞質(zhì)內(nèi)與熱休克蛋白相結(jié)合并呈無活性狀態(tài)，當(dāng)雄激素受體與雙氫睪酮（DHT）結(jié)合，則與熱休克蛋白解離，繼而進(jìn)入胞核內(nèi)與靶基因啟動子區(qū)雄激素反應(yīng)元件（androgen response element，ARE）結(jié)合，調(diào)節(jié)與細(xì)胞生長、增殖相關(guān)的靶基因表達(dá)[12-16]。本研究初步探討了靈芝孢子油對雄激素依賴性前列腺癌LNCaP細(xì)胞中DHT誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖、雄激素受體的激活及轉(zhuǎn)錄活性的影響，結(jié)果顯示：靈芝孢子油不僅降低DHT刺激的LNCaP細(xì)胞的增殖活性而且抑制DHT誘導(dǎo)的前列腺癌LNCaP細(xì)胞中AR和蛋白激酶D的磷酸化活性，而對其本底蛋白的表達(dá)水平無影響。此外，熒光素酶報告基因活性檢測進(jìn)一步表明靈芝孢子油則明顯抑制DHT誘導(dǎo)的LNCaP細(xì)胞中AR的轉(zhuǎn)錄激活活性。

已有的研究表明，靈芝孢子油具有提高免疫、抗病毒、降血脂以及抗炎和清除自由基等功效[1]。有關(guān)靈芝孢子油在抗腫瘤中的功能作用備受人們的關(guān)注，其可能的機(jī)制包括：激活凋亡效應(yīng)蛋白Caspase3誘導(dǎo)凋亡，下調(diào)miR-21而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤的血管生成等[6-10]。筆者在前列腺癌雄激素依賴的LNCaP細(xì)胞中研究顯示靈芝孢子油降低DHT誘導(dǎo)的LNCaP細(xì)胞的增殖活性、雄激素受體的激活和其轉(zhuǎn)錄活性，提示在前列腺癌中靈芝孢子油可能通過調(diào)節(jié)AR的激活和轉(zhuǎn)錄活性而抑制前列腺癌細(xì)胞的生長。

雄激素受體（AR）不僅受DHT誘導(dǎo)激活，而且還受到細(xì)胞內(nèi)自分泌生長因子或相關(guān)的信號通路的異常激活，AR的激活在前列腺癌發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[16]。近年研究顯示，在雄激素依賴的前列腺癌細(xì)胞LNCaP中蛋白激酶（PKD1）過表達(dá)，DHT刺激可促使PKD1與AR直接結(jié)合于PSA（prostate specific antigen，前列腺特異性抗原）的啟動子區(qū)[17]。本研究顯示，靈芝孢子油降低了DHT誘導(dǎo)的前列腺癌LNCaP細(xì)胞中AR和蛋白激酶D的磷酸化活性，而對其本底蛋白的表達(dá)水平無影響，提示靈芝孢子油可能通過抑制蛋白激酶D的磷酸化而抑制AR的激活，進(jìn)而抑制AR相關(guān)靶基因的表達(dá)，但是，靈芝孢子油是否通過抑制蛋白激酶D的磷酸化而抑制AR的核內(nèi)轉(zhuǎn)位以及抑制AR哪些靶基因的表達(dá)還有待進(jìn)一步研究。

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