王杉杉，馬韻升，姚 剛，劉圣鵬，虞鳳慧，魏 征*

（1.黃河三角洲京博化工研究院有限公司，山東 濱州 256500；2.山東京博控股股份有限公司，山東 濱州 256500）

枸杞（Lycium barbarum）子為茄科植物枸杞的干燥成熟果實[1]，能滋補肝腎、益精明目，用于腰膝酸痛、眩暈耳鳴[2]。枸杞的營養(yǎng)價值很高，關(guān)于其營養(yǎng)成分的報道[2-3]也很多，枸杞多糖（Lycium barbarumpolysaccharide，LBP）是枸杞中的主要活性成分之一，是一種水溶性蛋白多糖，已經(jīng)被研究證實具有提高免疫力、抗癌、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、降血脂、抗脂肪肝等功效[4-8]，具有很好的發(fā)展前景。

目前，枸杞多糖的提取主要采用熱水浸提法，該方法比較簡單，易于操作，但提取效率低，且較高的溫度容易破壞多糖結(jié)構(gòu)，降低其生物活性[9]。酶法可以分解植物細胞壁及細胞膜的成分，從而促進胞內(nèi)有效成分的溶出[10-12]；超聲輔助浸提則可利用超聲波的空化效應(yīng)及機械剪切作用來破壞細胞壁結(jié)構(gòu)，同時強化傳質(zhì)，以達到提高有效成分收率的目的[13-14]。這兩種方法因其提取條件溫和、提取效率高、提取時間短及綠色環(huán)保等優(yōu)勢受到越來越多的關(guān)注。如果將二者結(jié)合，一方面可利用超聲增強復(fù)合酶的活性，提高其破壁效率；另一方面可通過超聲強化傳質(zhì)過程，促進多糖溶解，有效縮短浸提時間，提高多糖得率[15-18]。

本試驗采用超聲波輔助復(fù)合酶法對枸杞多糖提取工藝進行研究，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用正交設(shè)計對枸杞多糖的料液比、提取溫度、超聲時間、復(fù)合酶添加量進行優(yōu)化，旨在獲得一個得率高、品質(zhì)好的枸杞多糖提取條件，從而為枸杞多糖的工業(yè)生產(chǎn)、開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞：寧夏；脂肪酶（200000U/g）、果膠酶（200000U/g）：蘇柯漢濰坊生物工程有限公司；蛋白酶（200 000 U/g）：南寧龐博生物工程有限公司；纖維素酶（20 000 U/g）：實驗室自制（畢赤酵母工程菌發(fā)酵）；無水乙醇、葡萄糖、苯酚、硫酸（分析純）：萊陽經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)區(qū)精細化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

DL-6M大型低速離心機：長沙湘儀離心機科技有限公司；752N-紫外可見分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；FD-1A-50型冷凍干燥機：北京博醫(yī)康有限公司；KQ-250B超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；HH-1型數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市融化儀器制造有限公司；JJ-1精密增力電動攪拌器：上海浦東物理光學(xué)儀器銷售部。

1.3 實驗方法

1.3.1 枸杞多糖提取工藝流程

枸杞粉末→乙醇脫脂→超聲波輔助復(fù)合酶浸提→沸水浴滅酶→離心→Sevage法除蛋白→濃縮→冷凍干燥→枸杞多糖粗品

1.3.2 枸杞多糖提取操作要點

緩沖溶液的配制：分別配制0.1 mol/L的檸檬酸及檸檬酸鈉溶液，并按比例配成pH 4.6的緩沖溶液。

復(fù)合酶液配制：稱取等質(zhì)量的脂肪酶、蛋白酶、纖維素酶和果膠酶，加入10倍體積的緩沖溶液，40 ℃水浴活化20 min。

將枸杞置于陰涼處，自然晾干，將其粉碎。精確稱取粉碎的枸杞粉末30 g，加入10倍體積分數(shù)80%的乙醇，于80 ℃水浴脫脂1 h，冷卻、離心、收集濾餅備用。按照不同的料液比、提取溫度、提取時間、復(fù)合酶（脂肪酶/蛋白酶/纖維素酶/果膠酶1∶1∶1∶1）添加量設(shè)計試驗，在180 W超聲功率條件下進行超聲波輔助復(fù)合酶提取，沸水浴滅酶10 min，在4 000 r/min條件下離心10 min，過濾，Sevage法除蛋白，上清液進行減壓濃縮至原體積的1/5，冷凍干燥得到枸杞多糖粗品。

1.3.3 葡萄糖標準曲線的繪制

葡萄糖標準溶液的配制：準確稱取在105 ℃干燥至質(zhì)量恒定的葡萄糖標準品0.100 0 g，置于50 mL燒杯中加蒸餾水溶解，并全部轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，稀釋至刻度，另取10 mL該溶液于100 mL容量瓶中，稀釋至刻度，配成質(zhì)量濃度0.1 mg/mL的葡萄糖標準溶液。

葡萄糖標準曲線的繪制：精密吸取0.1 mg/mL的葡萄糖標準使用液0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL，分別置于25 mL比色管中，準確補充水至2.0 mL，加入5%苯酚溶液1.0 mL，在旋轉(zhuǎn)混勻器上混勻，小心加入濃硫酸5.0 mL，在旋轉(zhuǎn)均勻器上小心混勻，冷卻后，用分光光度計在波長490 nm處，以試劑空白溶液為參比，1 cm比色皿測吸光度值，制得標準曲線。

1.3.4 樣品多糖含量測定

取干燥枸杞多糖供試品，按實際實驗結(jié)果，將其稀釋至合適倍數(shù)，精確吸取待測液2 mL置于25 mL比色管，按照方法1.3.3顯色，用分光光度計在波長490 nm處測定吸光度值。從標準曲線回歸方程計算葡萄糖的質(zhì)量，計算樣品中多糖含量。多糖含量的計算公式如下：

式中：C為供試液中葡萄糖的質(zhì)量濃度，μg/mL；D為樣品液的稀釋因素：F為換算因子；m為樣品的質(zhì)量，g。

1.3.5 多糖得率的計算

枸杞多糖的得率計算公式如下：

式中：Y為枸杞多糖得率，%；m1為枸杞多糖質(zhì)量，g；m0為粗多糖質(zhì)量，g。

1.3.6 單因素試驗設(shè)計

料液比的確定：分別設(shè)定料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g∶mL），在超聲功率180 W，提取溫度為55 ℃，復(fù)合酶添加量0.2%條件下提取40 min，考察不同料液比對多糖得率的影響。

提取溫度的確定：分別設(shè)定提取溫度為35 ℃、45 ℃、55 ℃、65 ℃、75 ℃，在超聲功率180 W，料液比為1∶40（g∶mL），復(fù)合酶添加量0.2%條件下提取40 min，考察不同提取溫度對多糖得率的影響。

超聲時間的確定：分別設(shè)定提取時間為30 min、40 min、50 min、60 min、70 min，在超聲功率180 W，料液比為1∶40（g∶mL），提取溫度為55 ℃，復(fù)合酶添加量0.2%條件下提取，考察不同超聲時間對多糖得率的影響。

復(fù)合酶添加量：分別設(shè)定復(fù)合酶（脂肪酶/蛋白酶/纖維素酶/果膠酶1∶1∶1∶1）添加量為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%，在超聲功率180 W，料液比為1∶40（g∶mL），提取溫度為55 ℃條件下提取50 min，考察不同復(fù)合酶添加量對多糖得率的影響。

1.3.7 正交試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取料液比（A）、超聲時間（B）、提取溫度（C）和復(fù)合酶添加量（D）4個因素，進行L9（34）正交試驗，以枸杞多糖得率為評價指標，最終確定枸杞多糖提取的最優(yōu)工藝條件。正交試驗設(shè)計因素與水平見表1。

表1 枸杞多糖提取條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for polysaccharide from Lycium barbarum extraction conditions optimization

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線

采用硫酸-苯酚法測定不同質(zhì)量的葡萄糖在波長490 nm處的吸光度值，以葡萄糖含量（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制出葡萄糖標準曲線，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，在葡萄糖含量0～0.12 mg范圍內(nèi)，標準曲線線性回歸方程為y=8.002 1x-0.015 5，擬合系數(shù)R2=0.998 1，表明葡萄糖含量與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose

2.2 各單因素對枸杞多糖提取效果的影響

2.2.1 料液比對提取效果的影響

不同料液比條件下的枸杞多糖得率結(jié)果如圖2所示。

圖2 料液比對枸杞多糖得率的影響Fig.2 Effect of solid liquid ratio on the yield of polysaccharide from Lycium barbarum

從圖2可以看出，當(dāng)料液比＜1∶40（g∶mL）時，枸杞多糖得率隨著料液比的升高而升高，可能是當(dāng)料液比較低時，溶液黏稠度較大，超聲波處理時，不易形成空化現(xiàn)象；當(dāng)料液比為1∶40（g∶mL）時，枸杞多糖得率達到31.132%；之后隨著料液比的升高反而會使枸杞多糖得率降低，可能是隨著溶劑用量的增大，溶液中底物與酶的質(zhì)量濃度也隨之下降，有效反應(yīng)碰撞減少。因此，選擇料液比1∶40（g∶mL）最佳。

2.2.2 提取溫度對提取效果的影響

不同提取溫度條件下的枸杞多糖得率結(jié)果如圖3所示。

從圖3可以看出，枸杞多糖得率隨著溫度的升高而升高；當(dāng)溫度為55 ℃時，枸杞多糖得率達到42.621%；之后隨著溫度繼續(xù)升高，枸杞多糖得率顯著降低。溫度影響酶的活性，適當(dāng)?shù)纳邷囟瓤梢蕴岣呙傅幕钚?，提高枸杞多糖得率，但?dāng)溫度過高時，酶結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，活性急速下降，而使枸杞多糖得率降低。因此，選擇提取溫度為55 ℃最佳。

圖3 溫度對枸杞多糖得率的影響Fig.3 Effect of temperature on the yield of polysaccharide from Lycium barbarum

2.2.3 超聲時間對提取效果的影響

不同超聲時間條件下的枸杞多糖得率結(jié)果如圖4所示。

圖4 超聲時間對枸杞多糖得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic treatment time on the yield of polysaccharide from Lycium barbarum

從圖4可以看出，超聲時間＜50 min時，枸杞多糖隨著超聲時間的延長而增大；超聲時間為50 min時，枸杞多糖得率39.742%；當(dāng)＞50 min時，枸杞多糖得率反而下降，可能因為超聲時間較長，超聲波提供的能量過高，此條件下多糖結(jié)構(gòu)遭到破壞，得率降低。因此，選擇超聲時間為50 min。

2.2.4 復(fù)合酶添加量對提取效果的影響

不同復(fù)合酶添加量條件下的枸杞多糖得率結(jié)果如圖5所示。

圖5 復(fù)合酶添加量對枸杞多糖得率的影響Fig.5 Effect of compound enzymes addition on the yield of polysaccharide from Lycium barbarum

由圖5可以看出，枸杞多糖得率隨著酶添加量的增加而增大；當(dāng)酶添加量為0.6%時，枸杞多糖得率達到45.362%；當(dāng)酶添加量＞0.6%時，隨著酶添加量的增大而變得緩慢，可能因為此時酶用量在底物質(zhì)量濃度一定時達到飽和。因此，選擇復(fù)合酶添加量為0.6%。

2.3 提取枸杞多糖的最佳工藝確定

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以多糖得率為評價指標，對料液比、浸提時間、提取溫度、復(fù)合酶添加量進行L9（34）正交試驗，試驗結(jié)果與分析見表2，方差分析見表3。

表2 枸杞多糖提取條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for polysaccharide from Lycium barbarum extraction conditions optimization

表3 正交實驗結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2可知，各因素影響枸杞多糖得率得主次關(guān)系順序為提取溫度（B）＞料液比（A）＞復(fù)合酶添加量（D）＞超聲時間（C）。最佳工藝條件為A2B1C2D1，即料液比為1∶40（g∶mL），提取溫度50 ℃，超聲時間50 min，復(fù)合酶添加量0.5%。并在此最優(yōu)提取條件下進行驗證試驗，枸杞多糖得率達到58.910%，高于正交試驗表中最大多糖得率52.372%，故可以認為該組合為超聲波輔助熱水浸提法提取枸杞多糖的最佳提取工藝。由表3可知，各因素對結(jié)果影響均不顯著。

3 結(jié)論

單因素試驗結(jié)果表明，寧夏枸杞多糖的提取受料液比，提取溫度，超聲時間，復(fù)合酶添加量4個因素影響較大，且各因素水平數(shù)據(jù)之間存在一定的梯度差。正交試驗結(jié)果表明，枸杞多糖最佳提取工藝條件為料液比1∶40（g∶mL），浸提溫度50 ℃，超聲時間50 min，復(fù)合酶添加量0.5%。在此最佳條件下，枸杞多糖平均得率為58.910%。

利用超聲輔助復(fù)合酶法提取枸杞多糖具有節(jié)約時間、能耗低、提取效率高等優(yōu)點，可為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)枸杞多糖提供理論依據(jù)。

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