郭 芳，方 婷，林 杰，陳錦權(quán)

（1.呂梁學(xué)院 生命科學(xué)系，山西 呂梁 033000；2.福建農(nóng)林大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002）

鮑魚（abalone）是海洋軟體單殼貝類，屬原始腹足目、鮑科[1-2]。其營養(yǎng)價(jià)值極高，富含多種生物活性因子[3]。眾多研究表明，鮑魚的內(nèi)臟中存在具有消炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、抗應(yīng)激等功效的物質(zhì)[4-8]。水解動(dòng)物蛋白（hydrolyzed animal protein，HAP）是指蛋白質(zhì)經(jīng)過生物催化等方法處理而得到的產(chǎn)物。HAP富含人體必需氨基酸，營養(yǎng)高，性能優(yōu)，不含膽固醇，因蛋白含量高（其中多為小分子多肽，易溶于水）且人體的吸收利用率高等特點(diǎn)而被評(píng)為優(yōu)質(zhì)的蛋白源[9]。

工業(yè)上主要通過酸法、堿法和酶法等工藝生產(chǎn)HAP。相關(guān)研究表明，對(duì)不同的動(dòng)物蛋白原材料，采用不同種類的水解蛋白酶，調(diào)整加酶量及其他相關(guān)酶解參數(shù)，可以生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)的HAP[10]。

鮑魚內(nèi)臟中富含蛋白質(zhì)，但是隨著鮑魚養(yǎng)殖業(yè)、加工業(yè)的迅速發(fā)展，大量的鮑魚臟器被當(dāng)作加工廢棄物而堆積起來，極容易變質(zhì)腐爛，造成了經(jīng)濟(jì)損失的同時(shí)也會(huì)引來環(huán)境污染的問題。因此本試驗(yàn)以鮑魚內(nèi)臟為原料，采用胰蛋白酶對(duì)提取內(nèi)臟中蛋白質(zhì)的反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，旨為鮑魚臟器蛋白資源的綜合利用提供理論和試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮑魚內(nèi)臟：漳州歐圣食品有限公司；胰蛋白酶（4 000 U/g）：南寧東恒華道生物科技責(zé)任有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

L-550臺(tái)式低速離心機(jī)：長沙湘儀離心機(jī)有限公司；DHO-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥機(jī)：上海精密試驗(yàn)設(shè)備有限公司；FA1004電子天平：上海精天電子儀器有限公司；PHSJ-SF實(shí)驗(yàn)室PH計(jì)：上海精科有限公司；UV6300PC紫外可見光分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；ATN-300 全自動(dòng)定氮儀：上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酶法提取工藝[11]

凍藏鮑魚內(nèi)臟解凍→打漿→過膠體磨→過高壓脈沖電場(chǎng)→酒精脫色→鮑魚內(nèi)臟預(yù)處理液→加水勻漿→調(diào)整pH值→酶解→加熱滅酶（沸水浴10 min）→冷卻離心（4 000 r/min、20 min）→鮑魚內(nèi)臟酶解液

1.3.2 鮑魚內(nèi)臟蛋白質(zhì)分離提取的單因素試驗(yàn)

以總氨基酸態(tài)氮含量為指標(biāo)，分別考察料液比、pH值、酶解溫度、提取時(shí)間、酶量等條件對(duì)鮑魚內(nèi)臟蛋白提取效果的影響。

1.3.3 鮑魚內(nèi)臟蛋白質(zhì)分離提取的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析法，探討pH值、酶用量、溫度、料液比及其交互作用對(duì)提取效果的影響，并建立提取率和各影響因素間的數(shù)學(xué)模型，試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 鮑魚內(nèi)臟蛋白質(zhì)分離提取響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface design for abalone visceral protein extraction optimization

1.3.4 測(cè)定方法

蛋白質(zhì)水解度（degree of hydrolysis，DH）：按照參考文獻(xiàn)[12]的方法測(cè)定；總氨基酸態(tài)氮含量：按照參考文獻(xiàn)[13]的方法測(cè)定；蛋白質(zhì)含量：按照參考文獻(xiàn)[14]的方法測(cè)定；氮回收率按照參考文獻(xiàn)[15]的方法計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素變化對(duì)鮑魚內(nèi)臟蛋白質(zhì)提取效果的影響

2.1.1 料液比對(duì)鮑魚內(nèi)臟蛋白質(zhì)提取效果的影晌

在胰蛋白酶添加量為0.15%，溫度為55 ℃，pH值為7.0，時(shí)間為4 h的條件下，配制不同料液比，分別進(jìn)行蛋白提取試驗(yàn)，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，總氨基酸態(tài)氮含量隨料液比的增加呈下降趨勢(shì)，料液比為1∶4（g∶mL）時(shí)，總氨基酸態(tài)氮含量最大，隨著料液比的增大，提取液總氨基酸態(tài)氮含量急劇下降。當(dāng)料液比＞1∶4（g∶mL）以后，減小的速率逐漸變小，最后趨于穩(wěn)定。但在實(shí)際操作中過高濃度的待酶解液會(huì)稀釋所得的蛋白提取液的濃度，不利于后續(xù)的純化操作[16]，所以料液比選為1∶4（g∶mL）。

2.1.2 pH值對(duì)鮑魚內(nèi)臟蛋白質(zhì)提取效果的影響

在胰蛋白酶添加量為0.15%，溫度為55 ℃，料液比為1∶4（g∶mL），時(shí)間為4 h的條件下，分別在不同pH值條件下進(jìn)行蛋白提取試驗(yàn)，結(jié)果見圖2。

圖2 p H值對(duì)鮑魚內(nèi)臟蛋白質(zhì)提取效果的影響Fig.2 Effect of pH on extraction yield of abalone visceral protein

由圖2可知，鮑魚內(nèi)臟中蛋白質(zhì)提取率的波動(dòng)程度受pH的影響比較大。pH值在5～7的范圍內(nèi)，總氨基酸態(tài)氮含量隨著pH的增大而增大，pH＞7時(shí)，總氨基酸態(tài)氮含量呈下降的趨勢(shì)。當(dāng)pH值為7時(shí)，總氨基酸態(tài)氮含量最高而且條件最溫和，有利于蛋白質(zhì)活性的保存，所以選擇最適pH值為7。

2.1.3 酶解溫度對(duì)鮑魚內(nèi)臟蛋白質(zhì)提取效果的影響

在胰蛋白酶添加量為0.15%，pH值為7.0，料液比為1∶4（g∶mL），時(shí)間為4 h的條件下，分別在不同溫度條件下進(jìn)行蛋白提取試驗(yàn)，結(jié)果見圖3。

圖3 提取溫度對(duì)鮑魚內(nèi)臟蛋白質(zhì)提取效果的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction yield of abalone visceral protein

酶的催化條件具有特異性，不同的酶在特定的溫度范圍內(nèi)才能發(fā)揮最大的催化作用。因此，適度提高溫度可提升酶的催化活力；但酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，高溫會(huì)使蛋白質(zhì)變性，同樣影響酶法提取反應(yīng)。由圖3可知，在酶解溫度為30～50 ℃的范圍內(nèi)，總氨基酸態(tài)氮含量隨溫度升高而升高；酶解溫度為50 ℃時(shí)，總氨基酸態(tài)氮含量達(dá)到最高值；酶解溫度高于50 ℃后，總氨基酸態(tài)氮含量隨溫度的升高而逐漸下降。因此選擇最適的酶解溫度50 ℃。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)鮑魚內(nèi)臟蛋白質(zhì)提取效果的影響

在胰蛋白酶添加量為0.15%，pH值為7.0，酶解溫度為55 ℃，料液比為1∶4（g∶mL）的條件下，分別在不同提取時(shí)間下進(jìn)行蛋白提取試驗(yàn)，結(jié)果見圖4。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)鮑魚內(nèi)臟蛋白質(zhì)提取效果的影響Fig.4 Effect of enzymolysis time on extraction yield of abalone visceral protein

由圖4可知，在1～4 h范圍內(nèi)，提取時(shí)間越長，總氨基酸態(tài)氮含量越高，但增長速率在3 h后逐漸降低，提取時(shí)間4 h時(shí)總氨基酸態(tài)氮含量達(dá)到最大，＞4 h之后提取率呈現(xiàn)急劇降低的趨勢(shì)，這可能是由于提取時(shí)間過長引起了蛋白質(zhì)的過度降解[17]。4 h以后胰蛋白酶的酶解作用已經(jīng)達(dá)到充分狀態(tài)，繼續(xù)延長時(shí)間反而引起鮑魚內(nèi)臟中其他物質(zhì)分解影響蛋白質(zhì)的浸出，所以認(rèn)為較為適宜的提了以時(shí)間是4 h。

2.1.5 酶用量對(duì)鮑魚內(nèi)臟蛋白質(zhì)提取效果的影響

在料液比為1∶4（g∶mL）時(shí)，酶解溫度為55 ℃，pH值為7，經(jīng)4 h 酶解的條件下，測(cè)定不同胰蛋白酶用量對(duì)總氨基酸態(tài)氮含量（Y）的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 酶用量對(duì)鮑魚內(nèi)臟蛋白質(zhì)提取效果的影響Fig.5 Effect of enzyme addition on extraction yield of abalone visceral protein

由圖5可知，胰蛋白酶用量為0.1%～0.2%范圍內(nèi)，隨著酶用量的增加，總氨基酸態(tài)氮含量快速增加；超過0.2%后，酶用量再增加時(shí)，總氨基酸態(tài)氮含量變化不明顯，所以確定最佳酶用量為0.2%。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.3.1 試驗(yàn)結(jié)果與分析

試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和結(jié)果見表2。

表2 鮑魚內(nèi)臟蛋白質(zhì)分離提取響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of response surface experiment for abalone visceral protein extraction optimization

2.3.2 模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

響應(yīng)數(shù)據(jù)的方差分析結(jié)果見表3，其中F模型=31.09，對(duì)應(yīng)P＜0.01，表明回歸模型極其顯著。失擬項(xiàng)F=1.31，對(duì)應(yīng)P＞0.05，不顯著，表明此模型擬合較好。

表3 顯著性檢驗(yàn)結(jié)果Table 3 Significant analysis results of the model

利用Design Expert軟件，獲得擬合后的鮑魚內(nèi)臟蛋白總氨基酸態(tài)氮含量對(duì)編碼自變量酶解時(shí)間、酶解溫度、料液比、酶用量的二次多項(xiàng)回歸方程：

2.3.3 鮑魚內(nèi)臟蛋白質(zhì)最佳提取工藝條件

根據(jù)二次回歸數(shù)學(xué)模型進(jìn)行優(yōu)化，獲得最優(yōu)鮑魚內(nèi)臟蛋白提取工藝參數(shù)為酶添加量0.15%，提取時(shí)間為4 h，料液比為1∶4（g∶mL），酶解溫度為54.88 ℃，pH值為7.08，此時(shí)的鮑魚內(nèi)臟酶解液總氨基酸態(tài)氮含量為165 mg/100 mL。為方便試驗(yàn)，優(yōu)化工藝參數(shù)為酶添加量0.15%，提取時(shí)間為4 h，料液比為1∶4（g∶mL），酶解溫度為55 ℃，pH值為7。此時(shí)測(cè)得鮑魚內(nèi)臟酶解液總氨基酸態(tài)氮含量為163 mg/100 mL，蛋白質(zhì)含量為1.478 g/100 g，說明該模型可行。此條件下水解度為51.9%，氮回收率為38.1%。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面回歸分析法對(duì)酶法提取鮑魚內(nèi)臟蛋白質(zhì)的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化?？疾炝藀H值、酶解溫度、胰蛋白酶添加量和提取時(shí)間4個(gè)因素對(duì)提取工藝的影響，通過分析可以發(fā)現(xiàn)，溫度是顯著性的因素，并確定了酶法提取鮑魚內(nèi)臟蛋白質(zhì)的最佳提取工藝條件為pH值為7，酶解溫度為55 ℃，提取時(shí)間為4h，胰蛋白酶添加量0.15%，此條件下得到的酶解鮑魚內(nèi)臟酶解液總氨基酸態(tài)氮含量為163 mg/100 mL，蛋白質(zhì)的水解度為51.9%，氮回收率為38.1%，這對(duì)鮑魚內(nèi)臟蛋白質(zhì)資源的綜合利用能提供一定的試驗(yàn)依據(jù)。

圖6 各因素相互作用對(duì)總氨基酸態(tài)氮影響的響應(yīng)面和等高線Fig.6 Response surface plots and contour line of effects of interaction between solid liquid ratio,enzyme addition,pH and temperature on total amino nitrogen content

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