林 敏，宋 斌，黃 浩，李 挺，沈亞恒

（廣東省微生物研究所，省部共建華南應(yīng)用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州，510070）

〈栽培技術(shù)〉

分枝蟲(chóng)草液體培養(yǎng)基篩選及其菌絲成分分析*

林 敏，宋 斌**，黃 浩，李 挺，沈亞恒

（廣東省微生物研究所，省部共建華南應(yīng)用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州，510070）

以分枝蟲(chóng)草（Cordyceps ramosa）菌絲生物量作為指標(biāo)，研究不同碳源和氮源對(duì)分枝蟲(chóng)草液體培養(yǎng)的影響，采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)法篩選最佳液體培養(yǎng)基配方，并分析菌絲主要營(yíng)養(yǎng)成分。結(jié)果表明，分枝蟲(chóng)草液體培養(yǎng)基的最佳碳源為甘油，最佳氮源為硝酸鉀，最佳配方是：甘油35 g·L-1、硝酸鉀12 g·L-1、酵母浸膏12 g·L-1、麥芽浸出物10 g·L-1、H2O 1 L；其菌絲的粗蛋白、粗脂肪和總灰分含量分別為32．90%、1．20%和5．89%，其腺苷、多糖和蟲(chóng)草酸的含量分別為0．805%、5．89%和5．61%；含有17種氨基酸，總含量為23．97%；微量元素鐵、錳、銅、鋅和硒含量分別為76．70 mg·kg-1、5．10 mg·kg-1、3．70 mg·kg-1、33 mg·kg-1和0．176 mg·kg-1，重金屬鉛、砷、汞的含量均符合國(guó)家食用菌相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。分枝蟲(chóng)草的液體培養(yǎng)可作為分枝蟲(chóng)草開(kāi)發(fā)利用的重要途徑。

分枝蟲(chóng)草；液體培養(yǎng)基；正交試驗(yàn)；成分分析

中國(guó)蟲(chóng)草種類至今已報(bào)道的名稱已經(jīng)超過(guò)130種[1-2]。已開(kāi)發(fā)利用的有冬蟲(chóng)夏草（Cordyceps sinensis）、蟬花蟲(chóng)草 （C.sobolifera）、古尼蟲(chóng)草 （C. gunnii）、蛹蟲(chóng)草 （C.militaris）、廣東蟲(chóng)草 （C. guangdongensis） 等[3-7]。分枝蟲(chóng)草 [C.ramosa Teng= Elaphocordyceps ramosa (Teng)G.H.Sung,J.M.Sung &Spatafora]也稱分枝團(tuán)囊蟲(chóng)草、分枝鹿蟲(chóng)草、大團(tuán)囊枒，在分類上隸屬于子囊菌門(mén)（Ascomycota）糞殼菌綱（Sordariomycetes） 肉座菌目（Hypocreales） 線蟲(chóng)草科 （Ophiocordycipitaceae） 鹿蟲(chóng)草屬 （Elaphocordyceps）。分枝蟲(chóng)草在安徽、福建、甘肅和廣東等省區(qū)有分布，民間常用于治療婦科出血癥，包括崩漏、月經(jīng)過(guò)多、更年期子宮出血、產(chǎn)后惡露不絕和宮內(nèi)節(jié)育器所致子宮出血等，是具有藥用價(jià)值的中國(guó)特有真菌[8-9]。分枝蟲(chóng)草野生資源貧乏，難于滿足市場(chǎng)需求。林敏等[10-11]對(duì)分枝蟲(chóng)草的生物學(xué)特性、子實(shí)體生長(zhǎng)最適碳氮源和子實(shí)體主要成分的研究分析表明，分枝蟲(chóng)草具有商業(yè)應(yīng)用價(jià)值。本文對(duì)分枝蟲(chóng)草液體培養(yǎng)基的最適碳源、最適氮源和最佳配方進(jìn)行了篩選，并對(duì)其菌絲的主要成分進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

菌株GDIM_CR 4003605，由廣東省微生物研究所微生物資源中心提供，于4℃下保藏備用。

1.1.2 試驗(yàn)材料

可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、甘油、麥芽糖均為分析純，硝酸鉀、蛋白胨、麥芽浸出物、酵母浸膏、瓊脂為生化試劑，黃豆粉、馬鈴薯從市場(chǎng)上直接購(gòu)買(mǎi)。

1.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基

1.2.1 PDA斜面培養(yǎng)基與配制

PDA斜面培養(yǎng)基組成：馬鈴薯200 g、瓊脂粉20 g、葡萄糖20 g，水1 000 mL。取馬鈴薯洗凈去皮，稱取200 g切成小塊，加水煮沸30 min，用4層紗布過(guò)濾，濾液加入瓊脂粉20 g，煮沸溶解后加葡萄糖20 g，補(bǔ)水至1 000 mL，pH值自然，分裝10 mL到20 mm×200 mm的試管內(nèi)，于115℃滅菌20 min，排成斜面，冷卻至常溫后備用。

1.2.2 基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基及配制

基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基組成：碳源I（10 g·L-1）、氮源I（5 g·L-1）、酵母浸膏（3 g）、麥芽浸出物（3 g），水1 000 mL。取碳源I 10 g·L-1、氮源I 5 g·L-1、酵母浸膏3 g·L-1、麥芽浸出物3 g·L-1，補(bǔ)水至1 000 mL煮沸，用0.1 mol·L-1的HCl及0.2 mol·L-1的NaOH調(diào)pH至7.0，每個(gè)300 mL三角瓶分裝100 mL液體培養(yǎng)基，于115℃滅菌20 min，冷卻至常溫備用。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 液體培養(yǎng)與菌絲收集

將供試菌株取出，按常規(guī)方法接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，置于（25±1）℃下培養(yǎng)活化，待菌絲長(zhǎng)滿斜面后于4℃下保藏備用。取活化的斜面菌種，在無(wú)菌條件下每瓶接入約0.5 cm2大小的活化菌種8塊，置于（25±1）℃，120 r·min-1振蕩培養(yǎng)10 d即收集培養(yǎng)液。采用干質(zhì)量法，把收集的培養(yǎng)液，以轉(zhuǎn)速4 500 r·min-1，離心20 min，傾棄上清液，得到的沉淀即菌絲，置于（60±1）℃烘干至恒重，用分析天平稱量。取3次重復(fù)試驗(yàn)的均值即得菌絲生物量（干重，g·L-1）。

1.3.2 不同碳源對(duì)分枝蟲(chóng)草液體培養(yǎng)菌絲的影響

以蛋白胨5 g·L-1替代基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中的氮源I，以10 g·L-1的可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、甘油、麥芽糖分別替代基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中的碳源I，依1.2.2配制成5種不同的液體培養(yǎng)基，以基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中的碳源I空白作對(duì)照。每種培養(yǎng)基配方設(shè)3個(gè)重復(fù)。以菌絲生物量為指標(biāo)，研究不同碳源對(duì)分枝蟲(chóng)草液體培養(yǎng)菌絲生長(zhǎng)的影響。

1.3.3 不同氮源對(duì)分枝蟲(chóng)草液體培養(yǎng)菌絲的影響

以葡萄糖10 g·L-1替代基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中的碳源I，以5 g·L-1的硝酸鉀、蛋白胨、奶粉、黃豆粉分別替代基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中的氮源I，依1.2.2配制成4種不同的液體培養(yǎng)基，以基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中的氮源I空白作對(duì)照。每種培養(yǎng)基配方設(shè)3個(gè)重復(fù)。以菌絲生物量為指標(biāo)，研究不同氮源對(duì)分枝蟲(chóng)草液體培養(yǎng)菌絲生長(zhǎng)的影響。

1.3.4 液體培養(yǎng)基篩選的正交試驗(yàn)

以研究得到的最適碳、氮源、酵母浸膏、麥芽浸出物為因素，采用L9（34） 正交設(shè)計(jì)液體培養(yǎng)基（表1）。每組試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。以菌絲生物量為指標(biāo)，篩選最佳分枝蟲(chóng)草液體培養(yǎng)基配方。

1.3.5 液體培養(yǎng)菌絲的成分測(cè)定

采用最佳液體培養(yǎng)基配方獲得的菌絲，烘干至恒重，粉碎后過(guò)20目篩。粗蛋白含量參照GB/ T5009.5-2010/6.1第一法測(cè)定[12]；粗脂肪含量參照GB/T 5009.6-2003重量法 (第二法)測(cè)定[13]；總灰分含量參照GB 5009.4-2010重量法測(cè)定[14]；粗多糖、

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Tab．1 Levels and factors of the orthogonal experiment in this study

蟲(chóng)草酸、腺苷和蟲(chóng)草素均參照測(cè)馬鶯等測(cè)定[15]；氨基酸的含量參照GB/T18246-2000堿水解法進(jìn)行測(cè)定[16]。Fe、Mn參照GB/T5009．90－2003FAAS法進(jìn)行測(cè)定[17]；Cu參照GB/T5009．13－2003FAAS第一法進(jìn)行測(cè)定[18]；Zn參照GB/T5009．14－2003FAAS第一法進(jìn)行測(cè)定[19]；Se參照GB/T5009．93－2010第一法進(jìn)行測(cè)定[20]；Pb參照GB/T 5009．12-2010第一法GFAAS進(jìn)行測(cè)定[21]；Hg參照GB/T 5009．17-2003第二法CVAAS進(jìn)行測(cè)定[22]；As參照GB/T 5009．11-2003第一法HGAFS進(jìn)行測(cè)定[23]。

1．3．6 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 Excel 2003、SPSS17．0(SPSS Inc．，Chicago，IL)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對(duì)分枝蟲(chóng)草液體培養(yǎng)菌絲生長(zhǎng)的影響

不同碳源對(duì)分枝蟲(chóng)草液體培養(yǎng)菌絲生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖1。

圖1 不同碳源對(duì)分枝蟲(chóng)草液體培養(yǎng)菌絲生長(zhǎng)的影響Fig．1 Effect of carbon sources on mycelial growth of Cordyceps ramosa

由圖1可見(jiàn)，分枝蟲(chóng)草菌絲體在包括對(duì)照在內(nèi)的6種不同供試碳源液體培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng)，但不同碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響各有不同。以甘油作碳源時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度快，菌絲團(tuán)個(gè)大，生物量均值為1．278 g·d-1；其次以葡萄糖作為碳源時(shí)，菌絲生長(zhǎng)較快，生物量均值為1．159 g·d-1；而以麥芽糖作為碳源時(shí)，菌絲生長(zhǎng)較差，生物量均值為0．479 g·d-1；最差為對(duì)照組，生物量均值僅為0．443 g·d-1。分枝蟲(chóng)草在不同碳源液體培養(yǎng)基中菌絲生物量由多到少的順序依次是：甘油＞葡萄糖＞可溶性淀粉＞蔗糖＞麥芽糖＞對(duì)照。經(jīng)方差分析，顯示不同碳源對(duì)分枝蟲(chóng)草液體培養(yǎng)菌絲生物量的影響無(wú)顯著差異。

2.2 不同氮源對(duì)分枝蟲(chóng)草液體培養(yǎng)菌絲生長(zhǎng)的影響

不同氮源對(duì)分枝蟲(chóng)草液體培養(yǎng)菌絲生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖2。

圖2 不同氮源對(duì)分枝蟲(chóng)草液體培養(yǎng)菌絲生長(zhǎng)的影響Fig．2 Effect of nitrogen sources on mycelial growth of Cordyceps ramosa

由圖2可見(jiàn)，分枝蟲(chóng)草菌絲在5種不同供試氮源液體培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng)，但不同氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響各有不同。以硝酸鉀為氮源時(shí)，菌絲生長(zhǎng)最好，生長(zhǎng)速度最快，菌絲團(tuán)個(gè)大，生物量均值為1．216 g·d-1；其次以黃豆粉作為氮源時(shí)，菌絲生長(zhǎng)較好，菌絲團(tuán)個(gè)也大，生物量均值為1．201 g·d-1；奶粉作為氮源時(shí)菌絲團(tuán)個(gè)較小，生物量均值為0．676 g· d-1；而對(duì)照組則最差，菌絲團(tuán)個(gè)最小，生物量均值僅為0．618 g·d-1。分枝蟲(chóng)草在不同氮源液體培養(yǎng)基中菌絲生物量由多到少的順序依次是：硝酸鉀＞黃豆粉＞蛋白胨＞奶粉＞對(duì)照。經(jīng)方差分析表明，不同氮源對(duì)分枝蟲(chóng)草液體培養(yǎng)菌絲生物量的影響有顯著差異。

2.3 液體培養(yǎng)基篩選結(jié)果

以甘油、硝酸鉀、酵母浸膏、麥芽浸出物為四因素三水平的正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2結(jié)果表明，甘油35%（3水平），麥芽浸出物10%（2水平），硝酸鉀12%（2水平），酵母浸膏12%（3水平）時(shí)，菌絲生物量最高，最佳水平組合為A3B2C2D3。極差R值分析顯示，甘油（A）對(duì)分枝蟲(chóng)草菌絲生物量的影響最大，其次為酵母浸膏（D），再是麥芽浸出物（B），最差是硝酸鉀（C）。因此，分枝蟲(chóng)草液體培養(yǎng)基的最佳配方為：甘油35 g·L-1、硝酸鉀12 g·L-1、酵母浸膏12 g·L-1、麥芽浸出物10 g·L-1、H2O 1 L。

表2 分枝蟲(chóng)草液體培養(yǎng)基L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果（n=3)Tab．2 Result on the orthogonal test of L9（34） in the liquidculture medium of Cordyceps ramosa(n=3)

2.4 分枝蟲(chóng)草液體培養(yǎng)菌絲的成分分析

2．4．1 常見(jiàn)營(yíng)養(yǎng)活性成分

經(jīng)檢測(cè)，分枝蟲(chóng)草液體培養(yǎng)菌絲的粗蛋白、粗脂肪和總灰分含量分別為32．90%、1．20%和5．89%。腺苷含量為0．805%、粗多糖含量為5．89%、蟲(chóng)草酸含量為5．61%，蟲(chóng)草素的含量低于0．001%。

2．4．2 氨基酸組成與含量

分枝蟲(chóng)草菌絲氨基酸組成與含量情況見(jiàn)表3。

從表3可以看出，分枝蟲(chóng)草液體培養(yǎng)菌絲含有17種氨基酸，總含量為23．97%。其中必需氨基酸總含量達(dá)到7．82%。谷氨酸含量最高（2．86%），其次是脯氨酸（2．39%）。

2．4．3 微量元素含量

經(jīng)檢測(cè)，分枝蟲(chóng)草液體培養(yǎng)菌絲的微量元素含量情況見(jiàn)表4。

由表4可以看出，鐵、錳、銅和鋅的含量分別為76．70 mg·kg-1、5．10 mg·kg-1、3．70 mg·kg-1和33mg·kg-1；硒含量（0．176 mg·kg-1） 與子實(shí)體（0．046 mg·kg-1）相比[11]，要高出3倍，砷的含量低于0．50 mg·kg-1，而鉛、汞含量低于0．10 mg·kg-1。

表3 分枝蟲(chóng)草菌絲主要氨基酸組成與含量Tab．3 Composition and content of main amino acids in Cordyceps ramosa mycelium

表4 分枝蟲(chóng)草菌絲微量元素含量Tab．4 Microelement content in Cordyceps ramosa mycelium

3 小結(jié)

在本試驗(yàn)條件下，分枝蟲(chóng)草液體培養(yǎng)基的最佳碳源是甘油，最佳氮源是硝酸鉀。這與固體培養(yǎng)基的菌絲生長(zhǎng)情況不同[10]，但與子實(shí)體的需要情況類似[11]。研究獲得的最佳配方為：甘油35 g·L-1、硝酸鉀12 g·L-1、酵母浸膏12 g·L-1、麥芽浸出物10 g·L-1、H2O 1 L。

本研究結(jié)果表明，與分枝蟲(chóng)草子實(shí)體的粗蛋白（17．9%）、粗脂肪（1．02%）、灰分（2．50%）、多糖（0．01%）、蟲(chóng)草酸 （4．83%） 和氨基酸總含量（12．392%）等成分相比，分枝蟲(chóng)草菌絲的主要營(yíng)養(yǎng)成分含量均較高[11]；但其蟲(chóng)草酸含量遠(yuǎn)低于廣東蟲(chóng)草（46．3%）[25]，與蛹蟲(chóng)草（5%～7%）相近[26]；與冬蟲(chóng)夏草相比，成分基本相似，但分枝蟲(chóng)草腺苷的含量是冬蟲(chóng)夏草 （0．3755%） 的 2．1倍[27]，是廣東蟲(chóng)草（0．25%）的3．22倍[25]。重金屬鉛、砷、汞等的含量均符合國(guó)家食用菌標(biāo)準(zhǔn)的安全要求[28-30]。

因此，分枝蟲(chóng)草的液體培養(yǎng)可作為分枝蟲(chóng)草開(kāi)發(fā)利用的重要途徑，具有潛在的應(yīng)用前景，值得深入研究。

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書(shū)訊

《食用菌營(yíng)養(yǎng)與烹飪》由湖南省食用菌研究所與中國(guó)食用菌協(xié)會(huì)、中華全國(guó)供銷合作總社昆明食用菌研究所共同編寫(xiě)，主要包括毒菌類的識(shí)別方法、食用菌的選購(gòu)與貯藏、食用菌的營(yíng)養(yǎng)與保健作用、食用菌經(jīng)典菜式等內(nèi)容，重點(diǎn)介紹39種常見(jiàn)食用菌141個(gè)菜品的烹飪方法。烹飪方法結(jié)合了多地菜肴的特色，兼顧營(yíng)養(yǎng)、口味、地域及燒、蒸、煮等各種制作技巧的使用，菜式豐富、搭配合理。內(nèi)容詳實(shí)、圖片精美，實(shí)用性強(qiáng)。

本編輯部現(xiàn)有少量存書(shū)，欲購(gòu)者可直接匯款至中國(guó)食用菌雜志編輯部，本書(shū)售價(jià)30元，平郵加郵寄費(fèi)5元，掛號(hào)加郵寄費(fèi)10元，聯(lián)系電話0871-65151099。

《中國(guó)食用菌》編輯部

Optimization of the Liquid-Culture Medium of Cordyceps ramosa and Composition Analysis of Mycelium

LIN Min,SONG Bin,HUANG Hao,LI Ting,SHEN Ya-heng
(Guangdong Institute of Microbiology,Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application, State Key Laboratory of Applied Microbiology(Ministry-Guangdong Province Jointly Breeding Base),Guangdong Open Laboratory of Applied Microbiology,South China,Guangzhou 510070,China)

Effects of carbon and nitrogen sources on the optimization of liquid-culture medium for Cordyceps ramosa mycelial biomass,and the optimum liquid medium screening by the orthogonal design,and the main components of mycelium were analyzed．The results showed that the optimal carbon and nitrogen sources were glycerol and KNO3respectively,and the optimal medium were glycerol 35 g·L-1,KNO312 g·L-1,yeast extract fermentation 12 g·L-1,malt extract 10 g·L-1and H2O 1 L．The mycelium contained crude protein (32．9%),crude fat(1．2%)and ash (5．89%)．The contents of adenosine,polysaccharide, and cordycepic acid were 0．805%,5．89%and 5．61%．And 17 kinds of amino acids(23．97%)were detected from the mycelium．The microelement levels,such as Fe,Mn,Cu,Zn,Se,were 76．70 mg·kg-1,5．10 mg·kg-1,3．7 mg·kg-1,33 mg·kg-1and 0．176 mg·kg-1,respectively．Levels of the heavy metals,such as Pb,As and Hg,met the edible fungus safety standard levels specified by the Ministry of Health of the People’s Republic of China．The results could provide important way for the development and utilization of C.ramosa．

Cordyceps ramosa;liquid medium;orthogonal design;components analysis

S646.9

A

1003-8310（2015）06-0017-05

10．13629/j．cnki．53-1054．2015．06．004

廣東省科技項(xiàng)目（2011B020303003）；廣東省科技成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目（2012NL031）；廣州市科技項(xiàng)目（201300000031）；中國(guó)科學(xué)院微生物研究所真菌學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（SKLM 2013-2015）。

林敏（1983-），女，本科，助理研究員，主要從事真菌資源開(kāi)發(fā)利用研究。E-mail:397003483@qq．com

**通信作者：宋斌（1964-），男，本科，研究員，主要從事真菌資源多樣性研究。E-mail:ganoderma@vip．163．com

2015-08-30