王洪梅

（重慶市腫瘤研究所，重慶 400030）

人參皂苷Rb1對人白血病KG1a細(xì)胞增殖及凋亡抑制作用研究

王洪梅

（重慶市腫瘤研究所，重慶 400030）

目的 探討人參皂苷Rb1對人白血病細(xì)胞KG1a增殖及凋亡抑制作用的機(jī)制。方法 取對數(shù)生長期的KG1a細(xì)胞，空白對照組常規(guī)培養(yǎng)；人參皂苷單體 Rb1組分別加入 20，40，80，160 βmol／L的 Rb1。采用 CCK-8法檢測 KG1a細(xì)胞增殖抑制情況；流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡情況；Western Blot法檢測去乙?；?（HDAC3）及抗凋亡蛋白 Bcl-2，Caspase-3的表達(dá)情況。結(jié)果 人參皂苷 Rb1在體外對 KG1a細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用，在20～160 βmol／L濃度范圍內(nèi)抑制作用呈濃度依賴性，且在48 h時(shí)抑制最明顯；流式細(xì)胞術(shù)顯示，隨著處理藥物濃度的增加，ROS水平顯著增加（P＜0.05），KG1a細(xì)胞凋亡率顯著升高，其中早期凋亡細(xì)胞及晚期凋亡細(xì)胞百分比與0 βmol／L組相比，均有顯著性差異（P＜0.05）；Western Blot結(jié)果顯示，隨著藥物濃度增加，HDAC3的表達(dá)顯著降低（P＜0.05），而 Bcl-2，Caspase-3表達(dá)增加。結(jié)論 人參皂苷 Rb1可抑制 KGla細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能是通過下調(diào) HDAC3促進(jìn)KG1a細(xì)胞凋亡而實(shí)現(xiàn)。

人參皂苷Rb1；去乙?；?；凋亡

人參高效低毒，是傳統(tǒng)補(bǔ)氣要藥，其有效成分人參皂苷能靶向性作用于腫瘤細(xì)胞，但對正常細(xì)胞損傷小，是非常有潛力的一種抗腫瘤藥物。人參皂苷Rb1對卵巢癌、胃癌、肝癌和白血病等多種腫瘤細(xì)胞具有增殖抑制、誘導(dǎo)分化和凋亡的作用[1-3]。組蛋白去乙?；福℉DAC）的活性與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[4]。許多學(xué)者認(rèn)為，HDAC是治療腫瘤的潛在靶點(diǎn)，且已有研究證實(shí)HDAC3的表達(dá)與白血病細(xì)胞的分化和增殖狀態(tài)相關(guān)[5]。目前，HDAC抑制劑作為一種新型高效低毒的抗腫瘤藥物得以開發(fā)，人參皂苷Rb1與其有相似的藥理作用，故推測人參皂苷Rb1的抗腫瘤作用可能與HDAC有關(guān)。本研究中以人白血病細(xì)胞KG1a為對象，初步探討了人參皂苷Rb1對HDAC和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制，觀察人參皂苷Rb1的表觀遺傳修飾作用，為進(jìn)一步的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

RPMI1640培養(yǎng)基（Gibcol）；小牛血清（Hyclone）；人參皂苷Rb1（純度為 98.6%，南京替斯艾么中藥研究所，批號為20031213）；碘化丙啶染料（sigma）；吖啶橙（sigma）；溴乙啶（sigma）、Tritan X-100（sigma）。人白血病細(xì)胞株KG1a（重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)系血液學(xué)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)）。流式細(xì)胞儀FACScalibur（BD，美國）、Model550酶標(biāo)儀（Bio-rad，美國）；Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒購自上海七海復(fù)泰生物科技有限公司；小鼠抗人HDAC3單克隆抗體、Bcl-2及Caspase-3購自Cell Signaling Technology（CST）公司。

1.2 方法

細(xì)胞培養(yǎng)：人白血病KG1a細(xì)培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基中，含10%小牛血清。37℃，5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)，取指數(shù)增殖期細(xì)胞，備用。

KG1a細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)(CCK-8法)[6]：取指數(shù)生長期KG1α細(xì)胞，以3×108／L接種于96孔板，試驗(yàn)組分別加入梯度濃度的人參皂苷 Rb1（20，40，80，160 μmol／L），對照組加入等量的RPMI1640培養(yǎng)液。培養(yǎng)體積為200 μL，各濃度均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)12，24，48，72 h后，每孔加入CCK-8工作液10 μL，輕輕振蕩混勻，于37℃，50%CO2飽和濕度下繼續(xù)培養(yǎng)2 h，在450 nm波長處檢測各孔吸光度值（A），并計(jì)算細(xì)胞生長抑制率和各時(shí)間點(diǎn)的半數(shù)抑制濃度（IC50），以 IC50為標(biāo)準(zhǔn)確定藥物最適作用濃度和時(shí)間，重復(fù)3次。抑制率=（空白對照組 A-Rb1組 A）／空白對照組 A×100%。

細(xì)胞凋亡情況檢測(流式細(xì)胞術(shù)Annecxin-FITC／PI雙染法)[6]：將細(xì)胞收集至10 mL的離心管中，每個(gè)樣本每1 mL有1×106～5×106個(gè)細(xì)胞，1 000 r／min離心5 min，棄培養(yǎng)液。用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌1次，500～1 000 r／min離心5 min。用100 μL的標(biāo)記溶液重懸細(xì)胞，室溫下避光孵育10～15 min。500～1 000 r／min離心5 min沉淀細(xì)胞孵育緩沖液洗1次。加入熒光（SA-FLOUS）溶液4℃下孵育20 min，避光并不時(shí)振動(dòng)。采用流式細(xì)胞儀分析，流式細(xì)胞儀激發(fā)光波長用488 nm，用一波長為515 nm的通帶濾器檢測異硫氰酸熒光素(FITC)熒光，另一波長為560 nm的濾器檢測PI。

HDAC 3及調(diào)亡相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(Western Blot法)[6]：收集細(xì)胞，加200 μL裂解液（50 mmol／L Tris-Hcl，pH=8.0，150 mM PMSF，0.1%NP-40，蛋白酶抑制劑）。4℃12000 r／min離心15 min，取上清液，采用 Bradford法檢測蛋白濃度；取上述制備的蛋白樣品50 μg，上樣到15%SDS-PAGE凝膠，電泳完畢后將蛋白電轉(zhuǎn)至 NC膜，用 5%脫酯奶粉封閉，分別加一抗，37℃孵育2 h，經(jīng)0.1%TBST漂洗后加二抗（1∶2 000）室溫孵育2 h，TBST洗膜后加ECL，X光膠片定影，掃描后用IPP 6.0進(jìn)行圖像分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖抑制作用

結(jié)果見表1。采用梯度濃度的人參皂苷Rb1作用KG1a細(xì)胞12，24，48，72 h后，其生長受到了不同程度的抑制，并呈時(shí)間和濃度依賴性。表明人參皂苷單體Rb1在體外對KG1a細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用，在20～160 μmol／L Rb1濃度范圍內(nèi)，抑制作用呈濃度依賴性，且在 48 h時(shí)抑制最明顯，在 80 μmol／L濃度處理48 h時(shí)達(dá)到了半數(shù)抑制。

2.2 細(xì)胞凋亡影響

采用流式細(xì)胞術(shù)Annecxin-FITC／PI雙染檢測0，20，40，80， 160 μmol／L濃度人參皂苷Rb1處理48 h對KG1a細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果見表2?？梢姡S著處理藥物濃度的增加，ROS水平顯著增加（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率顯著升高，其中早期凋亡細(xì)胞及晚期凋亡細(xì)胞百分比與0 μmol／L相比，均有顯著性差異（P＜0.05）。

表1 不同濃度及時(shí)間人參皂苷Rb1對KG1a細(xì)胞的抑制率（±s，%）

表1 不同濃度及時(shí)間人參皂苷Rb1對KG1a細(xì)胞的抑制率（±s，%）

濃度(βg／mL) 0 20 40 80 160 12 h -3.31±0.01 16.27±0.02 29.25±0.01 30.22±0.02 24 h -5.43±0.02 23.38±0.01 36.16±0.03 43.32±0.02 48 h -9.59±0.01 27.51±0.02 51.40±0.02 74.34±0.01 72 h -11.59±0.01 31.51±0.02 53.40±0.02 79.24±0.01

表2 人參皂苷Rb1對KG1a細(xì)胞凋亡的影響

2.3 HDAC 3，Bcl-2及Caspase-3的表達(dá)結(jié)果

人參皂苷Rb1作用KG1a細(xì)胞48 h后，隨著藥物濃度的增加HDAC3顯著降低（P＜0.05），而Bcl-2，Caspase-3表達(dá)增加，見表3。

表3 人參皂苷Rb1對KG1a細(xì)胞HDAC 3，Bcl-2，Caspase-3表達(dá)的影響

3 討論

目前，白血病仍以化學(xué)治療(簡稱化療)為主，但不良反應(yīng)大，復(fù)發(fā)率高，且毒副反應(yīng)及其耐藥性仍難以解決[7-8]。近年的研究表明，人參抗腫瘤的主要成分可能為人參皂苷，其能抑制白血病細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡、誘導(dǎo)分化、能增加化療藥物的敏感性和逆轉(zhuǎn)耐藥等，但具體作用機(jī)制尚不清楚[5]。

人參皂苷Rb1對白血病細(xì)胞有增殖抑制、促進(jìn)凋亡的作用[6]。本試驗(yàn)中將Rb1作用于KG1a細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其在體外可明顯抑制人急性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株 KG1α的體外增殖，并呈劑量依耐性。CCK-8試驗(yàn)顯示，80 μmol／L Rb1對KG1α細(xì)胞作用48 h可達(dá)到半數(shù)抑制，故本試驗(yàn)后續(xù)選擇80 μmol／L Rb1作用于KG1α細(xì)胞。

表觀遺傳學(xué)是指在基因DNA序列不改變的情況下，基因功能發(fā)生了可遺傳的變化，包括DNA的甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑。其中組蛋白的共價(jià)修飾包括泛素化、磷酸化、乙酰化、甲基化等，它們可單獨(dú)或協(xié)同調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。組蛋白乙酰化修飾是指核心組蛋白分子N端賴氨酸殘基進(jìn)行乙?；揎棸ㄒ阴；腿ヒ阴；?，二者分別由乙?；D(zhuǎn)移酶（HATs）和組蛋白去乙?；福℉DACs）調(diào)控，在正常生理?xiàng)l件下HAT與HDACs對組蛋白乙?；饔玫恼{(diào)控處于平衡狀態(tài)。而細(xì)胞異常增殖時(shí)，HDACs的活性明顯增強(qiáng)，導(dǎo)致基因的平衡表達(dá)被打破，使一些影響細(xì)胞增殖、凋亡的分子表達(dá)失衡，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖和腫瘤發(fā)生。HDACs廣泛表達(dá)于人體內(nèi)，HDAC3作為多種促凋亡基因的核抑制子，易發(fā)生水解分裂，可活化一種靶向HDAC3的抗凋亡基因Fas基因編碼基因的組蛋白乙?；c活性，最終通過死亡受體途徑而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。HDAC3在人體內(nèi)廣泛表達(dá)，主要定位于細(xì)胞核內(nèi)[9]，可與核受體阻抑物受體形成大的蛋白復(fù)合物和轉(zhuǎn)錄因子，并通過相互作用影響靶基因的表達(dá)[10]。

凋亡是細(xì)胞的程序性死亡，是由基因調(diào)控的。腫瘤細(xì)胞的生長是由細(xì)胞增殖與凋亡的比例決定的。細(xì)胞凋亡是由多種信號蛋白通過多種途徑傳導(dǎo)的復(fù)雜過程，目前主要是通過2種途徑，即死亡受體途徑（外部途徑）和線粒體途徑（內(nèi)部途徑），在特定情況下2種凋亡途徑相互交叉存在，最終通過激活 Caspase誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Caspase-3是Caspase中的一種。Bcl-2是一個(gè)非常重要的促凋亡基因，在細(xì)胞的凋亡中起著重要作用。本試驗(yàn)中 Western Blot結(jié)果顯示，80，160 μmol／L Rb1能下調(diào)KG1a細(xì)胞中 HDAC3和增加 Bcl-2和Caspase-3分子的表達(dá)，表明人參皂苷 Rb1可能是通過抑制 HDAC3活性和上調(diào)Bcl-2和Caspase-3的表達(dá)而導(dǎo)致人白血病KG1a細(xì)胞凋亡。

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Influence of Ginsenoside Rb1on the Proliferation and Apoptosis of Human Leukemia KG1a Cell

Wang Hongmei
（Chongqing Tumor Institute，Chongqing，China 400030）

Objective To investigate the mechanism of ginsenoside Rb1on the proliferation and apoptosis of human leukemia KG1a cell.Methods KG1a cells in the logarithmic growth phase were taken as the blank control group.The Rb1group of the ginsenoside monomer was added to 20，40，80，160 Rb1 μmol／L.CCK-8 method was used to detect the proliferation of KG1a cells；apoptosis was detected by flow cytometry；Western Blot was used to detect the express of HDAC3，Bcl-2 and Caspase-3.Results The inhibition effect of Rb1on the proliferation of KG1a cells was significantly inhibited in vitro；in the range of 20-160 μmol／L Rb1，the inhibition effect was concentration dependent，and the inhibition was most obvious at 48 h；flow cytometry showed that with the increase of drug concentration，ROS level increased significantly（P＜0.05），and the apoptosis rate of KG1a cells was significantly increased，and the percentage of apoptotic cells and apoptotic cells was significantly different from that of the 0 μg／mL group（P＜0.05）；Western Blot showed that the expression of HDAC3 decreased significantly with the increase of drug concentration（P＜0.05），while the expression of Caspase-3 and Bcl-2 increased.Conclusion Ginsenoside Rb1can inhibit the proliferation of KG1a cells，and the inhibition may be achieved by promoting the apoptosis of KG1a cells.

ginsenoside Rb1;HDAC3;apoptosis

R285.5；R282.71

A

1006－4931(2015)23－0050－03

2015－07－23；

2015－08－20)