陳 立，陳 郁，張文玲，王曉菲，張晨晰，張立文

1承德縣醫(yī)院 檢驗科，河北承德 067400；2解放軍總參謀部第61研究所 門診部，北京 100141；3解放軍總醫(yī)院 臨檢科，北京 100853

急性早幼粒細(xì)胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)是急性髓細(xì)胞性白血病(acute myeloid leukemia，AML)中的一種特殊亞型，其發(fā)病兇險，早期死亡率高，以彌散性血管內(nèi)凝血(disseminated intravascular coagulation，DIC)或纖溶亢進(jìn)所致嚴(yán)重出血傾向為主要特點。近年來，隨著以維甲酸、砷劑聯(lián)合蒽環(huán)類抗生素為基礎(chǔ)的化療藥物的廣泛應(yīng)用，APL患者的長期生存率提高到了90% ~ 95%[1]。因而快速準(zhǔn)確診斷APL對及時選擇合適的治療方案至關(guān)重要。目前其快速診斷和預(yù)后判斷主要依靠細(xì)胞形態(tài)學(xué)和細(xì)胞化學(xué)染色。流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)對急性白血病診斷、分型及預(yù)后判斷具有重要的臨床意義[2-3]，本研究對82例APL患者骨髓細(xì)胞應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測，以形態(tài)學(xué)診斷分型為基礎(chǔ)，進(jìn)一步分析其免疫表型及細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點，為臨床明確診斷及鑒別提供重要的實驗依據(jù)。

對象和方法

1 研究對象 選取2010年8月- 2014年3月于解放軍總醫(yī)院就診的82例初診APL患者。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照天津標(biāo)準(zhǔn)和FAB標(biāo)準(zhǔn)，其中男性54例，女性28例，中位年齡37(23 ~ 64)歲；M3a(粗顆粒)者20例，M3b(細(xì)顆粒)者57例，M3v(變異型)者5例。82例均行骨髓穿刺(bone marrow aspiration，BMA)及流式細(xì)胞術(shù)檢測。

2 主要儀器和試劑 流式細(xì)胞儀為美國Becton Dickinson公司的FACSCalibur。所用單克隆抗體 (CD33、CD13、CD9、CD64、CD117、CD2、CD11b、CD16、CD19、CD15、CD4、CD56、CD34、CD3、CD7、CD10、CD14、CD20、HLA-DR)及各色同型對照均購自美國Becton Dickinson公司。

3 流式細(xì)胞分析 所有標(biāo)本均行流式細(xì)胞術(shù)檢測免疫表型。無菌操作取3 ml EDTA-K3抗凝的骨髓樣品，用流式細(xì)胞儀Cell Quest軟件獲取30 000個有核細(xì)胞，對數(shù)取樣，CD45/SSC設(shè)門，檢測骨髓有核細(xì)胞各種抗原的表達(dá)率。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果以熒光強(qiáng)度在＜102為陰性，102~ 103為弱陽性，

103~ 104為強(qiáng)陽性，以抗原表達(dá)＞20%為陽性。

4 骨髓涂片檢查 無菌操作取患者0.2 ml骨髓液，涂片，室溫晾干，運用瑞氏-吉姆薩(Wright-Giemsa’s)混合染液，染色15 min，水洗晾干后鏡檢，在涂片佳、染色良好、細(xì)胞分布均勻處，分類計數(shù)200個有核細(xì)胞，計算異常早幼粒細(xì)胞的百分比。

5 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理，正態(tài)分布資料以±s表示，兩組間的顯著性差異比較采用獨立樣本的t檢驗或Mann-Whitney檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 骨髓細(xì)胞形態(tài)及流式細(xì)胞分群 每例標(biāo)本經(jīng)骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查，其中異常早幼粒細(xì)胞比例為50.5% ~ 94.5%，此類細(xì)胞大小不一，呈類圓或不規(guī)則形；細(xì)胞質(zhì)豐富，色藍(lán)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見粗細(xì)不一、紫紅色顆粒及Auer小體，邊緣偽足樣突起明顯；胞核多呈不規(guī)則形，核有扭曲、凹陷、折疊及分葉；核染色質(zhì)細(xì)致，核仁l ~ 3個(圖1)。進(jìn)行CD45/SSC設(shè)門后將骨髓細(xì)胞分為淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞及幼稚細(xì)胞群，在APL患者中均可見一群異常細(xì)胞，這群細(xì)胞占核細(xì)胞總數(shù)的45.6% ~ 88.2%。該細(xì)胞的特點：細(xì)胞群均一、明顯，CD45弱陽性，SSC值較大(圖2)。在細(xì)胞分布及抗原表達(dá)中CD33和CD13呈強(qiáng)陽性表達(dá)，且CD33熒光強(qiáng)度均勻一致(圖3)。

圖1 APL患者骨髓細(xì)胞形態(tài)圖 2 APL患者骨髓細(xì)胞CD45/SSC散點圖P1：幼稚細(xì)胞群； P2：淋巴細(xì)胞； P3：單核細(xì)胞； P4：粒細(xì)胞Fig. 1 Bone marrow cell morphology of APL patientsFig. 2 Scatter diagram of CD45/SSC of APL patients P1: blasts; P2: lymphocytes; P3: monocytes; P4: granulocyte

圖3 82例APL患者CD13抗原和CD33抗原表達(dá)散點圖Fig. 3 Scatter diagram of CD13 and CD33 antigen expression of 82 APL cases

2 APL患者的免疫表型分析 82例APL細(xì)胞全部表達(dá)抗原CD33和CD13，其平均陽性細(xì)胞比例分別為90.2%、85.3%；CD64和CD9抗原陽性表達(dá)率也較高，分別為91.5%、85.4%。表達(dá)早期髓系抗原CD117陽性率為65.9%，表達(dá)T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原CD2陽性率為11.0%，17.1%的患者異常表達(dá)CD56，表達(dá)髓系成熟標(biāo)志CD15抗原陽性率僅為9.8%。CD19、CD34、CD7和HLA-DR抗原陽性表達(dá)率較低，基本不表達(dá)CD16、CD4、CD3、CD10、CD14和CD20。見表1。

表1 82例APL患者免疫表型Tab. 1 Immunophenotypic characteristics of 82 APL cases

3 APL患者陽性抗原表達(dá)強(qiáng)度分析 根據(jù)陽性細(xì)胞比例的不同范圍，即20% ~ 40%、40% ~ 60%、60% ~ 80%和80% ~ 100%進(jìn)一步分析陽性抗原表達(dá)分布，CD13、CD9、CD64、CD117、CD56在4個不同的表達(dá)強(qiáng)度范圍內(nèi)均有分布。其中CD33和CD13主要分布在80% ~ 100%的強(qiáng)表達(dá)范圍內(nèi)，CD9和CD64大多分布在60% ~ 80%和80% ~ 100%的表達(dá)范圍內(nèi)，淋系標(biāo)記CD56和CD2主要分布在20% ~ 40%和40% ~ 60%的弱表達(dá)范圍內(nèi)，CD117大多分布在20% ~ 40%和60% ~ 80%的表達(dá)范圍內(nèi)。而CD15、CD11b、CD19、CD7、CD34和HLA-DR大多分布在20% ~ 40%的弱表達(dá)范圍內(nèi)，其平均陽性細(xì)胞比例均較低。見表2。

4 APL患者抗原比較 按白血病細(xì)胞表達(dá)CD34和HLA-DR的強(qiáng)度，分成CD34+和(或)HLA-DR+(包 括CD34+HLA-DR+、CD34+HLA-DR-、CD34-HLA-DR+)共27例(32.9%)以 及CD34-和HLADR-共55例(67.1%)兩組進(jìn)行比較，其中抗原CD2和CD56在兩組間的表達(dá)有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，其他抗原組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。見表3。

5 M3a、M3b及M3v型中各抗原陽性表達(dá)率比較M3a型CD117抗原陽性表達(dá)率明顯高于M3v型(P＜0.05)，M3v型CD34抗原陽性表達(dá)率明顯高于M3a和M3b型(P＜0.01)，而其他抗原組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。見表4。

表2 82例APL患者的陽性抗原表達(dá)強(qiáng)度Tab. 2 Positive antigen expression intensity of 82 APL cases

表3 APL患者的CD34+和(或) HLA-DR+組與CD34-和HLA-DR-組比較Tab. 3 Comparison of CD34+ and/or HLA-DR+ group and CD34- and HLA-DR- group (%)

討 論

CD13、CD33是髓系特異性免疫標(biāo)志，在不同類型白血病中表達(dá)率不同。Kaleem等[4]報道大部分APL細(xì)胞具有特殊的免疫特征，高表達(dá)CD13、CD33和CD9，而CD34、HLA-DR大多為陰性。本研究結(jié)果顯示，APL患者白血病細(xì)胞群均一、明顯，因其顆粒較多表現(xiàn)為SSC值較大，與成熟粒細(xì)胞相似；82例APL患者表現(xiàn)為CD33+CD13+陽性共表達(dá)，共表達(dá)率100.0%，CD33抗原的平均陽性細(xì)胞比例可達(dá)90.2%，CD13次之(85.3%)。抗原CD64和CD9陽性表達(dá)率及平均陽性細(xì)胞比例分別為91.5%(67.4%)、85.4%(68.2%)，表達(dá)率與文獻(xiàn)報道相似[5]。而抗原CD34、HLA-DR陽性表達(dá)率較低。這說明通過CD45/SSC散點圖特征及細(xì)胞高表達(dá)抗原CD13、CD33和CD9，但CD34和HLA-DR陽性表達(dá)率較低時應(yīng)該考慮APL的可能性。正常情況下髓系成熟標(biāo)志CD15抗原在早幼粒細(xì)胞階段即開始高表達(dá)[6]，然而與正常早幼粒細(xì)胞不同，APL患者的異常早幼粒細(xì)胞很少表達(dá)這個抗原(表達(dá)率僅為9.8%)，且表達(dá)強(qiáng)度也較弱。

表4 M3a、M3b及M3v型中各抗原陽性表達(dá)率比較Tab. 4 Comparison of antigen positive rate of M3a, M3b and M3v (%)

各抗原表達(dá)陽性細(xì)胞比例不盡相同，CD33抗原不但陽性率和陽性細(xì)胞比例高，且分布較一致；而CD13、CD9、CD64、CD117、CD56等抗原的陽性細(xì)胞比例分布不一致，為20% ~ 100%，這決定了初診時具有上述抗原表達(dá)的APL細(xì)胞比例高低不等。因此盡可能選用初診幼稚細(xì)胞中表達(dá)率高的抗體，使其適用范圍更廣。CD117是一種分子量為145 kU的跨膜蛋白受體，其配體為干細(xì)胞因子(stem cell factor，SCF)。SCF是重要的造血生長因子，與其他細(xì)胞因子協(xié)同作用可刺激造血干/祖細(xì)胞的增殖和分化。有文獻(xiàn)報道CD117在正常骨髓細(xì)胞的陽性率較低，主要在干細(xì)胞、髓系定向祖細(xì)胞上表達(dá)[7]。國內(nèi)外關(guān)于APL患者中CD117陽性表達(dá)率報道多為23.0% ~ 80.0%。本研究結(jié)果顯示，CD117陽性表達(dá)率及平均陽性細(xì)胞比例分別為65.9%與56.4%。盡管CD117的陽性細(xì)胞比例有差異，但目前還沒有更好的標(biāo)志可以替代CD117進(jìn)行早期細(xì)胞設(shè)門。另外，對初治CD117表達(dá)不高的患者，利用CD117進(jìn)行設(shè)門分析時，可能會低估白血病細(xì)胞的比例，因此在解釋結(jié)果時要加以說明。

CD34是干細(xì)胞祖細(xì)胞的標(biāo)志，表達(dá)于最早的干細(xì)胞祖細(xì)胞上，隨細(xì)胞成熟其抗原表達(dá)逐漸減弱直至消失，HLA-DR表達(dá)于白血病細(xì)胞的較早分化階段，我們按照患者異常早幼粒細(xì)胞在這2種抗原的表達(dá)強(qiáng)度，將所有患者分為表達(dá)較為幼稚的CD34+和(或) HLA-DR+組和表達(dá)較為成熟CD34-和HLA-DR-組。結(jié)果顯示，CD34+和(或) HLA-DR+組表達(dá)CD2、CD56抗原強(qiáng)度明顯高 于CD34-和HLA-DR-組。Montesinos等[8]發(fā)現(xiàn)，APL患者異常表達(dá)CD56完全緩解的持續(xù)時間更短，5年復(fù)發(fā)率更高，總體生存期更短。國外文獻(xiàn)報道CD56陽性與APL復(fù)發(fā)及預(yù)后存在一定的相關(guān)性[9]。但目前臨床對于CD56陽性出現(xiàn)APL復(fù)發(fā)的相關(guān)機(jī)制尚不清楚，主要有以下兩種解釋：1) CD56陽性的細(xì)胞，大多都比較幼稚，帶有多能干造血干細(xì)胞性質(zhì)，對以維甲酸+蒽環(huán)類為基礎(chǔ)的藥物缺乏敏感性[10]。2)CD56陽性患者治療過程中，往往高表達(dá)P-糖蛋白，從而更容易出現(xiàn)化療藥物耐藥。CD2是T淋巴細(xì)胞上分布的一種綿羊紅細(xì)胞受體，與T淋巴細(xì)胞的活化和增殖有關(guān)。有文獻(xiàn)報道，白血病細(xì)胞表達(dá)CD34和CD2的APL患者對ATRA的治療效果較差，早期死亡率更高，更容易復(fù)發(fā)，總體生存期和無病生存期相對較短[11]。故CD2和CD34也可作為APL預(yù)后不良指標(biāo)之一。急性白血病系列混雜模型認(rèn)為[12-14]，表達(dá)CD34、HLA-DR同時跨系CD2或CD56的APL患者，其白血病腫瘤干細(xì)胞可能起源于系列未確定前更為原始的造血細(xì)胞。而不表達(dá)CD2和CD56的APL細(xì)胞則可能起源于髓系已確定后較為成熟的髓系祖細(xì)胞[15-16]。因此，表達(dá)CD34、HLA-DR抗原的APL細(xì)胞更多出現(xiàn)跨系表達(dá)CD2和CD56。

APL形態(tài)學(xué)診斷可分為M3a型(粗顆粒)、M3b型(細(xì)顆粒)和M3v型(變異型)，M3v型是指異常早幼粒細(xì)胞胞核呈雙葉、多葉或腎形，胞質(zhì)內(nèi)無或少顆粒，Auer小體少見。在82例APL患者中M3b型比例最高為69.5%。我們進(jìn)行免疫表型分析結(jié)果顯示，M3a型CD117抗原陽性表達(dá)率明顯高于M3v型，M3v型CD34抗原陽性表達(dá)率明顯高于M3a和M3b型。這提示M3v型患者CD34表達(dá)率高，此型APL細(xì)胞可能來源于更原始的祖細(xì)胞。據(jù)文獻(xiàn)報道[17-18]，M3v型患者中表達(dá)CD2陽性率高，而M3a、M3b型大多不表達(dá)CD2，推斷CD2和M3v有一定關(guān)系。本研究中82例APL患者診斷M3v型僅5例，表達(dá)CD2抗原有1例，但由于M3v型例數(shù)過少，無法證實CD2與M3v型的關(guān)系，尚需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。對于常見的M3a型較易鑒別，但M3b、M3v型細(xì)胞顆粒細(xì)小，似灰塵樣，核扭曲折疊，易誤診為單核細(xì)胞，因此以骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)結(jié)合免疫表型分析，有助于鑒別診斷及了解細(xì)胞的不同分化階段和類型。

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