李小芳, 馮小強(qiáng) , 孫長(zhǎng)金, 楊 聲

(1.天水師范學(xué)院 化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院, 甘肅 天水 741001; 2.定西師范高等專科學(xué)校 化學(xué)系, 甘肅 定西743000)

人體的衰老與病變很大程度上是由于機(jī)體內(nèi)自由基產(chǎn)生失衡, 導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生過(guò)多的活性自由基?，F(xiàn)代科學(xué)表明, 生物相溶性與清除自由基效率是衡量抗氧化劑對(duì)機(jī)體抗氧化性能的重要指標(biāo)。天然抗氧化劑因抗氧化效率高、生物相溶性良好、熱穩(wěn)定性好、對(duì)機(jī)體無(wú)毒副作用等特點(diǎn)成為研究的熱點(diǎn)。殼寡糖(簡(jiǎn)寫COS)是殼聚糖降解以后聚合度小于20的產(chǎn)物, 是有2~20個(gè)含氨基的葡萄糖通過(guò)β-1, 4-糖苷鍵連接而成的堿性低聚糖, 其分子質(zhì)量低, 水溶性好, 理化性質(zhì)均得以改善。COS由于主鏈上的β-(1, 4)糖苷鍵發(fā)生斷裂, 更多的活性羥基和氨基基團(tuán)暴露出來(lái), 因而具有良好的抗氧化能力。近年來(lái), 低聚殼聚糖及其衍生物的抗氧化性日益受到關(guān)注。研究表明, 低聚殼聚糖羧甲基衍生物[1], 酰化衍生物[2-4]、季銨鹽衍生物[5]和硫酸酯金屬配合物[6]都有明顯的抗氧化活性。但是對(duì)低聚殼聚糖?；苌锵⊥僚浜衔锏目寡趸钚陨形从醒芯繄?bào)道。課題組在前期工作中, 運(yùn)用紫外和熒光光譜研究丁二酰化殼寡糖稀土配合物與牛血清白蛋白(BSA)的相互作用, 發(fā)現(xiàn)配合物能夠與BSA形成復(fù)合物, 從而猝滅BSA內(nèi)源熒光, 該猝滅機(jī)制屬于靜態(tài)猝滅[7-8]。同時(shí), 還采用光譜和循環(huán)伏安法, 研究了丁二酰化殼寡糖稀土配合物與鯡魚精DNA之間的作用方式, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)配合物都能通過(guò)插入方式與DNA相互作用, 導(dǎo)致DNA分子的構(gòu)象變化, 可有望成為一種新型抗癌藥物[9]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)殼寡糖進(jìn)行酰化, 依次和不同稀土離子進(jìn)行配位, 制得丁二?；瘹す烟?簡(jiǎn)寫 BCS)以及稀土配合物, 通過(guò)從清除羥自由基、超氧陰離子自由基和總還原能力三方面分別測(cè)定了、丁二殼酰化殼寡糖及其稀土配合物的抗氧化活性, 期望進(jìn)一步尋找出更加豐富的生物功能特性, 從而拓寬殼寡糖應(yīng)用范圍。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑與儀器

殼寡糖(濟(jì)南海得貝海洋生物工程有限公司),分子質(zhì)量5 000; 丁二酸酐(國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司);抗氧化測(cè)試所需溶液由二次蒸餾水配制。721分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 丁二?；瘹す烟羌跋⊥僚浜衔锏闹苽?/h3>

根據(jù)前期已報(bào)道的具體制備方法[8]: 稱取 3.0 g COS溶于75 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)是1.0 %的乙酸溶液, 攪拌下加21 mL吡啶; 稱取2.5 g丁二酸酐, 溶于220 mL乙醇, 緩慢滴加到上述溶液中, 室溫下反應(yīng) 5 h。反應(yīng)液中加入 3倍體積的無(wú)水乙醇, 即刻有大量沉淀析出。抽濾, 用無(wú)水乙醇洗滌多次, 干燥得丁二?；瘹す烟? 記作BCS。

稱取0.5 g BCS溶于適量蒸餾水中, 攪拌下逐滴加入稀土氯化物的水溶液, 室溫下攪拌3 h, 調(diào)節(jié)pH至中性, 繼續(xù)反應(yīng)3 h。反應(yīng)結(jié)束后加入3倍體積的丙酮, 立即析出沉淀。抽濾, 用丙酮洗滌多次直至濾液中無(wú)Cl–, 干燥得丁二酰化殼寡糖-銪、丁二?；瘹す烟?釹和丁二?；瘹す烟?鑭配合物, 分別記作BCS-Eu、BCS-Nd、BCS-La。分別用 1.0%(V/V)的乙酸配置成0.5 g/L、1.5 g/L、2.5 g/L的溶液備用。

1.3 抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

以質(zhì)量分?jǐn)?shù)是1.0 %的乙酸溶液和維生素C分別為空白對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照, COS、BCS及配合物BCS-Eu、BCS-Nd、BCS-La 對(duì) OH、.O2–的清除作用以及還原能力的具體實(shí)驗(yàn)過(guò)程, 根據(jù)已報(bào)道文獻(xiàn)[10]的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)過(guò)程操作, 每組樣品進(jìn)行 3次平行實(shí)驗(yàn),結(jié)果為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與討論

2.1 對(duì)·OH 的清除

·OH 是機(jī)體中產(chǎn)生最多的含氧自由基, 對(duì)組織細(xì)胞的破壞作用最大, 它可以加成于堿基雙鍵中造成堿基破壞, 從而產(chǎn)生結(jié)構(gòu)突變。COS通過(guò)?；磅；笤倥c稀土金屬離子的配位作用, 從而引入了吸電子能力強(qiáng)的基團(tuán), 減低了分子的氫鍵作用, 使分子中的活性基團(tuán)羥基和氨基大量暴露。分子中羥基上的氫與羥自由基反應(yīng), 而活性氨基則通過(guò)與溶液中的氫離子結(jié)合成氨正離子再與羥自由基形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu), 從而達(dá)到清除羥自由基的作用。

當(dāng)樣品的質(zhì)量濃度均為 1.0 g/L時(shí), 維生素 C對(duì)·OH 自由基的最大清除率為 84.2 %, 而 COS、BCS、BCS-La、BCS-Nd和BCS-Eu對(duì)·OH自由基的最大清除作用分別為27.5 %、38.2 %、27.3 %、30 %和28.2 %, 說(shuō)明COS、BCS及稀土離子配合物對(duì)羥自由基均具有不同程度的清除效果, 總體上 BCS及稀土離子配合物的清除效果強(qiáng)于COS本身(圖1), 這可能是由于在 BCS中部分氨基被取代, 盡管氨基數(shù)目在減少, 但作為吸電子基團(tuán)的–COCH2=CH2COO–所起的作用占主導(dǎo)地位: 一方面, 它能降低 COS分子中電子云密度, 從而降低了分子內(nèi)、分子間的成鍵幾率, 釋放出更多的氨基和羥基與自由基反應(yīng); 同時(shí), 也會(huì)使O–H和N–H鍵更易斷裂, 使氨基和羥基的活性提高, 有利于清除自由基[2]。這一解釋同樣適合樣品清除超氧陰離子自由基的情況。同時(shí)還發(fā)現(xiàn),隨著 BCS質(zhì)量濃度的增大, 清除率逐漸降低, 可能是因?yàn)闈舛冗^(guò)大, 分子容易扭曲團(tuán)聚, 這樣暴露在外部的活性基團(tuán)數(shù)量減少所致。

圖1 COS、BCS及稀土離子配合物清除·OH的能力Fig.1 Scavenging hydroxyl radical capacity of COS, BCS and complexes

但是, BCS與稀土離子配位形成配合物后, 發(fā)現(xiàn)對(duì)羥自由基清除能力較 BCS減弱。在低濃度時(shí), 稀土配合物與 BCS對(duì)羥自由基清除能力差別明顯, 但隨著濃度的提高, 抑制活性很快達(dá)到飽和, 稀土配合物對(duì)羥自由基清除能力反而較 BCS增強(qiáng)。并且BCS-Eu、BCS-La隨著樣品質(zhì)量濃度的增大, 對(duì)羥自由基清除率逐漸提高, 而BCS-Nd、BCS在質(zhì)量濃度達(dá)到0.5 g/L時(shí)清除率到達(dá)最高值為37 %、47 %, 此后隨濃度增大清除率呈下降趨勢(shì)。相比之下用不同的稀土離子作配位中心對(duì)·OH 的清除作用依次是BCS>BCS-Nd>BCS-Eu>BCS-La>COS。當(dāng)濃度均為0.5 g/L時(shí), 不同稀土離子配合物清除·OH能力存在明顯差異, BCS對(duì)羥自由基的清除作用最強(qiáng)可達(dá)47 %。隨著濃度的增加當(dāng)濃度達(dá)到 1.5 g/L時(shí) BCS-La、BCS-Nd、BCS-Eu、BCS對(duì)羥自由基·OH的清除率相差不大可能是濃度過(guò)大時(shí)分子間的氫鍵作用增強(qiáng)影響了抗氧化效果。

2.2 對(duì)超氧陰離子自由基的清除

本實(shí)驗(yàn)采用鄰苯三酚自氧化法產(chǎn)生超氧陰離子自由基, 用分光光度計(jì)測(cè)定各試樣在不同濃度下對(duì)超氧陰離子自由的歧化活性的吸光度值, 計(jì)算其清除率。

當(dāng)樣品的質(zhì)量濃度均為1.0 g/L時(shí), 維生素C對(duì)超氧陰離子自由基的最大清除率為56.8 %, 而COS、BCS、BCS-Nd、BCS-Eu和BCS-La的最大清除作用分別為15 %、17 %、19 %、21 %和20.8 %, 說(shuō)明COS、BCS及稀土離子配合物對(duì)超氧陰離子自由基均具有不同程度的清除效果, 總體上 BCS及稀土配合物的清除效果強(qiáng)于 COS本身, 在不同濃度下稀土配合物對(duì)超氧陰離子自由基清除效果普遍強(qiáng)于 BCS(圖2),這可能是由于 BCS與稀土離子配位后, 分子上電荷密度增大, 更加有利于與超氧陰離子自由基作用。當(dāng)樣品的質(zhì)量濃度均為1.5 g/L時(shí), 對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用依次為 BCS-La>BCS-Eu>BCS-Nd>BCS>COS。其中BCS-Nd、BCS-Eu在試樣質(zhì)量濃度0.5 g/L時(shí)清除作用最強(qiáng), 清除率分別為22.5 %、26.5 %,此后濃度與清除率呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì)。而對(duì)于COS、BCS和BCS-La, 濃度與清除率趨于正相關(guān)。據(jù)圖2所示,?；瘹す烟羌磅；瘹す烟窍⊥僚浜衔飳?duì)清除超氧陰離子自由基能力較COS顯著提升。

圖2 COS、BCS及稀土離子配合物對(duì)·O2-的清除Fig.2 Scavenging superoxide anion radical capacity of COS, BCS and complexes

2.3 還原能力測(cè)定

還原能力是表示抗氧化物質(zhì)提供電子能力的重要指標(biāo), 研究表明抗氧化活性和還原能力之間存在著密切的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)采用鐵氰化鉀法測(cè)定試樣在700 nm的吸光度, 來(lái)間接反映還原能力的強(qiáng)弱。一般吸光度值越大, 則還原能力越強(qiáng)。如圖3所示,BCS、BCS-La、BCS-Nd、BCS-Eu的還原能力均比COS略有增強(qiáng), 但不同稀土配合物間的還原能力相差不大, 可能是所選配位中心離子同屬鑭系元素,具有相似的化學(xué)性質(zhì)的緣故。而且試樣質(zhì)量濃度在0.5~1.5 g/L的范圍內(nèi)隨著濃度的增大, 還原能力也隨之增強(qiáng)。

圖3 COS、BCS及稀土離子配合物的還原能力Fig.3 Reducing power of COS, BCS and complexes

3 結(jié)論

從清除羥自由基、清除超氧陰離子自由基和還原力三個(gè)體外抗氧化實(shí)驗(yàn), 可以看出BCS、BCS-La、BCS-Nd、BCS-Eu較COS均具有很好的抗氧化能力,表現(xiàn)出了不同程度的抗氧化能力。在COS分子鏈上引入吸電子基團(tuán)–COCH2=CH2COO–后, 降低COS分子中電子云密度, 從而降低了分子內(nèi)、分子間的成鍵幾率, 釋放出更多的氨基和羥基與自由基反應(yīng), 所以BCS的抗氧化活性較COS增強(qiáng)。稀土配合物中,由于不同種類稀土離子的引入, 分子中電子云密度增大, 更加有利于進(jìn)攻自由基, 故而抗氧化活性較BCS增強(qiáng)。

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