龐云龍, 丁 君, 田 瑩, 郝振林, 常亞青

(大連海洋大學 農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室, 遼寧 大連 116023)

蝦夷扇貝(Patinopecten yessoensis)屬軟體動物門(Mollusa)、瓣鰓綱(Lamellibranchia)、翼形亞綱(Pterimorphia)、珍珠貝目(Pterioida)、扇貝科(Pectinidae), 為冷水性種, 自然分布于日本海、俄羅斯遠東海域, 自20世紀80年代初由日本青森縣陸澳灣引入中國海域, 目前已成為中國北方沿海地區(qū)重要的養(yǎng)殖經(jīng)濟貝類之一[1]。蝦夷扇貝左殼小而平、呈紅褐或紫褐色, 右殼稍大而凸、呈白色, 近些年也發(fā)現(xiàn)左右殼均呈白色的個體, 并且表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢[2-3]。目前對蝦夷扇貝的研究主要集中在生產(chǎn)養(yǎng)殖[4-5]、群體遺傳多樣性和種質(zhì)[6-7]、蛋白質(zhì)組學[8]、營養(yǎng)成分等方面[2,9]。關于蝦夷扇貝殼超微結(jié)構的相關研究極少報道。

雙殼類的殼壁從殼質(zhì)成分上可分為有機質(zhì)層和無機質(zhì)層(即碳酸鈣層)兩部分, 有機質(zhì)層覆于殼體最表面, 故稱表殼層(Periostracum), 表殼層的作用首先是保護殼體的鈣質(zhì)部分。鈣質(zhì)部分結(jié)構就是通常所稱的殼質(zhì)結(jié)構[10]。鈣質(zhì)層一般可分為三層: 外殼層(outer layer), 中殼層(middle layer), 和內(nèi)殼層(inner layer)[10-11]。雙殼類外殼層包括均質(zhì)結(jié)構和葉狀結(jié)構, 成分為方解石; 中殼層由文石結(jié)構組成, 包括片狀結(jié)構和棱柱結(jié)構; 內(nèi)殼層為片狀結(jié)構部分葉狀結(jié)構。本實驗所使用殼質(zhì)結(jié)構的專業(yè)術語參考陳金華[10]和 Carter[12]。

貝殼的殼質(zhì)結(jié)構研究由光學顯微鏡的使用而開展[13]。隨著電子顯微鏡技術的發(fā)展, 20世紀60年代后期, 主要應用掃描電子顯微鏡對殼質(zhì)結(jié)構進行分析研究。目前國內(nèi)外關于軟體動物殼質(zhì)超微結(jié)構的報道較少, 梁艷[14]研究了腹足綱香螺貝殼在生長過程中不同時期的殼體材料結(jié)構及力學性能; 馮偉民[15-16]對陸棲肺螺類與半咸水螺殼的殼質(zhì)超微結(jié)構進行了對比研究, 闡述了腹足類個體發(fā)育中殼質(zhì)結(jié)構的變化; Younis[17]研究了長刺古螺(Murex troscheli)殼質(zhì)的原子結(jié)構和超微結(jié)構; West[18]對淡水腹足類殼質(zhì)超微結(jié)構做了相關研究。Dauphin[19]對6種雙殼類和腹足類殼的化學組成以及超微結(jié)構做了詳細研究; Villagran[20]利用掃描電鏡技術觀察到紫貽貝(Mytilus edulis)經(jīng)過風化作用后產(chǎn)生了一種新的殼質(zhì)結(jié)構。為探究不同生長時期蝦夷扇貝的殼質(zhì)結(jié)構, 本實驗以大連海洋大學農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室培育的不同生長時期的蝦夷扇貝作為實驗材料,使用掃描電鏡觀察了不同月齡貝殼的超微結(jié)構, 明確了不同發(fā)育階段蝦夷扇貝的殼質(zhì)結(jié)構類型, 以期為豐富雙殼貝類的殼質(zhì)結(jié)構積累資料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗所用蝦夷扇貝取自大連海洋大學農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室培育并吊養(yǎng)的已明確月齡的(5月齡、7月齡、9月齡、12月齡、18月齡、30月齡)蝦夷扇貝(圖1)。其中5月齡樣品分為紅殼和白殼2種, 共計7種, 每種隨機取5只觀測。貝殼表型信息如表1所示。

圖1 不同時期蝦夷扇貝左殼Fig.1 The left valve of Patinopecten yessoensis at different ages

表1 不同生長時期蝦夷扇貝形態(tài)指標測量Tab.1 The morphological index of Patinopecten yessoensis at different ages

實驗所用儀器: 超聲波清洗儀(寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品), 多功能臺鋸(永康市新紀元工貿(mào)有限公司產(chǎn)品), 電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司產(chǎn)品), 掃描電鏡(德國ZEISS上海有限公司產(chǎn)品)。

實驗在大連海洋大學農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室進行樣品處理, 在大連海事大學進行電鏡觀察。

1.2 方法

本實驗的步驟和樣品處理方法采用 Carter方法并略有改進[21], 具體操作步驟如下:

將樣品用毛刷將貝殼表面的泥土和附著物刷洗干凈, 對樣品經(jīng)行編號、拍照, 然后沿貝殼殼頂中心點至殼口中點進行切割, 切割后得到貝殼的兩個截面, 距殼頂每隔1 cm取樣, 大小規(guī)格約為1 cm×1 cm。將切割得到的剖面用 800目的玻璃進行打磨, 每個剖面打磨至少1 min。把樣品放入超聲波震蕩清洗儀中清洗。每件樣品清洗 30 s左右。清洗之后, 將樣品放入1%的過氧化氫(H2O2)溶液中浸泡, 約3 h, 在放入超聲波震蕩清洗儀中清洗, 30s。清洗后的樣品用鑷子取出放入恒溫干燥箱中烘干, 45℃, 48 h。先在顯微鏡下觀察殼質(zhì)結(jié)構是否清晰, 如果能夠清晰展示,則繼續(xù)下一步。如不能則重復步驟4～9。將準備好的樣品用鑷子放置在電鏡紐扣上, 噴金, 在掃描電鏡下進行觀察實驗結(jié)果, 同時通過掃描電鏡的能譜成分分析功能對殼表面元素組成和含量進行測定。

2 結(jié)果

2.1 蝦夷扇貝殼質(zhì)結(jié)構類型

雙殼類的殼質(zhì)超微結(jié)構呈多層分布, 組成這些層的晶體排列方向和礦物成分不盡相同。蝦夷扇貝從礦物成分上可分為2種: 文石(aragonite)和方解石(calcite)。從殼質(zhì)結(jié)構上可以分為 4種主要類型: 均質(zhì)型結(jié)構(homogeneous)、葉狀型結(jié)構(foliated)、交錯片狀結(jié)構(crossed lamellar)、棱柱型結(jié)構(prismatic),均質(zhì)結(jié)構又可分為均質(zhì)型結(jié)構(homogeneous)和顆粒狀均質(zhì)結(jié)構(granular homogeneous)。葉狀型結(jié)構根據(jù)首級片體的結(jié)構模型可分為交錯葉狀結(jié)構(crossed foliated)、規(guī)則葉狀結(jié)構(regular foliated)和不規(guī)則葉狀結(jié)構(irregular foliated)。交錯片狀結(jié)構分為交錯片狀結(jié)構(crossed lamellar)和復雜交錯片狀結(jié)構(complex crossed lamellar)。蝦夷扇貝左殼縱切面掃描電鏡圖片見圖2。

圖2 蝦夷扇貝左殼縱切面掃描電鏡圖片F(xiàn)ig.2 SEM photomicrographs showing the vertical section of the left valve of Patinopecten yessoensis

2.1.1 均質(zhì)型結(jié)構(homogeneous)

殼質(zhì)結(jié)構最外層是很薄的方解石結(jié)構, 位于葉狀型結(jié)構之上。通過觀察不同的樣品可以將均質(zhì)型結(jié)構分為上下 2種亞層, 上層結(jié)構為均勻致密亞層,如圖 2C、2D(上)。下層結(jié)構為顆粒狀亞層, 如圖2D(下), 由不規(guī)則的晶體構成, 大小不一。

2.1.2 葉狀型結(jié)構(foliated)

葉狀結(jié)構是由 3個層級的片體構成, 3級片體laths(third-order lamella)構成次級片體 sheets (second-order lamella), 首級片體(first-order lamella)由次級片體構成。根據(jù)首級片體的結(jié)構模型又可以將葉狀結(jié)構分為以下幾種類型。

交錯葉狀結(jié)構(crossed foliated) 通常分布在最外層均質(zhì)結(jié)構下面的一層方解石結(jié)構, 首級片體的方向一致。交錯排列。如圖2E。

規(guī)則葉狀結(jié)構(regular foliated) 具有相同的傾斜角度的片狀方解石結(jié)構。規(guī)則葉狀結(jié)構在殼的外層, 和殼內(nèi)層均有分布。殼外層的規(guī)則葉狀結(jié)構與交錯葉狀結(jié)構相接, 圖 2F; 殼內(nèi)層的規(guī)則葉狀結(jié)構位于交錯片狀結(jié)構之下, 如圖2G。

不規(guī)則葉狀結(jié)構(irregular foliated) 分布具有區(qū)域性, 在局部分布廣泛。首級片體沒有固定的方向性, 與前 2種葉狀結(jié)構的區(qū)別在于它的形狀不規(guī)則,樹杈狀排布, 而且明顯小于前 2種結(jié)構, 如圖 2H。在分布上這 3種結(jié)構通常是過渡式的排列, 由外向內(nèi)為交錯葉狀結(jié)構過渡為規(guī)則葉狀結(jié)構, 再到不規(guī)則葉狀結(jié)構, 如圖2F。

葉狀結(jié)構的分布大致可分為 2種情況: (1)分布在較外層, 均質(zhì)結(jié)構之下, 貫穿整個貝殼, 規(guī)則葉狀結(jié)構從殼頂延伸至殼腹緣, 交錯葉狀結(jié)構覆在其上面, 從腹緣至背緣逐漸變薄。(2)內(nèi)層的規(guī)則葉狀結(jié)構分布在片狀結(jié)構之下, 是貝殼內(nèi)層的主要結(jié)構。內(nèi)外兩部分只有在殼頂區(qū)域才有接觸。

2.1.3 交錯片狀結(jié)構(crossed lamellar)

交錯片狀的首級片體由互相平行的文石晶體聚集而成。在相鄰的首級片體中, 次級片體長軸可能在兩個相反的方向上交替排列。復雜交錯片狀結(jié)構(complex crossed lamellar)更加復雜, 在三個或者更多的方向上分布排列。這種排列方式可以增加殼的抗擊能力。交錯結(jié)構被棱柱結(jié)構分隔為上下兩個亞層, 棱柱結(jié)構上面的交錯片狀亞層的首級片體長而且形狀規(guī)則, 如圖 2J, 最顯著的特征是分支狀的首級片體; 內(nèi)部交錯片狀亞層主要是復雜交錯片狀結(jié)構, 與外部亞層相比首級片體較短, 而且形狀更加不規(guī)則, 如圖2K。

2.1.4 棱柱型結(jié)構(prismatic)

棱柱結(jié)構是由長條形的棱柱構成, 楔形或 V字形, 長遠大于寬, 成分為文石。如圖 2B。棱柱形狀簡單, 邊界筆直或不規(guī)則, 直徑1～3 μm。棱柱結(jié)構分布在交錯片狀結(jié)構和復雜交錯片狀結(jié)構之間, 厚度從閉殼肌痕處向四周呈散射狀逐漸變薄。

2.2 不同時期蝦夷扇貝的殼質(zhì)結(jié)構組成

殼頂是貝殼發(fā)生的最初點, 也被稱作胎殼。本實驗以不同生長階段的蝦夷扇貝為實驗材料, 距殼頂每隔1cm取樣進行電鏡觀察。分析不同階段的扇貝所具有的殼質(zhì)結(jié)構類型, 結(jié)果見表2。5月齡的殼質(zhì)結(jié)構組成種類較少, 包括3種結(jié)構類型, 即均質(zhì)結(jié)構、葉狀結(jié)構、交錯片狀結(jié)構。7～30月齡的殼質(zhì)結(jié)構類型組成基本保持穩(wěn)定, 但也存在差異, 如復雜交錯片狀結(jié)構只在18月齡和30月齡中出現(xiàn)。

2.3 同一時期不同殼色蝦夷扇貝的殼質(zhì)元素組成

本實驗分析了不同殼色蝦夷扇貝殼表面的化學元素組成。對5月齡蝦夷扇貝“象牙白”品系和普通紅褐色蝦夷扇貝的貝殼表面 5種化學元素含量進行了分析。如表3和表4。結(jié)果表明: 除Ca外, “象牙白”品系和普通紅褐色貝殼所含的C、O、Na、Mg 4種元素比例差異較小, 而Ca元素的含量在2種貝殼中的差異較顯著。從表中可以看出O、C、Ca 3種元素在貝殼中的含量均較高, 其中 O元素含量的百分比在2種貝殼中均顯示最高, 分別為60.44%和56.48%;Mg元素含量的百分比均顯示最低, 分別為0.48%和0.36%。

表2 不同時期蝦夷扇貝殼質(zhì)結(jié)構Tab.2 Shell structure at different ages

表3 “象牙白”外殼表面元素分析Tab.3 The shell surface elemental analysis of “Ivory”strains of Patinopecten yessoensis

表4 普通紅褐色蝦夷扇貝外殼表面元素分析Tab.4 The shell surface elemental analysis of ordinary individuals

3 討論

3.1 不同生長時期殼質(zhì)超微結(jié)構類型比較分析

研究不同月齡貝殼殼頂處的超微結(jié)構發(fā)現(xiàn), 隨著月齡的增長, 殼質(zhì)超微結(jié)構的主要類型稍有差異,但基本保持穩(wěn)定。實驗觀察到 5月齡殼質(zhì)結(jié)構類型較少, 主要由均質(zhì)結(jié)構、規(guī)則葉狀結(jié)構和交錯片狀結(jié)構構成, 而均質(zhì)結(jié)構和規(guī)則葉狀結(jié)構所占的比例很少, 均質(zhì)結(jié)構僅分布在貝殼的表層下部, 規(guī)則葉狀結(jié)構只出現(xiàn)在殼內(nèi)層的部分區(qū)域, 貝殼中間很大一部分是交錯片狀結(jié)構。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是由于交錯片狀結(jié)構具有很強的抗裂碎能力, 5月齡的幼貝殼體尚小, 為了增加自身的貝殼抗擊能力, 從而有效的防止物理損傷而導致死亡。我們還觀察到復雜交錯片狀結(jié)構只出現(xiàn)在18月齡和30月齡, 復雜交錯片狀結(jié)構是交錯結(jié)構的一種, 但它的首級片體交錯方式更加復雜, 形狀更加不規(guī)則, 因此復雜交錯片狀結(jié)構使得此時的貝殼具有更強的抗擊能力和抗磨損能力。馮偉民在觀察腹足類殼質(zhì)超微結(jié)構時也提出了相似的觀點[16]。

同時, 觀察到隨著殼體發(fā)育, 會突然出現(xiàn)增生新的超微結(jié)構層的現(xiàn)象, 如圖2I, 在觀察18月齡蝦夷扇貝樣品時, 棱柱結(jié)構結(jié)構(3)和交錯片狀結(jié)構(1)中間, 新生成一層交錯片體結(jié)構(2), 它的首級片體比交錯片狀結(jié)構短, 但排列形式卻比復雜交錯片體規(guī)則。相似的研究結(jié)果也有見報道, Bandel在Seguenzia中的第2螺層和第3螺層中發(fā)現(xiàn)了這種情況[22]。

此外, 通過反復比對發(fā)現(xiàn), 隨著生長時期的增加, 殼質(zhì)結(jié)構逐漸趨向于復雜, 葉狀結(jié)構和交錯片狀結(jié)構的比例增加, 如圖2G和圖2J所示。片狀結(jié)構的礦物成分是文石, 這是由于隨著生長期的增加,碳酸鈣不斷沉積, 殼體增厚, 不斷形成新的文石, 從而使扇貝在生長過程中通過殼質(zhì)超微結(jié)構調(diào)整不斷獲得個體生長所必需的性能。

3.2 殼色差異對殼外表面元素組成和含量的影響

貝殼的主要成分是碳酸鈣, 占其重量的 90%以上[23]。本試驗選取不同殼色的蝦夷扇貝, 初步分析了貝殼外表面的元素組成, 在分析比較的5種元素C、O、Na、Mg、Ca中, C、O、Ca 3種元素的含量占絕對優(yōu)勢。Ca元素含量在 2種貝殼中表現(xiàn)出了差異,“象牙白”品系Ca元素的質(zhì)量分數(shù)比普通紅褐色扇貝少了10.23%, Ca元素含量的減少可能會對殼質(zhì)結(jié)構產(chǎn)生影響。研究表明雙殼類殼體中元素組成主要受殼體礦物物相類型的制約[24], 通常情況下, 文石質(zhì)殼體內(nèi)Mg元素含量較低, 為100～450 mg/kg, 而方解石質(zhì)殼體內(nèi)Mg元素含量則較高, 且范圍更廣[25]。因此, 研究殼質(zhì)元素組成有利于進一步闡釋殼質(zhì)結(jié)構。

[1] 常亞青. 貝類增養(yǎng)殖學[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社,2007: 91.

[2] 丁君, 常亞青, 張婧, 等. 蝦夷扇貝象牙白品系與普通品系營養(yǎng)成分分析及評價[J]. 中國農(nóng)業(yè)科技導報,2011, 13(2): 121-128.

[3] 趙鵬, 丁君, 常亞青. 兩種殼色蝦夷扇貝殼體尺性狀對活體重影響效果的分析[J]. 大連海洋大學學報,2011, 26(1): 1-5.

[4] 李文姬, 譚克非. 日本解決蝦夷扇貝大規(guī)模死亡的啟示[J]. 水產(chǎn)科學, 2009, 28(10): 609-612.

[5] 張明, 劉項峰, 李華琳, 等. 黃海北部蝦夷扇貝吊耳養(yǎng)殖技術研究[J]. 水產(chǎn)科學, 2011, 30(12): 726-730.

[6] 常亞青, 陳曉霞, 丁君, 等. 蝦夷扇貝(Mizuhopecten yessoensisJay)5個群體的遺傳多樣性[J]. 生態(tài)學報,2007, 27(3): 1145-1152.

[7] 韓斐斐, 張繼彪, 李莉, 等. 蝦夷扇貝養(yǎng)殖群體及其子代的遺傳多樣性分析[J]. 海洋科學, 2012, 36(9):1-8.

[8] 沈妍, 劉偉, 湛垚垚, 等. 蝦夷扇貝性腺和閉殼肌蛋白質(zhì)雙向電泳分析[J]. 海洋科學, 2014, 38(6): 10-16.

[9] 張婧, 常亞青, 丁君, 等. 蝦夷扇貝不同殼色間的遺傳結(jié)構及微衛(wèi)星標記與生長性狀相關分析[J]. 中國農(nóng)學通報, 2011, 27(26): 83-91.

[10] 陳金華. 雙殼類殼質(zhì)超微結(jié)構及其研究現(xiàn)狀[J]. 古生物學報, 1985, 24(5): 463-476.

[11] Isabel Z, Jaime D P, Antonio V. The shell microstructure, mineralogyy and isotopic composition ofAmussiopecten baranensis(Pectinidae, Bivalvia) from the miocene of span: a valuable paleoenvironmental tool[J]. Geobios, 1996, 29(6): 707-724.

[12] Carter J G. Skeletal biomineralization: Patterns,Processes and Evolutionary Trends[M]. Van Nostrand:Reinhold Press, 1990, 117-133.

[13] Boggild O B. The shell structure of the mollusks[J]. K dansk Vidensk Selsk-Skr, 1930, 2: 232-325.

[14] 梁艷, 趙杰, 吳承偉. 不同生長期貝殼的結(jié)構和力學性能[J]. 復合材料學報, 2011, 28(3): 121-126.

[15] 馮偉民. 陸棲肺螺類殼質(zhì)超微結(jié)構的研究及其與半咸水螺殼的對比[J]. 古生物學報, 1991, 30(3):388-395.

[16] 馮偉民. 腹足類個體發(fā)育中殼質(zhì)結(jié)構的變化[J]. 古生物學報, 1994, 33(5): 635-645.

[17] Younis S. Atomic structure and ultrastructure of theMurex troschelishell[J]. Journal of Structural Biology,2012, 180: 539-545.

[18] West K, Andrew C. Shell microstructure of gastropods from lake Tanganyika, Africa: adaptation, convergent evolution, and escalation[J]. Evolution, 1996, 50(2):672-681.

[19] Dauphin Y, Denis A. Structure and composition of the aragonitic crossed lamellar layers in six species of Bivalvia and Gastropoda[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part A, 2000, 126: 367-377.

[20] Villagran X S, Rosa M. P. A new form of needle-fiber calcite produced by physical weathering of shells[J].Geoderma, 2014, 213: 173-177.

[21] Carter J G. Skeletal biomineralization: Patterns,Processes and Evolutionary Trends[M]. Van Nostrand.Reinhold Press, 1990, 117-133.

[22] Bandel K. Ubergange von einfacheren Strukturtypen zur Kreuzlamellenstru ktur bei Gastropodenschalen[J].Biomin Forsch Ber, 1979, 10: 9-38.

[23] 劉娟花, 胡世偉, 李世杰, 等. 插核手術對馬氏珠母貝中礦物元素的影響[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學, 2011, 50(5):1012-1014.

[24] 張愛濱, 劉升發(fā), 范德江, 等. 膠州灣雙殼類殼體中的Ca, Mg, Mn, Sr元素組成及影響因素[J]. 中國海洋大學學報, 2006, 36(5): 829-835.

[25] Cravo A, Foster P, Bebianno M J. Minor and trace elements in the shell ofPatella aspera(RLding 1798)[J].Environment Interna-tional, 2002, 28: 295-302.