董冰冰, 黃榮蓮, 王慶恒, 鄭 哲, 焦 鈺, 鄧岳文, 杜曉東

(廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院 廣東省珍珠養(yǎng)殖與加工工程技術(shù)研究中心, 廣東 湛江 524088)

生態(tài)系統(tǒng)對地球環(huán)境的變化的應(yīng)對, 以及對氣候和人類社會的反作用是目前重大研究課題之一。陸生生物及生態(tài)系統(tǒng)應(yīng)對環(huán)境變化的研究已有較多研究。例如應(yīng)用開放式空氣 CO2濃度增高(free-air CO2enrichment, FACE) 和開放式溫度升高(free-air temperature increase, FATI)技術(shù)獲得陸生性植物和群落應(yīng)對環(huán)境變化的各種信息[1]?？諝夂秃Ｑ蟊砻媸蔷o密相關(guān)的, 過去觀測到的大氣變化與如今海洋中發(fā)生的變化類似。20世紀(jì)后期海洋表面無機碳水平以及溫度比50~200年前顯著升高[2]。當(dāng)前海水表層的 CO2濃度(體積分?jǐn)?shù)約 788×10–6)已達(dá)到工業(yè)革命前(280×10–6)的 2倍多, 相應(yīng)的海水 pH 下降了 0.1;預(yù)計到21世紀(jì)末海水pH會繼續(xù)下降0.3~0.4[3-5]; 隨著大氣CO2濃度升高, 海水pH預(yù)計在2300年可能還會降低 0.7[6]。CO2的增加影響海水的碳酸鹽平衡系統(tǒng), 減少CaCO3形成, 預(yù)測結(jié)果顯示到2100年海洋鈣沉積(鈣化)將減少14%~30%[7]。研究表明, 礦化類群將遭受海洋環(huán)境變化的重大影響[8]。

生物礦化是在有機大分子(蛋白質(zhì)、糖蛋白或多糖)調(diào)控下無機礦物在特定部位有序沉淀的過程, 其無機相受到有機相的精確調(diào)控[9]。貝殼是典型的生物礦化產(chǎn)物, 一般而言, 外套膜組織首先分泌角質(zhì)層形成相對封閉的外套膜外液腔, 當(dāng)腔內(nèi)礦化相關(guān)的有機組分以及 Ca2+濃度達(dá)到一定的水平, 晶體開始形成并不斷沉積形成貝殼。貝殼中的蛋白組分是形成不同的結(jié)晶及晶體形貌特征的關(guān)鍵要素[10]。目前已經(jīng)鑒定獲得貝殼基質(zhì)蛋白有上百種, 如已經(jīng)完成全基因組測序的長牡蠣(Crassostrea gigas)和帽貝(Lottia gigantea)分別鑒定獲得239種[11]和569種貝殼蛋白[12]。馬氏珠母貝是我國海水珍珠培育的主要品種, 養(yǎng)殖的“南珠”占我國海水珍珠產(chǎn)量的90%以上。馬氏珠母貝貝殼有文石和方解石兩種晶型, 分別構(gòu)成了珍珠層和棱柱層兩種結(jié)晶形態(tài)。普遍認(rèn)為, 珍珠層和棱柱層分別由外套膜組織的中央膜區(qū)(mantle center, MC)和邊緣膜區(qū)(mantle edge, ME)分泌形成[13]; 而人工育珠通過植入外套膜上皮組織小片,經(jīng)細(xì)胞增殖形成封閉的珍珠囊, 從而分泌形成珍珠,因此珍珠也被稱為“圓形貝殼”, 即貝殼中珍珠層與珍珠囊分泌的珍珠層晶體結(jié)構(gòu)一致, 外套膜上皮與珍珠囊上皮組織的功能也被認(rèn)為具有一定的相似性[14]。目前已經(jīng)鑒定獲得部分與珍珠層和棱柱層形成相關(guān)的特有功能蛋白, 如珍珠層相關(guān)的MSI60[15]、pif177[16]、nacrein[17]、pearlin[18]和棱柱層相關(guān)的 prismalin-14[19]、MSI30[20]、aspein[21]。RNA干擾實驗證明Pif表達(dá)量的變化直接影響珍珠層晶體形貌[16,22]。Nacrein蛋白在礦物中的分布以及其高級結(jié)構(gòu)顯示其促進(jìn)晶體的成核[23]。Pearlin屬于文石層間基質(zhì)蛋白, 能將鈣離子呈遞給正在成核的文石層, 參與珍珠層的形成[24]。

據(jù)報道, 海洋酸性環(huán)境變化對對馬氏珠母貝的發(fā)育產(chǎn)生較大影響, 酸化實驗組 D 型幼蟲較對照組殼長和殼高明顯偏小, 殼長增長緩慢[25]; 海水pH和溫度變化對馬氏珠母貝珍珠質(zhì)形成相關(guān)基因nacrein表達(dá)具有顯著影響[26]。以上研究都未對貝殼晶體微結(jié)構(gòu)是否發(fā)生變化做進(jìn)一步的分析。本研究模擬未來海洋酸化環(huán)境, 應(yīng)用實時熒光定量 PCR(Real-time PCR)技術(shù)檢測馬氏珠母貝外套膜中央?yún)^(qū)pif177、nacrein及pearlin基因的表達(dá), 結(jié)合掃描電子顯微鏡技術(shù)(SEM)觀察貝殼珍珠層中晶體形態(tài)結(jié)構(gòu), 分析和探討海洋酸化對馬氏珠母貝珍珠層形成的影響以及在基因表達(dá)水平上的響應(yīng), 以期為揭示海洋環(huán)境變化對珍珠貝生物礦化的影響和珍珠養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用馬氏珠母貝為項目組培育的馬氏珠母貝選系F5, 于2013年7月取自廣東湛江徐聞縣西連鎮(zhèn)承梧村的養(yǎng)殖基地(養(yǎng)殖海區(qū)pH 8.2, 鹽度31), 清洗表面附著物后帶回實驗室, 在65 L水箱中馴養(yǎng)。實驗海水為取自養(yǎng)殖海區(qū)的天然海水, 過濾后使用,馴養(yǎng)過程中每天定時換水, 馴養(yǎng) 2 d, 整個馴養(yǎng)過程水溫為28℃±0.5℃, pH為8.20±0.1, 鹽度為31。馴化結(jié)束后, 取規(guī)格一致, 殼高5~6 cm個體進(jìn)行實驗。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗設(shè)計

實驗設(shè)對照組(CG)和2個實驗組(E)。其中, CG以上述天然海水(pH 8.2)養(yǎng)殖馬氏珠母貝; 實驗組根據(jù)模型預(yù)測的 2100年與 2300年的 CO2的積累濃度[4-6,27], 分別調(diào)節(jié)海水 pH為 7.7(實驗一組, E1)和7.4(實驗二組, E2)。pH調(diào)節(jié)參考Reynaud等[28]和其他研究的方法[8,29], 通過向海水中充入高純 CO2氣體加以控制, 使用沃米特pH酸堿度監(jiān)測儀實時監(jiān)測每個水族箱中pH的變動情況, 以保持各組pH的穩(wěn)定。每組用65 L收納箱作為實驗容器, 裝入30 L曝氣一天的海水; 每組10個個體, 養(yǎng)殖72 h后取樣測定。實驗溫度為 28℃±0.5℃, 鹽度為 31。實驗設(shè) 3個平行組。

每個實驗組中隨機取 5個個體, 取外套膜組織的中央膜區(qū), 液氮保存, 提取 RNA, 用于熒光定量PCR分析; 貝殼保存, 用于掃描電鏡觀察分析珍珠層結(jié)晶層形態(tài)特征。

1.2.2 實時熒光定量 PCR(Real-time PCR)

熒光定量引物采用引物設(shè)計軟件Primer Premier 5.0設(shè)計, 設(shè)計原則跨一個內(nèi)含子, 以避免模板中DNA 雜質(zhì)對擴(kuò)增結(jié)果產(chǎn)生干擾,pif177、nacrein、pearlin以及內(nèi)參基因GAPDH的熒光定量引物設(shè)計參考NCBI已收錄的馬氏珠母貝相應(yīng)的基因序列[30]。

馬氏珠母貝中央膜總RNA的提取按照Invitrogen Trizol試劑盒說明書進(jìn)行, 然后進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。實時熒光定量PCR按照SYBR Premix ExTaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus) 說明書要求, 在ABI 7500 Real Time PCR System上進(jìn)行, 其中每個樣品的目的基因和內(nèi)參基因分別進(jìn)行 3 次重復(fù), PCR反應(yīng)體系:SYBR Premix ExTaqTM5 μL, 引物 F 0.5 μL, 引物 R0.5 μL, cDNA 0.5 μL, RNase-free H2O 3.5 μL, , 反應(yīng)體系總體積為10 μL。反應(yīng)程序采用三步法程序: 95℃預(yù)變性 7 min; 95 ℃ 15 s, 57 ℃ 15 s, 72 ℃ 35 s,40個循環(huán), 采集熒光信號; 72~95 ℃獲得熔解曲線。

表1 熒光定量PCR所用的引物序列Tab.1 Primer sequences used for Real-time PCR

利用SPSS 13.0軟件采用t-檢驗分別比較兩個實驗組與對照組間的基因表達(dá)量差異, 顯著性水平設(shè)為P<0.05。

1.2.3 掃描電鏡樣品制備

取上述經(jīng)酸化海水培養(yǎng)的馬氏珠母貝, 將軟體部取出后用超純水清洗貝殼, 在室溫陰涼處干燥。然后用切割機將貝殼生長區(qū)部分(珍珠層與棱柱層的交界)切成1cm×1cm 大小的塊, Hitachi E1010離子濺射儀鍍膜, Hitachi S-4800掃描電子顯微鏡觀察貝殼內(nèi)表面珍珠層形貌。

2 結(jié)果與分析

2.1 貝殼珍珠層形態(tài)比較

利用掃描電鏡觀察三個組的貝殼內(nèi)表面珍珠層差異, 觀察結(jié)果如圖1所示。

CG組(pH 8.2)貝殼珍珠層表面具有清晰的呈階梯狀規(guī)則排列的顯微結(jié)晶層; 每層邊沿為花邊狀,紋理間距平均值 18 μm; 在每層邊沿均有不少游離的文石結(jié)晶, 晶體線性長度平均值為 2.1 μm; 結(jié)晶形態(tài)為六邊形的薄板塊或不規(guī)則多邊形的扁平板塊;結(jié)晶表面光滑平整, 晶體排列緊密, 粒間的界限清晰, 顆粒邊緣平直(圖1A-B)。E1組(pH 7.7)貝殼珍珠層的階梯規(guī)則排列與板塊大小與CG組沒有差別, 近似六變形, 但邊界較為圓滑, 板塊邊界有少量的不規(guī)則生長(圖1C-D)。E2組(pH 7.4)貝殼珍珠層表面不具有階梯狀排列的顯微結(jié)晶層; 邊沿不清晰, 結(jié)晶形態(tài)極不規(guī)則, 結(jié)晶形態(tài)不完整, 晶體板塊凹凸不平, 極少觀察到板塊間連成片(圖1E-F)。

圖1 貝殼珍珠層掃描電鏡照片F(xiàn)ig.1 SEM images of the surface of the nacreous layer of the shell

2.2 海水酸化對pif177基因表達(dá)的影響

利用 Real-time qPCR技術(shù)檢測了馬氏珠母貝pif177基因在外套膜中央?yún)^(qū)的表達(dá), 結(jié)果如圖2所示,隨海水pH下降,pif177基因相對表達(dá)量呈下降趨勢,在 CG(pH 8.2)、E1(pH 7.7)和E2(pH 7.4)相對表達(dá)量的分別為 2.32±0.59、1.86±0.55和 1.19±0.29。其中, 與對照組比較, 實驗二組 pif177基因的表達(dá)出現(xiàn)了顯著下調(diào)(P<0.05)。

圖2 pif177基因在馬氏珠母貝外套膜中央?yún)^(qū)的表達(dá)Fig.2 Expression levels of pif177 in MC of P.martensii

2.3 海水酸化對nacrein基因表達(dá)的影響

如圖3所示, 在海水pH8.2~7.4之間,nacrein基因在馬氏珠母貝外套膜中央?yún)^(qū)的表達(dá)量隨 pH降低而降低, 與pif177基因的變化趨勢類似。CG(pH 8.2)、E1(pH 7.7)和E2(pH 7.4)nacrein基因相對表達(dá)量的具體數(shù)值分別為 16.49±2.00、15.06±4.05和 3.71±1.99。其中, 與CG比較, E2組的nacrein基因的表達(dá)出現(xiàn)了顯著下調(diào)(P<0.05)。

圖3 nacrein在馬氏珠母貝外套膜中央?yún)^(qū)的表達(dá)Fig.3 Expression levels of nacrein in MC of the mantle of P.martensii

2.4 海水酸化對pearlin基因表達(dá)的影響

如圖4所示, 隨著海水pH的逐漸下降,pearlin基因在外套膜中央?yún)^(qū)的表達(dá)整體趨勢與pif177和nacrein基因基本一致: E1(pH 7.7)與CG(pH 8.2)之間無顯著性差異, E2相對于CG顯著下調(diào)(P<0.05)。CG、E1和 E2(pH 7.4)nacrein基因相對表達(dá)量分別為7.33±1.77、8.24±1.85 和 4.49±0.94。

圖4 pearlin在馬氏珠母貝外套膜中央?yún)^(qū)的表達(dá)Fig.4 Expression levels of pearlin in MC of P.martensii.

3 討論

3.1 酸性條件下珍珠層晶體形貌特征變化

海洋生物礦化形成的 CaCO3主要以文石和方解石結(jié)晶形式存在。而海洋酸化造成了文石和方解石飽和度的急劇下降, 這必然影響具有 CaCO3骨架(外殼)或生物鈣化過程的海洋生物[31], 包括珊瑚蟲[32]、軟體動物[33-35]、棘皮動物[36]等。Talmage 和 Gobler通過實驗室模擬海洋酸化發(fā)現(xiàn), 生長于模擬工業(yè)革命前水體 CO2濃度(250×10–6)下的海灣扇貝(Argopecten irradians)和文蛤(Mercenaria mercenaria)具有生長速度快、變態(tài)速度快、貝殼厚而緊實的特點, 而生長在模擬 2100年 CO2濃度(>400×10–6)條件下的海灣扇貝和文蛤不僅存活率降低、生長速度減慢, 貝殼面積顯著減小并呈現(xiàn)溶蝕狀態(tài)[33]。Hahn等[36]研究了CO2等因素對地中海貽貝(Mytilus galloprovincialis)貝殼超微結(jié)構(gòu)的影響, 發(fā)現(xiàn)隨著貝殼的沉淀, 貝殼的超微結(jié)構(gòu)在酸性的海水中出現(xiàn)了紊亂的結(jié)構(gòu); Melzner等[37]通過體視顯微鏡和掃描電鏡觀察在低濃度的藻類餌料和高濃度 CO2環(huán)境下的紫貽貝的貝殼內(nèi)側(cè)文石層發(fā)現(xiàn), 貝殼內(nèi)部珍珠層的形貌都有了一定程度的改變。

外套膜是軟體動物參與貝殼形成和珍珠形成的重要器官。在正常生理狀態(tài)下, 外套膜分泌有機質(zhì)誘導(dǎo)珍珠層的沉積, 所形成的成熟珍珠板塊的形貌特征為規(guī)則六邊形, 生長端小板片堆砌規(guī)則, 小板塊直徑1.3~1.7 μm, 粒徑均勻[38]。而在外界環(huán)境或人為干擾的情況下, 如水壓、食性以及pCO2變化時, 珍珠層出現(xiàn)不規(guī)則生長或“溶解”(dissolution)現(xiàn)象, 微觀的形貌特征表現(xiàn)為不規(guī)則的六邊形或有“缺刻”(bitten crystal)現(xiàn)象[39-40]。本研究結(jié)果表明, 在海水pH值至 7.4時, 對馬氏珠母貝的珍珠層的沉積和晶體的形貌有著顯著影響。由此推測, 海水的酸化將極有可能會影響到海區(qū)養(yǎng)殖珍珠的質(zhì)量。

3.2 酸性條件下與珍珠層形成相關(guān)的礦化基因的表達(dá)變化

Fabry[41]認(rèn)為海洋生物體應(yīng)對機體本身生理狀態(tài)下產(chǎn)生的 CO2和氫離子具有相同的機制, 即(1)構(gòu)建細(xì)胞內(nèi)部和外部溶液的被動式緩沖體系(passive buffering); (2)運輸和交換相關(guān)離子; (3)具有呼吸色素分子的種類通過血液運輸CO2; (4)降低代謝。一些在高 CO2濃度下生存的物種通過長期進(jìn)化, 體內(nèi)的緩沖、離子交換和 CO2運輸能力上都獲得加強[42]。通常認(rèn)為, 軟體動物的有殼種類通過貝殼的溶解,Ca2+重新回到體液中, 從而緩沖由于過多 CO2而導(dǎo)致的體內(nèi)pH的下降。值得注意的是, 從珍珠層的材料學(xué)性能而言, 體內(nèi)或體液中pH下降并不是導(dǎo)致貝殼結(jié)晶形態(tài)變化的直接原因, 貝殼礦化相關(guān)的蛋白和酶的變化才是關(guān)鍵因素。本研究利用 Real-time PCR技術(shù)檢測了與珍珠層形成相關(guān)的3個礦化基因:pif177、nacrein及pearlin, 其中pif177[16]和pearlin[18]與文石晶體成核相關(guān);nacrein含碳酸酐酶結(jié)構(gòu)域[17]。在外套膜的MC區(qū),pearlin的表達(dá)均表現(xiàn)為先升高后下降的趨勢。其中, 當(dāng)養(yǎng)殖海水pH由8.2下降到7.7,pif177與nacrein在 MC區(qū)的表達(dá)呈下降的趨勢,pearlin則略為上升, 但三者都與對照組無顯著差異;下降至pH7.4時, 與空白對照相比,nacrein則出現(xiàn)顯著性下調(diào)(P<0.05)。nacrein的表達(dá)變化與劉文廣和何毛賢的研究結(jié)果相似[26]。在其他低等無脊椎動物中, 礦化基因的表達(dá)同樣受海洋酸性環(huán)境變化的影響。Todgham和Hofmann通過分析比較正常海水和酸化海水培養(yǎng)的紫球海膽(Strongylocentrotus purpuratus)浮游幼體轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn), 在海洋酸化條件下(pH7.96; pH7.88), 紫球海膽浮游幼體中有23個參與生物礦化的相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生了顯著變化[43]。

3.3 珍珠層形成過程中礦化體系的動態(tài)平衡與對酸化環(huán)境的響應(yīng)

綜合以上研究, 海洋酸化對馬氏珠母貝貝殼珍珠層的形成的影響是十分明顯的, 在一定程度上會影響珍珠產(chǎn)量和質(zhì)量的提高。在pH 7.7處理組海水pH值接近我國南海海區(qū)的 pH正常變化范圍(7.5~8.5)[44]中, 珍珠層的晶體形貌和礦化基因的表達(dá)未發(fā)生明顯變化; 而 pH7.4處理組無論在珍珠層晶體形貌還是礦化基因的表達(dá)都發(fā)生了顯著變化,說明在此酸性條件下, 馬氏珍珠貝已經(jīng)通過調(diào)節(jié)自身的礦化系統(tǒng)來應(yīng)對這一環(huán)境變化。對于正常狀態(tài)下穩(wěn)定的礦化體系, 存在正向(CaCO3結(jié)晶)和反向(結(jié)晶 CaCO3溶解)調(diào)控體系[45]。當(dāng)外界環(huán)境變化或人為干擾的情況下, 礦化正向被抑制, 如本研究中的碳酸酐酶家族成員nacrein表達(dá)下調(diào), 從而降低了CO2向的轉(zhuǎn)化效率, 珍珠質(zhì)特有基質(zhì)蛋白pif177和pearlin基因的下調(diào), 對Ca2+的利用將減少,導(dǎo)致珍珠層出現(xiàn)不結(jié)晶或異常結(jié)晶現(xiàn)象, 以此來緩解體內(nèi)pH的升高。另一方面, 已有報道顯示, 水溫在 11℃以下或是 29℃以上時, 人工培育的珍珠會出現(xiàn)溶解現(xiàn)象, 珍珠質(zhì)的分泌停滯[46]。從珍珠層的材料學(xué)性能及能量學(xué)角度分析, 與珍珠層形成相似, 晶體溶解應(yīng)當(dāng)需要酶等相關(guān)蛋白的參與。遺憾的是礦化體系的反向機制的研究相對滯后。

如何提高珍珠貝的珍珠層質(zhì)量是珍珠產(chǎn)業(yè)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本實驗的研究結(jié)果顯示, 酸化條件下, 在短期內(nèi)已對珍珠層的質(zhì)量產(chǎn)生了一定的影響。對于海區(qū)養(yǎng)殖品種而言, 長期處于酸性環(huán)境下, 珍珠層所受影響以及生物體本身適應(yīng)性等問題, 都將是未來關(guān)注的焦點。系統(tǒng)的工作已經(jīng)在其他海洋低等生物中開展。Lohbeck等[47]報道, 海洋球石藻經(jīng)過約500次無性繁殖后, 生存狀態(tài)都變差, 但處于高濃度二氧化碳條件下的藻類卻表現(xiàn)出更高的生長速率以及鈣化物質(zhì)的部分復(fù)原。Pespeni等[48]報道紫球海膽(S.purpuratus)生長狀況良好, 并未出現(xiàn)不良狀況, 經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)其基因組發(fā)生了大量變異, 說明其以進(jìn)化的方式適應(yīng)了海洋酸化所帶了的環(huán)境變化。因此, 有必要更進(jìn)一步系統(tǒng)深入研究海洋酸化對珍珠層產(chǎn)生影響的機理, 為珍珠養(yǎng)殖業(yè)乃至整個海洋貝類養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展提供必要的理論基礎(chǔ)。

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