周愛國 , 謝少林 , 陳金濤 , 陳言峰, 鄒記興

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院, 廣東 廣州 510642; 2.清遠(yuǎn)市北江水產(chǎn)科學(xué)研究所, 廣東 清遠(yuǎn) 511510;3.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院, 廣東 佛山 528231)

核糖體DNA ITS1(The first internal transcribed spacer of ribosomal DNA, rDNA)基因是位于18S與5.8S rDNA的間隔區(qū), 進(jìn)化速率中等, 是研究近源種、復(fù)合種及種內(nèi)生物型間親緣關(guān)系和系統(tǒng)發(fā)育的良好分子標(biāo)記, 對于種間分化時間短, 親緣關(guān)系較近的石斑魚物種, 該標(biāo)記可以很好揭示其物種間的親緣關(guān)系[1]。然而, 目前關(guān)于 ITS1序列的研究主要集中在無脊椎動物和植物[2-6]。在魚類研究上也有相應(yīng)的報道, Pleyte 等[7]采用ITS1標(biāo)記對鮭屬魚類7個種研究, 發(fā)現(xiàn)其系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析結(jié)果與形態(tài)學(xué)、同工酶等研究結(jié)果一致。而邱凡等[8]利用ITS1 部分序列研究鯖科(Scombrida)魚類時發(fā)現(xiàn)其系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系與形態(tài)學(xué)上的分類結(jié)果存在分歧, 并對鯖科魚類分類關(guān)系進(jìn)行了澄清; 國外學(xué)者也將 ITS1 部分序列成功應(yīng)用到魚類系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化分析中, 解決了一些物種長期存在爭議的分類問題[9-10]。張源真等[11]利用 ITS-1序列分析部分鳚亞目魚類的分子系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系時發(fā)現(xiàn)研究結(jié)果與形態(tài)學(xué)分類一致, 種間具有高度變異性, 可以作為物種分類及鑒別的分子依據(jù)。而利用ITS1序列作為分子遺傳標(biāo)記對石斑魚進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的研究相對較少。Guo等[12]研究云紋石斑魚(Epinephelus moara)和褐石斑魚(E.bruneus)的親緣關(guān)系時發(fā)現(xiàn)核糖體DNA ITS1 序列是一種穩(wěn)定可靠的分子標(biāo)記。

本研究旨在利用rDNA ITS1序列作為分子鑒定手段以區(qū)別形態(tài)上較為相似的 5種石斑魚(青石斑魚(E.awoara)、點帶石斑魚(E.malabaricus)、六帶石斑魚(E.sexfasciatus)、寶石石斑魚(E.areolatus)、巨石斑魚(E.tauvina)種類, 并以麗魚科(Cichlidae),羅非魚屬(Oreochromis)的尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)為外群, 構(gòu)建 3種分子系統(tǒng)樹, 以期從分子水平獲得這 5種石斑魚的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系, 為生產(chǎn)上的良種選育和雜交選配提供分子生物學(xué)方面的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料的種類及來源見表1, 其中外群尼羅羅非魚的序列來自GenBank。

表1 研究材料種類及其來源Tab.1 The species and sources of materials

1.2 試驗方法

1.2.1 總DNA提取

取適量尾鰭或肌肉組織, STE洗滌3次, 離心條件為3 000 r/min, 每次離心10 min; 倒去上清, 將組織轉(zhuǎn)移到滅菌的勻漿器中, 加入 1 mL STE, 勻漿;將勻漿后的組織懸液轉(zhuǎn)移至5 mL EP管, 加入3 mL細(xì)胞裂解液, 搖勻直至出現(xiàn)黏狀物; 加入質(zhì)量濃度為10 mg/mL的RNase A至終質(zhì)量濃度20 μg/mL, 于37℃消化3 h; 加入質(zhì)量濃度為20 mg/mL的蛋白酶K 至終質(zhì)量濃度 100 μg/mL, 50℃消化過夜; 次日以酚/酚-氯仿/異戊醇-氯仿/異戊醇各抽提 1次; 冰乙醇沉淀, 用吸頭挑出DNA沉淀, –20℃70%乙醇洗1次, 置 4℃冰箱中使之緩慢干燥; 干燥后溶于適量TE中, 用紫外分光光度計測定其純度及濃度。

1.2.2 PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增所用引物為自行設(shè)計: 正向引物:5’-GTTCCCCTTGAACGAGGA ATTC-3反向引物:5’-CGCATTTCGCTGCGTTCTTC-3’, 它們分別為18SrDNA的5’端和5.8SrDNA的3’端的保守序列, 由上海生物工程公司合成。PCR擴(kuò)增反應(yīng)參照Williams等[13]、Welsh[14]的方法。每一樣品的反應(yīng)總體積50 μL, 其中包括6 μL PCR緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl, pH9.0, 50 mmol/L KCl, 22.5 mmol/L MgCl2,0.01%的明膠), 2 μL dNTP混合液(每種 dNTP 0.1 mmol/L), 4 μL 的引物(0.2 μmol/L), 4μL 基因組DNA(50 ng/uL), 2 μL Taq酶(2單位), 32 μL 的蒸餾水。擴(kuò)增反應(yīng)條件為: 95℃ 預(yù)變性10 min, 94℃ 變性60 s, 50℃退火30 s, 72℃延伸1.5 min, 共計40個循環(huán), 最后72℃延伸10 min。

1.2.3 DNA序列測定

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 2.0%的低熔點瓊脂糖回收純化, 克隆于M13噬菌體載體, 具體方法參見金冬雁等[15]。樣品委托上海聯(lián)合基因公司進(jìn)行雙向測序, 序列測定儀器為3700型Bigdye-Terminator全自動序列分析儀。

1.2.4 DNA序列的數(shù)據(jù)處理

用BioEdit軟件[16]對測序結(jié)果進(jìn)行編輯, 然后用CLUSTL X軟件[17]對尼羅羅非魚(O.niloticus)與本文所得 5種石斑魚序列進(jìn)行序列重排和同源比較。手工校正后, 通過PAUP 4.0軟件[18]對序列結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析, 分別用最大簡約法(Maximum parsimony method, MP法)和鄰接法(Neighbor-Joining mehtod,NJ法)構(gòu)建分子系統(tǒng)樹; 通過Pullze軟件[19]用最大似然法(Maximum Likelihood method, ML法)構(gòu)建分子系統(tǒng)樹。用“Bootstrap” 1000次檢驗各系統(tǒng)樹分支的置信度。用Phylip 5.72軟件[20]中的DNAdist.exe程序分別計算基于 Kimura-2雙參數(shù)模型和 Jukes-Cantor單參數(shù)模型的遺傳距離。

2 結(jié)果

2.1 PCR結(jié)果

5種石斑魚樣品(青石斑魚、點帶石斑魚、六帶石斑魚、寶石石斑魚、巨石斑魚)經(jīng)PCR擴(kuò)增都分別得到約 800 bp(包括引物)的目的條帶(圖1), 測序獲得的序列于NCBI進(jìn)行在線比對分析, 證明是rDNA ITS1區(qū)序列。

圖1 5種石斑魚樣品rDNA ITS1區(qū)序列PCR擴(kuò)增檢測結(jié)果Fig.1 PCR results of rDNA ITS1 regions of 5 kinds of groupers

2.2 序列組成分析和遺傳距離

測出的 5種石斑魚 ITS1區(qū)序列長度范圍為805~814 bp, 其中 18S rDNA長度為 214 bp, 5.8S rDNA長度為63 bp, 這兩類rDNA序列在被測的5種石斑魚上完全一致, 產(chǎn)生序列變異的ITS1長度分別為: 青石斑魚536 bp、點帶石斑魚537 bp、六帶石斑魚528 bp、寶石石斑魚532 bp、巨石斑魚535 bp。

所分析的5個石斑魚樣品rDNA ITS1序列的堿基組成比較接近(表2), 整個堿基組成中A+T的含量低于 C+G的含量, 其中, A+T含量最低為寶石石斑魚(37.6%), 最高為六帶石斑魚 41.5%; 單個堿基組成中, A的含量較低, C的含量較高, A含量最低為寶石石斑魚(17.3%), C含量最高為點帶石斑魚和青石斑魚, 均為33%。

表2 5種石斑魚rDNA ITS1序列的堿基組成Tab.2 Base composition of rDNA ITS1 sequences of 5 Kinds of groupers

利用Kimura-2雙參數(shù)模型計算的5種石斑魚之間的遺傳距離在 0.0000~0.3002, 其中, 寶石石斑魚與青石斑魚的遺傳距離最大(0.3002), 而點帶石斑魚與青石斑魚的遺傳距離幾乎為 0.0000; 用 Jukes-Cantor單參數(shù)模型計算的 5種石斑魚的遺傳距離在0.0000~0.2970, 也是寶石石斑魚與青石斑魚的遺傳距離最大(0.2970), 而點帶石斑魚與青石斑魚的遺傳距離幾乎為0.0000。從表3可以看出2種遺傳模型計算的結(jié)果基本一致, 說明這5種石斑魚rDNA ITS1序列的堿基平均轉(zhuǎn)換數(shù)與顛換數(shù)之比約為1.5。

表3 基于兩種參數(shù)模型5種石斑魚各種間rDNA ITS1序列的遺傳距離Tab.3 Genetic distances of rDNA ITS1 sequences among 5 kinds of groupers based on two parameter models.

2.3 分子系統(tǒng)進(jìn)化分析

所測定的 5種石斑魚 rDNA ITS1序列經(jīng)CLUSTL X軟件[12]進(jìn)行序列重排后, 總位點593個,其中可變位點324個, 信息位點45個, 缺失位點56~65個(圖2)。運用PAUP 4.0軟件以麗魚科(Cichlidae)、羅非魚屬的尼羅羅非魚作外群, 基于 MP法構(gòu)建rDNA ITS1序列的分子系統(tǒng)樹(圖3)。5種石斑魚逐級聚類: 點帶石斑魚與形態(tài)最為相似的青石斑魚首先聚到一起, 然后與形態(tài)相似的巨石斑魚和六帶石斑魚分別先后聚到一起, 最后與形態(tài)差異稍大的寶石石斑魚聚到一起, 置信度為 76%~100%, 而這 5種石斑魚與外群尼羅羅非魚聚合的置信率不到 5%, 所以在樹上不顯示; 根據(jù)上述位點信息, 設(shè)定 rDNA ITS1序列不同位點的進(jìn)化是獨立事件, 生成數(shù)據(jù)矩陣, 用 ML法, 似然步數(shù)為 1000, 構(gòu)建 rDNA ITS1序列的分子系統(tǒng)樹(圖4), 與依據(jù)Kimura 2-parameter model估算遺傳距離, 用NJ法構(gòu)建的分子系統(tǒng)樹(圖5)分支結(jié)構(gòu)完全一致, 而且這兩種樹與用MP法構(gòu)建的分子系統(tǒng)樹也一致, 同樣, 外群無法顯示, 說明它與這 5種石斑魚明顯不是一類, 結(jié)果是可靠的。MP法、ML法和NJ法構(gòu)建的3種分子系統(tǒng)樹5種石斑魚聚類結(jié)果一致, 充分地反映了 5種石斑魚種間分子系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。

圖2 排序后的5種石斑魚與外群尼羅羅非魚rDNA ITS1序列(黑體為特征序列或堿基)Fig.2 rDNA ITS1 sequences of 5 species of grouper and the outgroup O.niloticus after alignment(The black words denote the characteristic regions or bases)

圖3 基于rDNA ITS1序列利用MP法構(gòu)建5種石斑魚的分子系統(tǒng)樹Fig.3 The molecular phylogenetic tree of 5 kinds of groupers based on rDNA ITS1 sequences constructed using MP method

圖4 基于rDNA ITS1序列利用ML法構(gòu)建5種石斑魚的分子系統(tǒng)樹Fig.4 The molecular phylogenetic tree of 5 kinds of groupers based on rDNA ITS1 sequence constructed using ML method

圖5 基于rDNA ITS1序列利用NJ法構(gòu)建5種石斑魚的分子系統(tǒng)樹Fig.5 The molecular phylogenetic tree of 5 kinds of groupers based on rDNA ITS1 sequences constructed using NJ method

3 討論與結(jié)論

3.1 rDNA ITS區(qū)序列特點及5種石斑魚的ITS1序列及其遺傳距離比較

核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(rDNA ITS)序列是國際上公認(rèn)的種屬以下的分類、種質(zhì)鑒別與系統(tǒng)關(guān)系分析上是比較穩(wěn)定和理想的分子遺傳標(biāo)記[3,21]。ITS區(qū)序列包括 ITS1、ITS2, 由于 ITS區(qū)序列不加入成熟核糖體, 所以受到的選擇壓力較小, 進(jìn)化速率較快, 可從較短的序列中獲得較多的系統(tǒng)發(fā)育信息, 對魚類種間、亞種和種群水平上的區(qū)分鑒定比較實用[22]。已有研究表明ITS1是rDNA中變異較大的區(qū)域[23], 在無脊椎動物的系統(tǒng)分類和分子系統(tǒng)進(jìn)化分析上得到廣泛應(yīng)用[21,24-26]。在魚類研究方面, 徐暉等[27]在分析6種舌鰨亞科魚類ITS1序列長度多態(tài)性及其系統(tǒng)發(fā)育分析時發(fā)現(xiàn)舌鰨亞科魚類ITS1區(qū)具有明顯的長度多態(tài)性。孫玉華等[28]在亞口魚科魚類核 DNA 18S-ITS1-5.8 S序列比較分析中也得到了這一結(jié)論。郭奕惠等[29]對 5種羅非魚的 ITS1及其兩側(cè)的18sRNA和5.8sRNA部分序列特征進(jìn)行了分析, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)羅非魚ITS1序列多態(tài)性較高。Sajdak等[30]利用ITS-1序列構(gòu)建了較大范圍的白鮭種類的系統(tǒng)發(fā)育樹。鐘立強(qiáng)等[31]利用 ITS-1 序列有效的分析了4個鯉魚種群的遺傳變異。盡管ITS1做為分子系統(tǒng)進(jìn)化具有很多優(yōu)點, 但在魚類研究相對比較局限。

5種石斑魚ITS1序列的長度在528 bp ~537 bp,點帶石斑魚只比青石斑魚多了一個堿基A, 青石斑魚比巨石斑魚多1個堿基, 是由于青石斑魚存在CAG3個堿基, 巨石斑魚在相應(yīng)的地方缺失, 巨石斑魚存在TT兩個堿基而青石斑魚相應(yīng)的地方缺失所造成。六帶石斑魚的 ITS1序列(528bp)和寶石石斑魚的 ITS1序列(532 bp)相對較短, 但可以找到相應(yīng)的特征性序列以區(qū)別于其他種石斑魚。六帶石斑魚的特征性序列為: 5’-ATAATGATGATGATGATGATGT-3’, 22bp;寶石石斑魚的特征性序列為: 5’-TTGCGGCGGGGTCCTCCAACCCCTCCTT-3’, 28 bp。5 種石斑魚這一序列特征可在其遺傳距離上得到反映: 點帶石斑魚與青石斑魚只有 1個堿基的差別, 兩種魚的遺傳距離趨近于0.0000; 巨石斑魚與青石斑魚和點帶石斑魚分別只有1和2個堿基的差別, 與這兩種魚的遺傳距離都只有0.0085。六帶石斑魚與上述3種石斑魚的遺傳距離都小于0.1000, 而寶石石斑魚與其他4種石斑魚的遺傳距離都大于 0.2800。由此可將 5種石斑魚分成3類: 形態(tài)與點帶石斑魚很相似的有青石斑魚、巨石斑魚; 形態(tài)與點帶石斑魚相似的有六帶石斑魚; 形態(tài)與點帶石斑魚有些相似的為寶石石斑魚。對于形態(tài)難以區(qū)分的種類可用其特征序列進(jìn)行識別。

3.2 5種石斑魚的分子系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系

依據(jù)體色、花紋等形態(tài)特征對石斑魚進(jìn)行分類的難度是從所周知的事實。本研究選擇的 5種石斑魚, 除寶石石斑魚成魚階段可依據(jù)形態(tài)鑒別外, 其他4種形態(tài)均十分相似(表4), 尤其是俗稱“青斑”的3種, 雖序列上可以看出它們的區(qū)別, 但苗種生產(chǎn)需要了解石斑魚間的系統(tǒng)關(guān)系, 即遺傳背景, 以便為良種選配和遺傳保護(hù)提供依據(jù)。

表4 5種石斑魚的主要形態(tài)特征Tab.4 Major morphological characters of five species of groupers

研究的 5種石斑魚主要分布于太平洋西部和印度洋北部的廣泛海域, 在中國主要分布于南海(表1)。利用MP、ML、NJ 3種方法構(gòu)建的分子系統(tǒng)樹與遺傳距離和形態(tài)分析的結(jié)果高度一致, 這說明系統(tǒng)樹聚類的正確性, 同時表明點帶石斑魚在進(jìn)化上與青石斑魚分化較晚, 而寶石石斑魚在進(jìn)化上與點帶石斑魚和青石斑魚的分化相對較早。在遺傳育種研究及良種培育生產(chǎn)上, 應(yīng)避免點帶石斑魚與形態(tài)相似的青石斑魚和巨石斑魚間進(jìn)行交配, 由此導(dǎo)致遺傳多樣性的丟失, 影響物種的生存力。研究的5種石斑魚rDNA ITS1 序列分別與它們的形態(tài)呈同步進(jìn)化的關(guān)系, 而在石斑魚 mtDNA Cytb序列的研究發(fā)現(xiàn), mtDNA Cytb序列的進(jìn)化與形態(tài)有些不一致的現(xiàn)象[32-33], 說明mtDNA Cytb序列的進(jìn)化與rDNA ITS1序列的進(jìn)化, 可能采取的是兩種不同的進(jìn)化軌跡。比較而言, rDNA ITS1 序列作為研究石斑魚分子系統(tǒng)進(jìn)化的遺傳標(biāo)記, 比mtDNA Cytb序列更為理想, 遺憾的是沒有更多的序列可供比較。但就 5種石斑魚而言, 俗稱“青斑”的3種石斑魚分化時間較晚, 在系統(tǒng)進(jìn)化上具有高度的一致性, 應(yīng)避免它們之間的彼此混交, 而這正是我們生產(chǎn)中所要注意到的問題。

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