徐 偉, 梁 源, 陳 敏, 王 寧

(煙臺(tái)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 山東 煙臺(tái)264005)

在光合系統(tǒng)中捕光復(fù)合物(light-harvesting complex, LHC)的功能是負(fù)責(zé)吸收和傳遞光能, 并將激發(fā)能經(jīng)特定的方式和途徑傳遞給反應(yīng)中心用于光合作用。綠色植物和雜色植物的LHC分別為脂溶性的葉綠素(Chl)a/b-蛋白復(fù)合物和 Chl a/c-蛋白復(fù)合物, 而紅藍(lán)植物為水溶性的藻膽蛋白, 可以確定它們均以不同的方式結(jié)合于葉綠體的類囊體膜上[1]。但雜色植物隱藻卻非常特殊, 除了膜上的 Chl a/c2-蛋白復(fù)合物外, 還含有水溶性的藻膽蛋白。與紅、藍(lán)藻中的藻膽蛋白相比, 隱藻藻膽蛋白有許多特異之處: 只含有隱藻藻紅蛋白(Cr-PE)或隱藻藻藍(lán)蛋白(Cr-PC), 不含異藻藍(lán)蛋白(APC); 通常以二聚體(α1α2ββ)形式存在, 而非三聚體或六聚體; 不形成藻膽體樣結(jié)構(gòu)等等。而最突出的差別是隱藻藻膽蛋白存在于類囊體腔內(nèi), 而不像藻膽體那樣附著于類囊體膜外表面[2-3]。但目前對(duì)于隱藻藻膽蛋白在膜腔內(nèi)的存在狀態(tài), 以及與膜的關(guān)系卻爭(zhēng)議很大。主要有以下幾種看法: (1)緊密結(jié)合在類囊體膜的內(nèi)表面上[4]; (2)一部分與膜結(jié)合, 其余游離或者散布在類囊體腔中[5]; (3)以某種方式結(jié)合并橫跨膜腔內(nèi)部, 邊緣與光合系統(tǒng) II(PSII)接觸并為其提供能量[6]; (4)均勻地填充于類囊體腔中,彼此之間以及與膜上 Chl-蛋白復(fù)合物之間沒(méi)有傾向性的結(jié)合關(guān)系[7-8]。

目前, 與研究較為透徹的紅、藍(lán)藻藻膽蛋白及藻膽體相比, 對(duì)隱藻藻膽蛋白的了解要少得多, 尤其是隱藻藻膽蛋白與膜上另一套捕光復(fù)合物 Chl a/c2-蛋白復(fù)合物以及PSI和PSII反應(yīng)中心之間的相互接觸方式不明, 使能量傳遞機(jī)制更無(wú)法最終確定。作者以含有隱藻藻藍(lán)蛋白 PC645的藍(lán)隱藻(Chroomonas placoidea)為材料, 根據(jù)室溫和低溫光譜測(cè)定和分析結(jié)果, 提出對(duì)這一問(wèn)題的看法。

1 材料與方法

1.1 藍(lán)隱藻的培養(yǎng)及藻體細(xì)胞的收集

藍(lán)隱藻在實(shí)驗(yàn)室采用F/2培養(yǎng)基自行培養(yǎng), 溫度20~25℃, 持續(xù)通氣、光照培養(yǎng), 16W日光燈, 光照強(qiáng)度約2 000 lx。取培養(yǎng)至4~5 d達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的培養(yǎng)液, 于3 500g離心10 min收集藻體細(xì)胞, 用分離介質(zhì)(pH7.2的50 mmol/L磷酸緩沖液, 含有0.3 mol/L的蔗糖, 0.1 mol/L NaCl和MgCl2)洗滌兩次。

1.2 藍(lán)隱藻類囊體膜的制備

在清洗后的藻體細(xì)胞中加入懸浮液(50 mmol/L,pH8.0的 Tricine-NaOH)后, 用 French Pressure Cell Press(美國(guó) SLM Aminco)破碎細(xì)胞, 相對(duì)壓強(qiáng)為6.897 MPa。破碎后的溶液在1 000g離心10 min去除殘余細(xì)胞及大顆粒, 于5 000g離心10 min收集類囊體膜。以懸浮液懸浮, 小心攪拌, 清洗2~3次, 以除去膜中殘留的游離 PC, 直至離心上清液中不再有藍(lán)色出現(xiàn)為止。加入含 50% 甘油的懸浮液, 參照J(rèn)effrey公式[9]調(diào)整葉綠素濃度為0.8~1.5 g/L, 于–80℃冰箱凍存?zhèn)溆?。以上所有操作?℃避光進(jìn)行。

1.3 藻藍(lán)蛋白PC645的制備

細(xì)胞破碎后的溶液離心收集去除類囊體膜后的上清液于12 000g再次離心10 min, 上清液為含有PC645的粗提液。采用50%飽和度硫酸銨沉淀去除葉綠素等組分, 80%飽和度下得到PC645沉淀, 12 000g離心15 min收集沉淀, 加入少量PBS緩沖液溶解備用。經(jīng)Sephadex G-100分子篩層析純化, 洗脫液為50 μL/L的PBS緩沖液得到初步純化的PC645。

1.4 室溫吸收光譜測(cè)定

藍(lán)隱藻藻體、類囊體膜用懸浮液適當(dāng)稀釋后, 使用TU-1900雙波長(zhǎng)雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用)測(cè)定室溫吸收光譜。

1.5 室溫?zé)晒夤庾V測(cè)定

加入懸浮液將藍(lán)隱藻藻體、類囊體膜適當(dāng)稀釋,使用 LS55 熒光分光光度計(jì)(Perkin Elmer)測(cè)定室溫?zé)晒夤庾V。掃描速度500 nm/min, 激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度10.0 nm。

1.6 77K熒光光譜測(cè)定

將藍(lán)隱藻藻體或類囊體膜離心去除懸浮液后,加入含 60%甘油的懸浮液懸浮, 或者于懸浮液中加入甘油至 60%(V/V), 混勻后置于低溫石英管中, 用LS55 熒光分光光度計(jì)在液氮溫度下測(cè)定熒光光譜。掃描速度 500 nm/min, 測(cè)定發(fā)射光譜時(shí)激發(fā)狹縫15.0 nm, 發(fā)射狹縫10.0 nm; 測(cè)定激發(fā)光譜時(shí)發(fā)射狹縫20.0 nm, 激發(fā)狹縫10.0 nm。

1.7 SDS-PAGE

將低溫保存的類囊體膜解凍后, 用懸浮液清洗,去除游離的PC后, 用懸浮液重新懸浮, 調(diào)整葉綠素質(zhì)量濃度0.8 g/L。參照Laemmli[10]方法加入等體積樣品裂解液, 于37℃增溶30 min, 36 000g離心10 min去除膜碎片。上清液加入 80% 丙酮/乙醇(V/V)洗滌抽提脂類和葉綠素, 三氟乙酸沉淀蛋白, 40 000g離心15 min收集沉淀。沉淀及PC樣品參照Laemmli[10]方法進(jìn)行 SDS-PAGE, 只是采用 10%~20%線性梯度膠分離。電泳結(jié)束后先用硫酸鋅染色觀察有熒光的條帶并拍照, 然后以 7% 冰乙酸脫色至背景透明后再用考馬斯亮藍(lán)染色, 0.5 mol/L NaCl脫色后拍照。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 吸收光譜

在藍(lán)隱藻完整藻體細(xì)胞中(圖1), 436(438)nm和677(679) nm的吸收峰源自Chl a; 495 nm處吸收峰來(lái)自類胡蘿卜素; 而 586、647 nm 兩個(gè)吸收主峰和 1個(gè)626 nm的肩峰都屬于PC(581、626和645 nm), 為典型的Cr-PC645類型。463 nm左右的吸收峰與Chl c的藍(lán)區(qū)吸收有關(guān), 但其在紅區(qū)吸收峰(630 nm附近)被PC645的吸收所掩蔽。在活體細(xì)胞中, PC吸收峰的高度超過(guò)Chl a, 表明PC在活體細(xì)胞中含量很高,是藻體內(nèi)主要的捕光復(fù)合物。Chl c在紅區(qū)的吸收可由PC取代, 但在藍(lán)區(qū)的吸收比Chl a更靠近綠光區(qū)。這與隱藻多生長(zhǎng)于以藍(lán)綠光為主的深水環(huán)境相適應(yīng),大量的PC以及一定量的Chl c的存在, 有利于藻體捕獲水體弱光環(huán)境中的有效光能, 以彌補(bǔ)Chl a吸收的不足[11]。充分洗滌過(guò)的類囊體膜中(圖2)Chl a紅區(qū)吸收紅移至679 nm, 在580~650 nm附近依然能看到屬于PC的吸收峰存在(對(duì)應(yīng)于導(dǎo)數(shù)光譜中的690、634和650 nm倒置峰), 但與Chl a吸收相比, 相對(duì)強(qiáng)度明顯降低。這是由于葉綠體破碎后存在于類囊體腔中的PC大部分流失造成的。這種保留有藻膽蛋白的類囊體膜樣品, 在以往的報(bào)道中都未有提及。只是這部分PC的存在狀態(tài), 單純通過(guò)吸收光譜不能確定,可能與膜結(jié)合, 但也可能處于游離狀態(tài)與類囊體膜片共存。

圖1 藻體和藻藍(lán)蛋白室溫吸收光譜Fig.1 Absorption spectra of cells and PC645 at room temperature

圖2 類囊體膜室溫吸收及其導(dǎo)數(shù)光譜Fig.2 Absorption and derivative spectra of thylakoids at room temperature

2.2 藻體室溫?zé)晒夤庾V

如圖3A藻體的室溫發(fā)射光譜中, 當(dāng)給予435 nm(對(duì)應(yīng) Chl a的吸收)、460 nm(對(duì)應(yīng) Chl c的吸收)激發(fā)光時(shí), 均只發(fā)射源于PSII的Chl a的686~687 nm附近熒光, 沒(méi)有640 nm附近源于Chl c的熒光發(fā)射, 說(shuō)明活體狀態(tài)下Chl c吸收的能量幾乎100%傳遞給Chl a。Chl c作為輔助色素通常與 Chl a及膜上蛋白結(jié)合,組裝形成Chl a/c-捕光蛋白復(fù)合物, 圍繞于反應(yīng)中心外部, 上述結(jié)果說(shuō)明, 膜上脂溶性的 Chl-蛋白復(fù)合物與反應(yīng)中心之間的能量傳遞效率是極高的。當(dāng)給予 580 nm(對(duì)應(yīng)于藍(lán)隱藻 PC吸收)的激發(fā)光時(shí), 在686 nm產(chǎn)生一個(gè)屬于Chl a的熒光發(fā)射。說(shuō)明PC吸收的能量可以傳遞給Chl a。盡管Chl a在580 nm附近也有一小部分吸收, 但 580 nm 激發(fā)光所產(chǎn)生的Chl a熒光發(fā)射強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于435 nm激發(fā)光(相對(duì)熒光強(qiáng)度之比可達(dá)1.5~1.8倍), 表明這部分Chl a熒光發(fā)射主要來(lái)自于PC的激發(fā)而非Chl a。此外, 580 nm光激發(fā)下還產(chǎn)生1個(gè)662~667 nm的源自PC的特征熒光峰, 其相對(duì)熒光強(qiáng)度接近甚至超過(guò)Chl a的發(fā)射峰(F667/F686=1.05~1.2), 說(shuō)明藻體內(nèi)的 PC可以把吸收的能量傳遞給Chl a, 但在測(cè)定時(shí)的激發(fā)光強(qiáng)度下, 也有超過(guò)半數(shù)的激發(fā)能以剩余熒光形式發(fā)射掉了。由于藻膽蛋白是在沒(méi)有足夠用受體的情況下才會(huì)以發(fā)射熒光的方式消耗激發(fā)能, 而據(jù)報(bào)道隱藻藻膽蛋白與 Chl a之間的能量傳遞效率很高, 可達(dá)98%~99%[7], 因此活體細(xì)胞中發(fā)射這部分660~667 nm剩余熒光的 PC應(yīng)該是以某種方式中斷了與光合系統(tǒng)之間的能量傳遞關(guān)系。

激發(fā)光譜反映的是熒光物質(zhì)在不同波長(zhǎng)的激發(fā)光照射下, 對(duì)所產(chǎn)生的發(fā)射波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度的貢獻(xiàn),往往與該物質(zhì)的吸收光譜中的峰形變化一致, 可以反映色基之間的能量偶聯(lián)情況[12]。如圖3B所示, 在700 nm發(fā)射波長(zhǎng)下, 藻體細(xì)胞的激發(fā)光譜與吸收光譜很相似, 在藍(lán)區(qū)436、458和495 nm(導(dǎo)數(shù)光譜447、473和502 nm)處可看到小的源自于Chl a、Chl c和類胡蘿卜素的激發(fā)峰, 只有導(dǎo)數(shù)處理后的結(jié)果中可看到位于679 nm的Chl a紅區(qū)激發(fā)峰, 說(shuō)明Chl c及類胡蘿卜素和Chl a之間存在能量偶聯(lián), 只是對(duì)該熒光貢獻(xiàn)較小?；铙w細(xì)胞激發(fā)譜中, 最強(qiáng)的582 nm和646 nm(導(dǎo)數(shù)光譜592和662, 631 nm對(duì)應(yīng)于625 nm吸收肩峰)的激發(fā)峰顯然源自 PC, 說(shuō)明藻體內(nèi)對(duì)700 nm長(zhǎng)波熒光發(fā)射貢獻(xiàn)比例最高的是 PC。在520~550 nm(導(dǎo)數(shù)光譜529 nm和543 nm)的變化, 據(jù)報(bào)道與PC內(nèi)部偶聯(lián)的色基對(duì)相互作用有關(guān)[13-14]。

2.3 藻體77K熒光光譜

室溫下通常只能觀測(cè)到屬于PSII的熒光, PSI在室溫下不產(chǎn)生顯著的熒光峰[15], 因而采用 77K液氮低溫條件測(cè)定, 以區(qū)分 PSI和 PSII的差別?；铙w細(xì)胞 77K低溫?zé)晒獍l(fā)射譜與室溫相比, 峰形、峰位和相對(duì)強(qiáng)度都有所變化(圖3C), 其譜峰十分特別, 表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面: (1)當(dāng)給予435 nm和460 nm激發(fā)光時(shí), 發(fā)射主峰在屬于Chl a的694~696 nm附近, 與高等植物和綠藻相似, 是源自于 PSII內(nèi)周天線的典型發(fā)射峰[16]。此結(jié)果與以往對(duì)隱藻的報(bào)道不同, 含有PC的藍(lán)隱藻ChroomonasCCMP270以及含有PE的RhodomonasCS24的活體細(xì)胞在 77K低溫下屬于PSII的熒光峰都在683或者686 nm處, 這一現(xiàn)象被認(rèn)為是由于隱藻 PSII光合系統(tǒng)特異而導(dǎo)致的[7,17],但作者的測(cè)定結(jié)果說(shuō)明, 不同種屬的隱藻, 其 PSII的熒光特性可能是多樣化的。在這兩種激發(fā)波長(zhǎng)下,700 nm以上的長(zhǎng)波發(fā)射基本看不到, 說(shuō)明Chl a和Chl c激發(fā)后的能量似乎更傾向于傳遞給PSII或者短波長(zhǎng)Chl a。但Chl c激發(fā)后只產(chǎn)生Chl a的熒光, 說(shuō)明77K低溫沒(méi)有影響Chl c向Chl a之間的能量傳遞效率。

圖3 藻體細(xì)胞室溫(A, B)和77K(C, D)熒光發(fā)射(A, C), 激發(fā)(B, D)及其導(dǎo)數(shù)光譜Fig.3 Fluorescence emission (A, C), excitation (B, D) and derivative spectra of cells at room temperature (A, B) and77 K (C, D)

(2) 當(dāng)給予580 nm對(duì)應(yīng)于藍(lán)隱藻PC的激發(fā)光時(shí), 除了產(chǎn)生695 nm源自PSII的熒光發(fā)射之外, 還產(chǎn)生 720~725 nm熒光, 該熒光發(fā)射被認(rèn)為源于PSI[18-19]。此結(jié)果與Mimuro等[16]報(bào)道的不同隱藻的活體細(xì)胞中 PSI的 77K特征熒光發(fā)射峰通常位于715~730 nm相一致。說(shuō)明藍(lán)隱藻完整藻體細(xì)胞中的PC可將激發(fā)能同時(shí)傳遞給PSII和PSI反應(yīng)中心附近的Chl a。藻體中對(duì)700 nm以上長(zhǎng)波熒光的貢獻(xiàn)主要來(lái)自于 PC, 說(shuō)明 PC將相當(dāng)一部分激發(fā)能傳遞給了長(zhǎng)波Chl a。

(3) 580 nm光激發(fā)后的發(fā)射主峰位于 666 nm,是屬于 PC的特征發(fā)射峰, 該熒光峰比來(lái)自 PSI和PSII的 Chl a的發(fā)射峰高的多(F666/F695平均可達(dá)5.0, F666/F725=6.0), 而相對(duì)熒光發(fā)射強(qiáng)度是 Chl a激發(fā)時(shí)的4~5倍。與室溫?zé)晒獍l(fā)射光譜相比較, 屬于PC的發(fā)射比例大幅度增加。藍(lán)隱藻細(xì)胞中這種發(fā)射超高比例藻膽蛋白熒光的現(xiàn)象與某些隱藻相似[7,17],但與藍(lán)藻或紅藻相比則顯得特異[20-21]。其原因可能是由于低溫導(dǎo)致了 PC與膜相關(guān)的能量傳遞途徑阻礙, 致使 PC激發(fā)后的大部分激發(fā)能沒(méi)有傳遞下去,表現(xiàn)為666 nm發(fā)射強(qiáng)度相對(duì)Chl a的發(fā)射強(qiáng)度大幅度升高。由于低溫條件下阻礙的是活體細(xì)胞內(nèi)的生物過(guò)程或者動(dòng)態(tài)過(guò)程, 而光物理和光化學(xué)過(guò)程仍可進(jìn)行。推測(cè)生理?xiàng)l件下PC與膜組分之間的能量傳遞可能借助了某些低溫下可被阻斷的動(dòng)態(tài)相互作用,而紅、藍(lán)藻藻膽體因?yàn)槭歉街诠夂夏ど系? 因而受低溫的影響相對(duì)要小。

PC激發(fā)對(duì)長(zhǎng)波熒光的貢獻(xiàn), 在發(fā)射波長(zhǎng)為720 nm時(shí)藻體細(xì)胞 77K 激發(fā)光譜(圖3D)中體現(xiàn)得更為明顯。此時(shí), 在440~470 nm之間屬于Chl a和Chl c的激發(fā)峰幾乎不可見(jiàn), 只在導(dǎo)數(shù)處理的譜峰中可以看到687nm處對(duì)應(yīng)于長(zhǎng)波Chl a的激發(fā)貢獻(xiàn)。主要的激發(fā)峰在580~650 nm, 激發(fā)峰形與PC645的吸收譜圖很相似(圖1)。而77K下PC的激發(fā)光譜更精細(xì),呈現(xiàn)581、611、632和 649 nm多個(gè)PC的激發(fā)峰, 在導(dǎo)數(shù)處理后更為明顯。對(duì)于隱藻PC645吸收光譜中3個(gè)典型的吸收譜峰與藻膽素色基之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系一直存在爭(zhēng)議, 但最近的一些報(bào)道傾向于認(rèn)為,PC645所含有的色基吸收區(qū)域?yàn)? DBV(二氫膽綠素)?580~585 nm, MBV(中膽綠素)?610~622nm,PCB(藻藍(lán)膽素)?630~640 nm, PCB(β82)?645~650 nm,位于β亞基82位Cys上的PCB為最低能量色基[22-23]。因此上述4個(gè)激發(fā)峰應(yīng)該分別對(duì)應(yīng)于DBV(581 nm)、MBV(611 nm)、PCB(632 nm)和 PCBβ82(649 nm)。

2.4 類囊體膜室溫?zé)晒夤庾V

葉綠體破碎之后制備的類囊體膜在室溫條件下以 435和 460 nm作為激發(fā)光照射時(shí), 都只產(chǎn)生在688~689 nm附近的來(lái)自PSII的Chl a發(fā)射峰(圖4A),說(shuō)明在分離得到的類囊體膜上Chl a和Chl c依然保持著良好的天然狀態(tài), 吸收的光能均可有效的傳遞給Chl a。若以580 nm光激發(fā)時(shí), 同樣在685~686 nm附近產(chǎn)生源于Chl a的熒光, 但相對(duì)于藻體細(xì)胞, 由于PC的流失, 相對(duì)熒光強(qiáng)度低于435 nm激發(fā)(相對(duì)強(qiáng)度比值為0.2~0.3), 甚至低于Chl c激發(fā)時(shí)的熒光(相對(duì)強(qiáng)度比值為0.7~0.8)。除此之外, 在659~660 nm處(比活體狀態(tài)藍(lán)移約5~6 nm)仍可看到有1個(gè)屬于PC的發(fā)射峰, 與Chl a峰的比值F660/F685= 1.4~1.6。說(shuō)明經(jīng)過(guò)充分洗滌的類囊體膜中仍有和 Chl-蛋白特異結(jié)合的PC。

圖4 類囊體膜在室溫(A, B)和77K(C, D)下的熒光發(fā)射(A, C), 激發(fā)(A, C)及導(dǎo)數(shù)光譜Fig.4 Fluorescence emission (A, C), excitation (B, D) and derivative spectra of thylakoid membrane at room temperature(A, B)and 77 K (C, D)

在 700 nm發(fā)射波長(zhǎng)下的室溫激發(fā)光譜(圖4B)顯示, 在去除大部分PC的類囊體膜中, Chl a對(duì)此長(zhǎng)波熒光的貢獻(xiàn)相對(duì)突出, 除了紅區(qū)435 nm激發(fā)峰外,在673 nm的藍(lán)區(qū)激發(fā)峰成為主峰; 但460 nm附近原屬于Chl c激發(fā)峰幾乎消失, 表明此時(shí)Chl c對(duì)此長(zhǎng)波熒光的貢獻(xiàn)微乎其微; 而583, 632, 642 nm的激發(fā)峰明顯與 PC有關(guān), 進(jìn)一步說(shuō)明在樣品中存在的 PC是與類囊體膜以良好的狀態(tài)結(jié)合著的, 且PC和Chl a之間依然保持著能量傳遞關(guān)系。

2.5 類囊體膜77K熒光光譜

在圖4C類囊體膜的77K熒光發(fā)射光譜中, 與活體細(xì)胞相似, 在435 nm和460 nm的激發(fā)光照射下,主要可使Chl a和Chl c激發(fā), 此時(shí)類囊體膜的熒光發(fā)射主峰均為源自PSII內(nèi)周天線Chl a的692 nm熒光(比活體狀態(tài)藍(lán)移約3~4 nm); 但在700 ~730 nm區(qū)域還呈現(xiàn)不明顯的肩峰區(qū), 這一部分發(fā)射波長(zhǎng)長(zhǎng)于PSI的反應(yīng)中心葉綠素P700, 因而一般認(rèn)為來(lái)自PSI,說(shuō)明類囊體膜中Chl a和Chl c激發(fā)后都可將能量傳遞給PSI。有報(bào)道認(rèn)為, 隱藻PSI也有屬于自己的Chl a/c2捕光復(fù)合物 LHCI存在[24-25], 因此, 光譜中這一部分激發(fā)能可能來(lái)自LHCI中的Chl a和Chl c, 但是顯然份額較少。此外, 當(dāng)給予類囊體膜580 nm的激發(fā)光時(shí), 類囊體膜除了呈現(xiàn)比藻體時(shí)強(qiáng)度低的多的662 nm發(fā)射峰外, 還呈現(xiàn)出源自PSI的703、717 nm的長(zhǎng)波Chl a的熒光峰(比藻體藍(lán)移7 ~8 nm), 再次說(shuō)明PC和兩個(gè)光合系統(tǒng)的Chl a間均存在能量傳遞關(guān)系, 并且向長(zhǎng)波Chl a傳遞的份額比Chl c更高。

圖4D類囊體膜的77K激發(fā)光譜中也顯示, 發(fā)射波長(zhǎng)為720 nm時(shí), 對(duì)這一長(zhǎng)波熒光產(chǎn)生貢獻(xiàn)的主要是Chl a(431~448 nm、682 nm)和 PC(580~646 nm),Chl c(470 nm)以及類胡蘿卜素(494 nm)的激發(fā)不明顯。而 77K下 PC的激發(fā)光譜更精細(xì), 除了 581和649 nm峰之外, 還呈現(xiàn)582、613、632和 646 nm處多個(gè)PC藻膽素色基的激發(fā)峰。

可見(jiàn), 盡管類囊體膜制備過(guò)程中, 包裹在類囊體腔中的PC不可避免會(huì)流失, 但在實(shí)驗(yàn)條件下所得的膜片上依然存在一定比例的 PC, 并且其上結(jié)合的Chl -蛋白復(fù)合物以及 PC的色基之間的能量傳遞關(guān)系仍與活體細(xì)胞狀態(tài)相似。

2.6 類囊體膜多肽SDS-PAGE

充分洗滌后的類囊體膜多肽分析結(jié)果見(jiàn)圖5。多肽的分布呈現(xiàn)一定的規(guī)律: 即主要分布在 20~22 ku(捕光復(fù)合物)、28~35 ku(反應(yīng)中心)、45 ku 附近(PSII內(nèi)周天線)和 66 ku附近(PSI核心)4個(gè)區(qū)域附近[25](圖5b)。結(jié)果經(jīng)鋅染后在紫外光下觀察(圖5c), 發(fā)現(xiàn)在考染圖譜中豐度最高的 20 ku多肽附近有一條粉紅色熒光條帶, 與PC的β亞基遷移率相當(dāng)(圖5d)。由于類囊體膜樣品在多肽組成分析之前經(jīng)過(guò)丙酮/乙醇處理, 與蛋白質(zhì)非共價(jià)結(jié)合的葉綠素和類胡蘿卜素被去除, 只有與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合的藻膽素可被保留, 因此 PAGE圖譜中呈現(xiàn)粉紅色熒光的蛋白帶只能屬于含藻膽素的藻膽蛋白亞基, 說(shuō)明類囊體膜樣品中確有PC存在。并且由于膜樣品在電泳前經(jīng)過(guò)深度洗滌, 因此圖譜中觀察到的多肽組分(包括 PC)都應(yīng)是附著或者結(jié)合于膜上的。多肽分析結(jié)果還顯示,PC645的β亞基總能被檢測(cè)到, 而α亞基則只有在銀染條件下偶爾可以見(jiàn)到(結(jié)果未顯示), 盡管α亞基可能因?yàn)榉肿恿啃《菀琢魇? 但這一結(jié)果暗示了PC645的β亞基似乎與膜結(jié)合更為緊密。既然目前的研究?jī)A向于認(rèn)為, PC645產(chǎn)生末端發(fā)射的基團(tuán)(662 nm熒光發(fā)色團(tuán))是位于 β亞基的 PCBβ82, 激發(fā)能在PC645內(nèi)部傳遞后最終到達(dá)PCBβ82, 后者再將能量傳遞給位于膜上的Chl a[22-23]。因此, 從功能上來(lái)說(shuō),PC645的β亞基應(yīng)是與膜上葉綠素相互作用的位點(diǎn),因此結(jié)構(gòu)上由 β亞基與膜相接觸, 這一結(jié)果以往未有報(bào)道, 但作者認(rèn)為應(yīng)該是合理的。

圖5 類囊體膜多肽以及PC亞基SDS-PAGE圖譜Fig.5 The SDS-PAGE profiles of thylakoid membrane peptides and PC subunits

3 討論與結(jié)論

目前對(duì)隱藻藻膽蛋白的了解遠(yuǎn)不及紅、藍(lán)藻藻膽蛋白透徹, 而隱藻藻膽蛋白的研究又大多以游離的異二聚體或者更小的單體本身為對(duì)象[22-24,26-28],對(duì)于異二聚體之間的相互作用, 以及作為隱藻主要的捕光復(fù)合物與類囊體膜上 Chl-蛋白之間的接觸機(jī)制卻了解有限, 甚至于是否有結(jié)構(gòu)上的接觸都還眾說(shuō)紛紜, 存在爭(zhēng)議。

一方面, Wit等[7]提出的隱藻光合膜結(jié)構(gòu)模型,是現(xiàn)有模型中最新的, 他們認(rèn)為隱藻藻膽蛋白的α1α2ββ異二聚體形式是穩(wěn)定的生理結(jié)構(gòu)形式, 似乎不傾向于形成高度的聚合狀態(tài); 藻膽蛋白異二聚體高密度均勻地填充于類囊體腔中, 彼此之間以及與膜上 Chl-蛋白復(fù)合物之間都沒(méi)有傾向性的結(jié)合; 二聚體蛋白可在不相互接觸、也不與膜接觸的情況下以 F?ster共振方式直接將吸收的能量在彼此之間傳遞, 并最終傳遞給位于類囊體膜上的Chl a。由于按照此模型計(jì)算, 藻膽蛋白與膜上能量的傳遞效率比活體狀態(tài)低得多, 因此 Doust等[8]認(rèn)為, 離體狀態(tài)的藻膽蛋白其光譜學(xué)測(cè)定結(jié)果可能不能代表活體狀態(tài)下的準(zhǔn)確情況。因此也說(shuō)明處于游離狀態(tài)的隱藻藻膽蛋白似乎不是完全的天然狀態(tài)。

另一方面, Lichtlé等[25]曾經(jīng)報(bào)道分到一種活性的 PE-葉黃素-PSII復(fù)合物組分; 而作者在前期的實(shí)驗(yàn)中則分離到一種特殊的 PC-Chl a/c2-蛋白復(fù)合物,并且該復(fù)合物中 PC吸收的能量可直接傳遞給復(fù)合物內(nèi)的Chl a, 無(wú)需經(jīng)由Chl c2的介導(dǎo)[29]。這些結(jié)果直接說(shuō)明, 隱藻藻膽蛋白在結(jié)構(gòu)上是與膜上的 PSII或者Chl a/c-蛋白復(fù)合物直接相連的, 并且在功能上存在能量傳遞關(guān)系。

此外, 曾有活體細(xì)胞的熒光動(dòng)力學(xué)研究顯示,隱藻Cryptomonas ovata細(xì)胞也存在不是很典型的光誘導(dǎo)的狀態(tài)轉(zhuǎn)變過(guò)程, 在PSII過(guò)激發(fā)時(shí), 會(huì)導(dǎo)致PE與Chl a/c2以及PSII核心的偶聯(lián)中斷, 從而改變?cè)迥懙鞍紫騊SII能量傳遞比率, 并且認(rèn)為這是PSII的一種光保護(hù)機(jī)制[30]。隱藻類囊體膜雖然沒(méi)有基粒結(jié)構(gòu),但也有一定的垛疊[3], PSI和PSII的分布也是區(qū)域化的, 因此其激發(fā)能在兩個(gè)光系統(tǒng)之間的再分配以及光保護(hù)的實(shí)現(xiàn), 可能有賴于藻膽蛋白與膜之間關(guān)系的某種動(dòng)態(tài)變化。由于藻膽蛋白在類囊體腔內(nèi)是密集存在的[7-8], 因此總有一部分藻膽蛋白不能接觸到類囊體膜的內(nèi)表面。所以實(shí)現(xiàn)解除偶聯(lián)的方式有兩種可能: 一是藻膽蛋白為結(jié)合狀態(tài)的, 此時(shí)可通過(guò)某種結(jié)構(gòu)或構(gòu)象變化而與受體葉綠素解除偶聯(lián)[30-31], 比如一部分與類囊體膜的脫離; 另一種可能是在藻體細(xì)胞的天然狀態(tài)下就以游離狀態(tài)存在, 此時(shí)可能表現(xiàn)為 PSI或 PSII附近藻膽蛋白區(qū)域化的聚集程度的變化。

由于活體細(xì)胞中色基之間的能量傳遞過(guò)程非常復(fù)雜, 且實(shí)驗(yàn)結(jié)論多有不同。因此, 本實(shí)驗(yàn)改換思路,同時(shí)制備了充分洗滌但證實(shí)仍然結(jié)合有藻膽蛋白的類囊體膜為材料, 得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明: (1)藍(lán)隱藻的類囊體膜上始終緊密的結(jié)合著一定量的 PC, 這樣的類囊體膜樣品在以往的報(bào)道中均沒(méi)有提及, 這一點(diǎn)充分說(shuō)明PC不應(yīng)是完全游離于膜腔內(nèi)的; (2)SDSPAGE顯示, 深度洗滌過(guò)的類囊體膜上結(jié)合的主要是PC645的β亞基, 因此PC645有可能借助β亞基與膜接觸, 這一發(fā)現(xiàn)為近年來(lái) PC645內(nèi)部能量傳遞最終發(fā)射基團(tuán)位于β亞基而非α亞基的觀點(diǎn)提供了直接的證據(jù)[22-23,26], 同時(shí)說(shuō)明PC與膜結(jié)合時(shí)并非完全沒(méi)有傾向性; (3)PC既可將激發(fā)能傳遞給PSII, 但也可傳遞給PSI, 說(shuō)明PC與膜上兩個(gè)光合系統(tǒng)之間都有功能上的關(guān)聯(lián), 這結(jié)果與近年來(lái)的活體細(xì)胞時(shí)間分辨動(dòng)力學(xué)研究一致[17,22]; (4)相較于Chl a和Chl c,PC在PSI長(zhǎng)波熒光中的貢獻(xiàn)更大, 而Chl c吸收的光能, 更傾向于傳遞給PSII或者短波長(zhǎng)Chl a; (5)藍(lán)隱藻細(xì)胞中表現(xiàn)出超比例的PC熒光發(fā)射, 說(shuō)明PC在類囊體腔內(nèi)應(yīng)該有一部分是與膜不關(guān)聯(lián)而游離存在的,處于游離狀態(tài)下的 PC吸收的光能主要以發(fā)射自身熒光而耗散掉, 沒(méi)有將激發(fā)能全部傳遞給反應(yīng)中心。

根據(jù)以上各方面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 作者提出隱藻藻膽蛋白在葉綠體中可能的存在和能量傳遞模式: 隱藻葉綠體內(nèi)可能存在超過(guò)光合功能需要的藻膽蛋白,與其生長(zhǎng)的深水中特定的弱光環(huán)境相適應(yīng); 藻膽蛋白在類囊體腔中與膜的結(jié)合狀態(tài)有可能是動(dòng)態(tài)的,一部分為膜結(jié)合型, 另一部分為游離狀態(tài)(Morisset等[32]曾報(bào)道PC645可以形成不同的兩種晶型), 處于結(jié)合狀態(tài)的藻膽蛋白參與光能向反應(yīng)中心的傳遞,而游離狀態(tài)的藻膽蛋白對(duì)于捕光功能來(lái)說(shuō)可能暫時(shí)是冗余的, 而當(dāng)需要的時(shí)候, 游離的藻膽蛋白還可與類囊體膜內(nèi)表面重新結(jié)合或聚集; 藻膽蛋白與膜的結(jié)合部位包括PSI和PSII的定位區(qū), 與PSII的接觸和能量傳可能通過(guò)LHCII中的Chl a/c蛋白復(fù)合物介導(dǎo), 但能量是直接傳遞給Chl a而不經(jīng)過(guò)Chl c的中轉(zhuǎn), Chl c和藻膽蛋白向反應(yīng)中心供能時(shí)各自遵循不同的能量傳遞路徑; 而藻膽蛋白在與 PSI的接觸中, 則更多地以某種方式與含有長(zhǎng)波Chl a的組分相互作用; 藻膽蛋白可借助與膜的結(jié)合和脫離的動(dòng)態(tài)方式, 以類似于高等植物的移動(dòng)天線 LHCII的原理,調(diào)節(jié)激發(fā)能在光合系統(tǒng)之間的傳遞比例, 或者實(shí)現(xiàn)對(duì)反應(yīng)中心的光保護(hù)。

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