吳瑞鋒劉俊峰高楊李保慶王金棟劉新波

鈣離子拮抗劑維拉帕米對人食管下括約肌舒縮的調(diào)節(jié)機制

吳瑞鋒1劉俊峰2高楊3李保慶2王金棟4劉新波2

目的通過比較鈣離子拮抗劑維拉帕米對由乙酰膽堿誘導的人食管下括約?。↙ES）套索纖維和鉤狀纖維肌條收縮的拮抗程度，探討維拉帕米對LES肌條舒縮的影響。方法應用中上段食管癌患者LES作為研究對象，同時取食管體部和胃底肌條作為對照。分離出食管體部、胃底、套索纖維（sling）和鉤狀纖維（clasp）肌束，應用離體肌條張力測定技術分別測定維拉帕米（10－3mol／L）對由乙酰膽堿（Ach）（濃度分別為10－6、10－5、10－4、10－3、10－2、10－1mol／L）誘導的4種肌條收縮的拮抗程度。結果食管環(huán)行肌組、胃底環(huán)形肌組和clasp組加入維拉帕米前后未見肌條收縮水平有明顯改變（t＝0.896，P＝0.372；t＝0.331，P＝0.741；t＝0.324，P＝0.747；t＝2.294，P＝0.023）。sling組加入維拉帕米后，收縮能力下降，收縮水平由（17.0±5.2）g降至（14.7±6.6）g，差異有統(tǒng)計學意義（t＝2.294，P＝0.023）。結論維拉帕米部分阻滯了LES套索纖維的收縮，從而導致了LES的舒張。

鈣離子； 食管； 括約??； 維拉帕米

人食管下括約?。╰he lower esophageal sphincter，LES）［1］由套索纖維（sling fibers）和鉤狀纖維（clasp fibers）共同構成。這兩束肌肉共同維持LES的關閉狀態(tài)，并形成了LES高壓帶（high－pressure zon，HPZ）（15～30mmHg）（1mmHg＝0.133kPa）［2－3］。LES有自發(fā)產(chǎn)生基礎張力的特性，由此張力阻止胃內(nèi)容物反流入食管內(nèi)。

有關LES的舒縮調(diào)節(jié)機制仍是食管生理研究的熱點。目前臨床上應用鈣離子（Ca2＋）拮抗劑治療賁門失遲緩癥等食管運動功能障礙性疾病，雖有一定的效果但并不能根本緩解，即使采取手術治療，很多患者術后仍有殘余癥狀甚至復發(fā)［4］。本研究應用離體肌條張力測定技術分別測定Ca2＋拮抗劑維拉帕米對由乙酰膽堿（acetylcholine，Ach）誘導的4種肌條收縮的拮抗程度，探討Ca2＋拮抗劑對人LES舒縮過程的影響，進一步探索LES舒縮的調(diào)節(jié)機制，為臨床治療食管運動功能障礙性疾病提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、標本制備

選取我院2013年5月至2015年4月收治的食管中上段癌行食管大部切除術患者6例，其中男女各3例，平均年齡56歲。所有患者術前均無燒心、反酸癥狀，亦無賁門失弛緩癥、硬皮病等可能導致LES功能障礙的疾病史。由于腫瘤位于食管中段或上段未累及胃食管連接部，所取胃食管連接部的標本可認作近似正常。手術室采集新鮮手術標本后，立即放入4℃Krebs液中，送入實驗室。Krebs液含NaCl 118.1mmol／L、KCl 4.7mmol／L、CaCl22.5mmol／L、MgSO41.2mmol／L、KH2PO41.2 mmol／L、NaHCO324.9mmol／L、葡萄糖10.0 mmol／L，pH值7.4。于室溫下將標本黏膜面向上固定于盛有Krebs液的蠟盤中，持續(xù)通以5%CO2和95%O2混合氣體。銳性剝?nèi)ノ纲S門部及食管下段的黏膜層及黏膜下層后，在胃的大彎側(cè)及小彎側(cè)可分辨出兩個增厚的半環(huán)形平滑肌帶，分別為clasp和sling。然后在解剖顯微鏡下小心游離這兩束纖維及食管體部環(huán)行肌和胃底環(huán)行肌，制備成（0.5～1.0）cm×（0.1～0.2）cm的肌條，并在顯微鏡下觀察為正常平滑肌組織才能使用。本實驗經(jīng)河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院倫理委員會批準，并獲患者及家屬知情同意。

二、實驗步驟

實驗分為鉤狀纖維組（clasp）、套索纖維組（sling）、食管環(huán)行肌組和胃底環(huán)行肌組，分別將獲得的4個部位的肌條兩端以0號手術絲線扎緊，懸掛于已去除CaCl2的Krebs液（10ml）的離體器官灌流槽（南京美易科技有限公司）中，37℃恒溫，持續(xù)通以5%CO2和95%O2混合氣體。肌條下端固定，上端連接于JZ101型肌肉張力換能器（河北省新航機電設備有限公司），將換能器固定桿固定于可精確調(diào)節(jié)的升降架上，由Medlab離體器官檢測儀（南京美易科技有限公司）測定肌條張力，張力信號放大后經(jīng)Medlab信號采集系統(tǒng)（南京美易科技有限公司）記錄。平滑肌條固定好后，先溫浴1h，每20min更換已去除CaCl2的Krebs液一次。然后緩慢牽拉肌條，以剛好將肌條拉緊后的長度為初始長度（L0），在這一長度時松弛肌肉不會產(chǎn)生明顯的張力變化，而進一步牽拉則會使張力明顯升高。然后，多次緩慢牽拉肌條，每次增加其初始長度的25%～50%，待被動張力穩(wěn)定10min后再次牽拉。如此反復，約每20min牽拉一次，直至達到初始長度的200%為最適初長度。隨后進行的實驗均在此條件下進行。

待最適初長度穩(wěn)定40min后，以濃度累積方式依次向浴槽中加入Ach（10－6、10－5、10－4、10－3、10－2、10－1mol／L），每增加一個濃度，都要在前一濃度達到最大反應時加入，記錄張力變化值。濃度累積方式給藥所作的濃度反應曲線與單獨濃度給藥方式類似。徹底沖洗肌條，加入維拉帕米（取維拉帕米的最適有效濃度為10－3mol／L）1min后，再以上述方式加入Ach，分別記錄四組的肌條張力變化值。試驗完畢，取出肌條用濾紙吸干外附水分，用精密分析天平稱重，將所得張力變化值結合標本重量、初始長度及標準密度，換算出單位橫截面積張力值（mN／mm2）。

三、統(tǒng)計學分析

所得數(shù)據(jù)應用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用隨機區(qū)組設計實驗的方差分析（析因分析）進行統(tǒng)計學檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

食管環(huán)行肌、胃底環(huán)行肌、clasp、sling四組在不同濃度Ach誘導下加入維拉帕米后肌條收縮情況如圖1～4所示。其中食管環(huán)行肌、胃底環(huán)行肌和clasp三組的肌條在加入維拉帕米后收縮幅度與未加入前比較差異無統(tǒng)計學意義（（t＝0.896，P＝0.372；t＝0.331，P＝0.741；t＝0.324，P＝0.747；t＝2.294，P＝0.023）；但sling組的肌條收縮在加入維拉帕米后受到抑制，肌束張力由（17.0±5.2）g降至（14.7±6.6）g，差異有統(tǒng)計學意義（t＝2.294，P＝0.023）（表1）。

圖2 胃底環(huán)行肌組加入維拉帕米前后肌條的收縮情況

圖3 clasp組加入維拉帕米前后肌條的收縮情況（n＝6）

圖4 sling組加入維拉帕米前后肌條的收縮情況（n＝6）

表1 加入維拉帕米前后4種肌條的收縮情況比較（n＝6，±s，g）

表1 加入維拉帕米前后4種肌條的收縮情況比較（n＝6，±s，g）

組別加阻滯劑前加阻滯劑后t值P值食管環(huán)行肌組14.6±4.2 14.0±3.2 0.896 0.372胃底環(huán)行肌組16.0±7.8 15.6±7.8 0.331 0.741 Clasp組15.6±6.0 15.3±6.0 0.324 0.747 Sling組17.0±5.2 14.7±6.6 2.294 0.023

討 論

Ca2＋拮抗劑在臨床上應用廣泛，主要應用于心腦血管疾病，在消化系統(tǒng)疾病中主要用于治療賁門失弛緩癥。常用藥物為硝苯地平［5］和維拉帕米，作用機制是阻滯外源性Ca2＋經(jīng)L－型鈣離子通道進入細胞內(nèi)，降低胞內(nèi)的Ca2＋濃度，而Ca2＋是細胞內(nèi)重要的第二信使，高濃度的Ca2＋可引起平滑肌收縮，低濃度Ca2＋可引起平滑肌舒張［6］。

人LES由sling和clasp共同構成。LES的壓力是不對稱的，高壓區(qū)偏向左側(cè)sling方向［7］。應用毒蕈堿受體拮抗劑阿托品可明顯降低LES左側(cè)的壓力［1，8］，且體外實驗也證明sling對Ach的敏感度更高，但鉤狀纖維卻有更大的自發(fā)張力［9－10］，表明clasp和sling在LES中存在不同的舒縮信號轉(zhuǎn)導機制。高立平、溫士旺等［11－13］在對人LES的一系列研究中已經(jīng)證明sling起到了主要作用。細胞內(nèi)Ca2＋濃度的變化是導致兩種肌條對Ach反應不同的原因，而這種不同與毒菌堿受體的亞型無關［1，7］。

本實驗研究結果表明Ca2＋拮抗劑維拉帕米主要作用于sling，即維拉帕米不能完全阻滯clasp和sling由Ach誘導的收縮，但維拉帕米可明顯降低sling收縮的程度，也就是部分地阻滯了sling的收縮，從而導致LES的舒張。

本研究結果與以往的相關研究不同，甚至相反。如在Ach對人LES肌細胞收縮作用和細胞內(nèi)Ca2＋濃度的影響研究中發(fā)現(xiàn)，Ca2＋拮抗劑硝苯地平明顯降低了clasp平滑肌細胞內(nèi)Ca2＋濃度的升高幅度，而sling組則基本不受硝苯地平的影響，即硝苯地平阻滯了clasp卻不能阻滯sling的收縮反應［5，14］。Muinuddin等［15］在對貓LES的環(huán)形肌和sling Ca2＋源的多樣性的研究中發(fā)現(xiàn)環(huán)行肌收縮被阻滯的程度遠大于sling；應用L型鈣離子通道阻滯劑時，環(huán)行肌被阻滯而sling的收縮卻不受影響。

綜合以上各因素分析導致本實驗結果變化的原因如下：①LES在由Ach誘導的收縮過程中其不同肌組織利用鈣源的程度不同，sling主要依靠了外鈣內(nèi)流，且流經(jīng)L型鈣離子通道，而clasp則主要依靠細胞內(nèi)存儲的Ca2＋的釋放；②Ca2＋不止是通過L－型鈣離子通道進入細胞內(nèi)，也可能經(jīng)T型鈣通道進入細胞內(nèi)［16］；③LES的舒縮調(diào)節(jié)除受Ca2＋影響外，還受神經(jīng)、體液、內(nèi)分泌等多種因素不同調(diào)節(jié)機制的影響。結合臨床實踐，這也驗證了Ca2＋拮抗劑并不能根治賁門失弛緩癥，而只是部分緩解癥狀的原因。因此，更深入地了解Ca2＋在LES舒縮過程中所起的作用、方式及研發(fā)出針對不同鈣源的阻滯劑，會為食管良性疾病的內(nèi)科保守治療帶來堅實的理論基礎。

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Regulation mechanism of contraction and relaxation of human lower esophageal sphincter by calcium antagonist verapamil

Wu Ruifeng1，Liu Junfeng2，Gao Yang3，Li Baoqing2，Wang Jindong4，Liu Xinbo2.
1Department of Cardiovascular and Thoracic Surgery，the First Central Hospital of Baoding，Baoding 071000，China；2the Fourth Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050011，China；3School of Postgraduate，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050011，China；4Department of Cardiothoracic Surgery，the First People’s Hospital of Xuzhou，Xuzhou 221002，China

Liu Junfeng，Email：liujf＠heinfo.net

ObjectiveTo investigate the effects of calcium antagonist verapamil on the contraction and relaxation of human lower esophageal sphincter（LES）clasp and sling fibers induced by acetylcholine（Ach）.MethodsLES was obtained from patients with superior and middle esophageal carcinoma，and muscles of esophageal body and gastric bottom were served as controls.After isolation of muscle bundles of esophageal body，gastric bottom，sling fibers and clasp fibers，in vitro muscle stripe intensity measurement technique was employed to determine the effects of verapamil（10－3mol／L）on the contraction and relaxation of these four muscle stripes induced by Ach（10－6，10－5，10－4，10－3，10－2and 10－1mol／L）.ResultsThe contraction of circular muscles of esophageal body and gastric bottom and clasp fibers was not significantly changed after verapamil intervention（t＝0.896，P＝0.372；t＝0.331，P＝0.741；t＝0.324，P＝0.747）.However，the contraction of sling fibers was significantly decreased from（17.0±5.2）g to（14.7±6.6）g after verapamil intervention（t＝2.294，P＝0.023）.ConclusionsVerapamil partly blocks the contraction of LES，and results in the relaxation of LES.

Calcium iron； Esophagus； Sphincter； Verapamil

2015－04－29）

（本文編輯：周珠鳳）

10.3877／cma.j.issn.2095－8773.2015.03.004

河北省自然科學基金資助項目（C2010000622）

071000 保定市第一中心醫(yī)院心胸血管外科1；050011 石家莊，河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院胸外科2；050011石家莊，河北醫(yī)科大學研究生學院3；221002 徐州市第一人民醫(yī)院胸心外科4

劉俊峰，Email：liujf＠heinfo.net

吳瑞鋒，劉俊峰，高楊，等.鈣離子拮抗劑維拉帕米對人食管下括約肌舒縮的調(diào)節(jié)機制［J／CD］.中華胸部外科電子雜志，2015，2（3）：157－160.