許 超，彭 科，王文生，于 敏，孫力華，楊 樺 (第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院普通外科，重慶400037)

甘露糖結(jié)合凝集素(mannose-binding lectin，MBL)屬于凝集素家族的成員，是一種鈣離子依賴性凝集素，其通過糖基識別區(qū)(CRD)選擇性識別病毒、真菌等，促進免疫細胞吞噬并且活化補體通路起到免疫防御作用［1-3］。有研究［4］顯示MBL 可以直接與細胞表面的MBL 受體結(jié)合，發(fā)揮調(diào)控炎癥、促凋亡和調(diào)理素等生物學(xué)功能。近來有研究顯示高濃度的MBL 與細胞凋亡相關(guān)，如Wang 等［5-6］的研究顯示MBL 與U937 細胞、單核細胞結(jié)合，可促進其凋亡;Schlagwein 等［7］的研究表明在腎移植中MBL 分泌增多直接促進腎小管上皮細胞凋亡。近來發(fā)現(xiàn)MBL 表達在腸道上皮細胞［8］，但腸道表達MBL 的具體作用及機制目前研究并不清楚。我們發(fā)現(xiàn)在脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激后的腸上皮細胞MBL 表達升高，同時，腸上皮細胞凋亡增加。但是二者之間是否相關(guān)，腸道表達MBL是否參與了上皮細胞增殖凋亡調(diào)控過程，目前研究尚未見相關(guān)報道。因此我們用重組甘露糖結(jié)合凝集素(recombinant human Mannose-binding lectin，rhMBL)處理腸上皮細胞，探討MBL 對腸上皮細胞凋亡的影響，并初步探討其分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人結(jié)腸癌上皮Caco-2 細胞株購自中國科學(xué)院細胞庫;細胞培養(yǎng)箱購自日本Sanyo 公司;胎牛血清MEM 培養(yǎng)基購自美國HyClone 公司;胰蛋白酶購自美國BBI 公司;Bax、Bcl-2 抗體購自Millipore 公司;聚偏二氟乙烯(PDVF)膜購自美國Millipore公司;WB 垂直電泳儀和半干電轉(zhuǎn)儀購自美國Bio-Rad 公司;RIPA 裂解液、蛋白測定試劑盒和SDS-PAGE 凝膠配置試劑盒均購自武漢博士德生物工程公司;凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國KODAK 公司;rhMBL 購自北京義翹神州生物公司;Annexin-VFITC/PI 試劑盒購自南京凱基生物公司;MoFlow 流式細胞儀購自美國Beckman Coulter 公司。

1.2 動物模型的制備

14 只6 ～8 周齡雄性C57 小鼠，體質(zhì)量(21 ±2)g。隨機分為2 組(n=7):假手術(shù)組(Sham 組)、LPS 組。處理前12 h 禁食，自由飲水。LPS 組經(jīng)腹腔注射LPS 溶液10 mg/kg［9］;Sham組給予同等體積的0.9%氯化鈉注射液。觀察5 h 后腹腔注射0.1%的戊巴比妥鈉0.15 mL 麻醉后，腹正中線切開，暴露腸段并取其小腸組織。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) Caco-2 細胞用含10%胎牛血清、1%雙抗、1%非必需氨基酸的MEM 培養(yǎng)基中置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的條件下培養(yǎng)，直至細胞融合80%，用0.2%含EDTA 胰酶消化，按1∶3 傳代培養(yǎng)。

1.3.2 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 取不同濃度的rhMBL 處理Caco-2 細胞后，按Annexin-V-FITC、PI 雙標(biāo)記染色試劑盒說明書操作后用流式細胞儀檢測rhMBL 對Caco-2 細胞凋亡效應(yīng)，計算細胞凋亡率，實驗重復(fù)3 次。

1.3.3 WB 法檢測Bax、Bcl-2、P38 蛋白表達水平 將Caco-2接種于六孔板，不同濃度處理后，用PBS 洗3 次，每孔加入RIPA裂解液(200 μl 含預(yù)冷的PMSF 2 μl)，冰浴20 min，12 000 ×g 4 ℃離心15 min，吸取上清，用蛋白測定試劑盒測定上清液蛋白水平。蛋白上樣后恒壓電泳，200 mA 恒流濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜(用甲醇浸泡)，轉(zhuǎn)膜后，用5%TBST 脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗4 ℃冰箱過夜。TBST 洗膜3 次，每次10 min，然后加入對應(yīng)二抗后，37 ℃溫箱孵育1 h，TBST 洗膜4 次，每次10 min。加入ECL 發(fā)光試劑顯影，采集發(fā)光信號，經(jīng)Kodak Molecular Imaging軟件行密度分析，實驗重復(fù)3 次。

1.3.4 免疫組化染色 石蠟切片脫蠟，二甲苯、乙醇各浸泡10 min，PBS 沖洗3 次，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，枸鹽酸緩沖液，一抗室溫下孵育2 h。DAB 液顯色，蘇木素復(fù)染，自來水沖洗、藍化，中性樹膠封固，晾干后觀察，實驗重復(fù)3 次以上。

1.3.5 分析Bax、Bcl-2 mRNA 水平變化 不同濃度rhMBL處理后48 h，用Trizol(Invitrogen)按試劑盒說明提取細胞總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以合成的cDNA第1 鏈為模板進行擴增(按SYBR Green 試劑盒說明進行)?！鰿t=Ct 目的基因－Ctβ-Actin，△△Ct =△Ct 處理組－△Ct 對照組。不同樣本的目的基因表達的相對差異量=2 －△△Ct，引物序列見表1，實驗重復(fù)3 次以上。

表1 Real-Time PCR 的引物核酸序列

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素方差分析進行組間比較，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 小腸上MBL 表達情況

構(gòu)建LPS 刺激模型，發(fā)現(xiàn)Sham 組MBL 表達在腸上皮細胞處，同時存在隱窩上皮細胞中。LPS 組可見MBL 在腸上皮和隱窩上皮表達明顯增高。Real-Time PCR 結(jié)果顯示LPS 處理組相對表達量為(12.665 ±4.85)，比Sham 組明顯升高(P ＜0.05)，見圖1、圖2。

2.2 LPS 刺激腸上皮細胞凋亡情況

圖1 MBL 免疫組化染色(×100)

Tunel 染色后在800 倍鏡下觀察陽性細胞數(shù)在細胞總數(shù)中的比值，計算凋亡率。在LPS 刺激模型中，Tunnel 染色陽性的腸上皮細胞在小腸可見散在分布(圖3)，LPS 處理組陽性細胞比為(45.27 ±4.85)%，比Sham 組的(5.27 ±0.91)%明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。

圖2 MBL 的mRNA 表達情況

圖3 TUNEL 染色(×800)

2.3 rhMBL 對Caco-2 細胞早期凋亡的影響

不同濃度rhMBL 作用于Caco-2 細胞48 h 后的細胞早期凋亡結(jié)果見圖4。20 μg/mL 的rhMBL 組的細胞凋亡率為(9.22 ±1.16)%，與其余組的(4.08±0.28)%、(4.77±0.76)%、(4.87 ±0.35)%比較明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=41.536，P ＜0.001)。取20 μg/mL 的rhMBL 作用于Caco-2 細胞0、12、24、48 h 后，細胞早期凋亡率分別為(4.01 ± 0.19)%、(4.76 ± 0.24)%、(6.90 ±0.36)%、(9.66 ±0.61)%，逐漸增加，并呈時間依賴性。rhMBL 作用細胞48 h 后細胞凋亡較明顯，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=130.613，P ＜0.05)，見圖5。

圖4 rhMBL 作用后Caco-2 后48 h 細胞早期凋亡率

圖5 20 μg/mL rhMBL 作用后Caco-2 細胞早期凋亡率

2.4 Caco-2 細胞中Bax、Bcl-2 的蛋白和基因表達情況

Bax，Bcl-2 比值Bax/Bcl-2是反應(yīng)細胞凋亡活性的關(guān)鍵指標(biāo)之一。通過Western Blotting 檢測凋亡相關(guān)分子Bax，Bcl-2 的表達，發(fā)現(xiàn)對照組、20 μg/mL rhMBL 組的Bax/Bcl-2 蛋白表達比值分別為(0.81 ±0.06)、(1.10 ±0.05)，結(jié)果分析表明20 μg/mL組與對照組相比明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。Bax/Bcl-2 mRNA 表達的比值，對照組和20 μg/mL rhMBL 組分別是(0.60 ±0.08)、(1.45 ±0.15)，兩者比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01)，見圖6。

圖6 各組Bax、Bcl-2 蛋白和mRNA 的表達

2.5 rhMBL 通過P38 途徑調(diào)控細胞凋亡

為進一步探討rhMBL 調(diào)控細胞凋亡的分子機制，利用Western Blotting 檢測細胞中凋亡相關(guān)信號通路中P38、ERK、JNK 的變化，通過檢測發(fā)現(xiàn)加入rhMBL 組其P-JNK 變化不明顯，而磷酸化P38、ERK 相對表達明顯高于對照組(P ＜0.05)，細胞通過應(yīng)用P38 抑制劑(SB203580)、ERK 抑制劑(U0126)后，發(fā)現(xiàn)加入P38 抑制劑組Bax/Bcl-2 降低明顯(F =5.474，P ＜0.05)，流式凋亡減弱(F=26.107，P ＜0.001)，見圖7 ～9。

圖9 各組流式細胞圖

3 討論

腸黏膜屏障由生物屏障、免疫屏障和機械屏障組成。其中機械屏障是重要屏障之一，是由單層腸上皮細胞通過緊密連接蛋白連接而成，可防止病原微生物、抗原和毒素入血。然而在許多病理情況下如嚴(yán)重感染、休克、急慢性炎癥疾病等可造成腸上皮細胞凋亡脫落，導(dǎo)致屏障功能衰竭。腸道炎癥損傷，誘導(dǎo)腸上皮細胞損傷及凋亡，加重屏障功能衰竭［9-10］。

甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)是一種鈣離子依賴性的C 型凝集素，由2 ～6 條多肽鏈組成，主要由肝細胞合成，并釋放入血［1-2，4］，維持機體固有免疫功能。在體內(nèi)MBL 主要有4 種功能:初始補體活化的功能、不依賴補體的調(diào)理素作用、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和促進凋亡［3］。高濃度MBL 與細胞凋亡密切相關(guān)，Wang 等［5］認為MBL 在2 型糖尿病中表達升高，促進單核細胞凋亡，加重了病情。Schlagwein 等［7］研究發(fā)現(xiàn)腎移植前期，MBL 誘導(dǎo)腎小管上皮細胞凋亡，導(dǎo)致腎臟損傷，在后期主要為補體激活損傷。近年來發(fā)現(xiàn)MBL 表達在腸上皮細胞，是除肝以外表達最多的臟器。而且大量研究表明，在腸缺血再灌注模型中敲除MBL 后可減輕屏障功能損傷［11-12］。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在LPS 刺激后模擬的腸屏障損傷中，腸上皮細胞表達的MBL 升高，同時腸上皮細胞凋亡增加。那么在病理刺激下，腸道高表達的MBL 與腸上皮細胞的凋亡之間是否會存在相關(guān)性，我們進行了相關(guān)研究。

本實驗結(jié)果顯示，腹腔注射LPS 后，腸道上皮細胞凋亡明顯增加，同時觀察到MBL 表達較對照組增多。為進一步明確MBL 表達升高與上皮細胞凋亡增加的關(guān)系，我們選用Caco-2 細胞，觀察MBL 在體外對其凋亡的影響。首先用流式細胞技術(shù)檢測Caco-2 細胞的早期凋亡情況，發(fā)現(xiàn)給予20 μg/mL 的rhMBL 組早期凋亡明顯高于對照組。凋亡主要是受到促進凋亡和抑制凋亡相互作用的調(diào)控。Bcl-2 基因家族是凋亡調(diào)控基因之一，它能夠通過多種途徑來抑制細胞凋亡。Bax基因家族的功能與之相反，Bax 蛋白通過與Bcl-2 蛋白形成異源二聚體，抑制Bcl-2 基因的抗凋亡作用［13］。因此我們通過Western blotting 法從蛋白水平初步探討細胞凋亡的相關(guān)機制，結(jié)果顯示20 μg/mL rhMBL 處理組的Caco-2 細胞Bax/Bcl-2 比例增高，表明凋亡增加，這與流式細胞術(shù)檢測結(jié)果一致。由此我們推測MBL可能與Bax、Bcl-2 調(diào)控Caco-2 細胞凋亡相關(guān)。但其具體機制尚未見報道。目前有研究［14-15］認為細胞凋亡多與JNK、ERK、P38 信號傳導(dǎo)通路相關(guān)，其中P38 MAPK細胞凋亡中起到重要作用。Wang 等［5］報道，高濃度MBL 通過P38 MAPK 信號通路，促進單核細胞凋亡。因此我們篩查JNK、ERK、P38 通路的活化情況，發(fā)現(xiàn)阻斷P38 途徑，MBL 誘導(dǎo)Caco-2 細胞凋亡受到抑制。因此可以認為高濃度MBL促進Caco-2細胞凋亡的部分機制是通過激活P38 得以實現(xiàn)的。但有研究［7］認為MBL 可以內(nèi)在化進入細胞后促進細胞凋亡，因此MBL如何調(diào)控細胞凋亡的具體機制還需要進一步探討。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)高濃度rhMBL 可促進Caco-2細胞凋亡，并且其可能是通過P38 途徑參與Caco-2細胞凋亡的調(diào)控，提示MBL 在病理情況下升高，可能加重腸黏膜屏障損傷，為預(yù)防屏障損傷提供一個潛在的靶點。

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