劉來珍，孫志華，劉 娟，史靜雪，陳創(chuàng)夫，張 輝

（石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院/動(dòng)物疾病防控兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832003）

布魯氏菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)蛋白BMEI0580基因的原核表達(dá)

劉來珍，孫志華，劉 娟，史靜雪，陳創(chuàng)夫，張 輝*

（石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院/動(dòng)物疾病防控兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832003）

【目的】構(gòu)建布魯氏菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)蛋白BMEI0580基因的原核表達(dá)載體，并進(jìn)行免疫原性及其對(duì)人胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞（HPT-8）細(xì)胞因子表達(dá)量影響的分析?！痉椒ā勘狙芯繌难蚍N布魯氏菌（B.melitensis）標(biāo)準(zhǔn)株16M的基因組中克隆BMEI0580基因片段，亞克隆到pMD19-T載體中并測(cè)序，克隆至表達(dá)載體pET-28a，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pET-28a-BMEI0580利用大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)，并進(jìn)行Western-Blot檢測(cè)，ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞因子的表達(dá)量?！窘Y(jié)果】成功構(gòu)建了pET-28a-BMEI0580原核表達(dá)載體，并在大腸桿菌中成功表達(dá)了BMEI0580基因，經(jīng)過SDS-PAGE檢測(cè)，重組蛋白的分子量大約是57kDa，Western-Blot檢測(cè)其具有免疫特性?！窘Y(jié)論】本實(shí)驗(yàn)成功表達(dá)了布魯氏菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)蛋白BMEI0580基因，為進(jìn)一步研究其免疫性和保護(hù)性奠定了基礎(chǔ)。

布魯氏菌；BMEI0580基因；原核表達(dá)

布魯氏菌?。˙rucellosis）簡(jiǎn)稱布病，是由一種古老細(xì)菌—布魯氏菌（Brucella）引起的一種人畜共患動(dòng)物源性傳染病[1-2]，患病牛、羊等牲畜是該病的主要傳染源。該病主要引起懷孕母畜的流產(chǎn)和公畜睪丸的不對(duì)稱性腫大，人的感染主要表現(xiàn)為波浪熱和持續(xù)性感染等臨床癥狀[3]，嚴(yán)重影響畜牧業(yè)的發(fā)展和人類的健康[4]。目前即沒有研制出能夠有效預(yù)防和控制該病傳播的疫苗，也沒有能夠治愈該病的有效方法。布魯氏菌是一種革蘭氏陰性胞內(nèi)寄生菌，胞內(nèi)寄生和復(fù)制是布魯氏菌的主要毒力特征[5]。布魯氏菌不僅可以通過消化道粘膜和呼吸道粘膜進(jìn)入機(jī)體內(nèi)，還可以通過皮膚、眼結(jié)膜等進(jìn)入機(jī)體內(nèi)，并被宿主體內(nèi)的巨噬細(xì)胞吞噬[6]，雖然布魯氏菌可以在多數(shù)細(xì)胞內(nèi)寄生，但是其仍具有宿主特異性，該菌主要寄生在巨噬細(xì)胞和胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞內(nèi)[7]。有研究表明布魯氏菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)蛋白在布魯氏菌侵入宿主細(xì)胞的過程中起著重要的作用，而且能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生較好的免疫學(xué)反應(yīng)，因?yàn)槠渌赜械脑撎攸c(diǎn)，布魯氏菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)蛋白在該病的診斷和疫苗研制中有著重要的應(yīng)用前景[8-9]。大多數(shù)的分泌蛋白在布魯氏菌侵入宿主細(xì)胞的過程中都起著一定的作用，但是在布魯氏菌侵染細(xì)胞過程中細(xì)菌蛋白是如何與細(xì)胞表面受體相互作用，又是如何幫助細(xì)菌侵入細(xì)胞內(nèi)部的，其具體的分子作用機(jī)制目前還不清楚。本研究選取羊布魯氏菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)蛋白BMEI0580基因?yàn)檠芯繉?duì)象，并構(gòu)建其原核表達(dá)載體，通過Western-Blot檢測(cè)其免疫特性，并通過ELISA方法檢測(cè)其對(duì)三種細(xì)胞因子表達(dá)量的影響，以期為尋找布魯氏菌的保護(hù)性抗原分子和布魯氏菌的免疫診斷、基因疫苗和疾病防控等方面的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌和細(xì)胞

羊種布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)株16M、E.coli DH5α菌株、BL21(DE3)菌株、pET-28a載體菌株由石河子大學(xué)動(dòng)物疾病防控兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；pMD19-T載體購(gòu)自Promega公司；人胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞(HPT-8)由石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院/動(dòng)物疾病防控兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

羊布魯氏菌陽性血清由石河子大學(xué)動(dòng)物疾病防控兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；IPTG購(gòu)自Merck公司；限制性內(nèi)切酶（BamHⅠ/XhoⅠ）、DNA marker、T4連接酶購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；細(xì)菌質(zhì)粒小提取試劑盒以及瓊脂糖凝膠回收試劑盒從北京康為世紀(jì)生物科技有限責(zé)任公司購(gòu)買；HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG、蛋白Marker、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 目的基因擴(kuò)增

根據(jù)GeneBank中羊種布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)株16M的序列設(shè)計(jì)引物，由北京六合華大基因有限公司合成，序列見表1。

表1 PCR引物序列

以羊種布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)株16 M的滅活菌液（100℃金屬浴滅活1h）為模板，進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增，PCR的反應(yīng)體系（20 μL）見表2，反應(yīng)條件見表3。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物4℃保存或直接進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳?；厥漳康幕蚱危⒒厥蘸蟮哪康钠闻cpMD19-T載體在16℃水浴條件下進(jìn)行連接，連接體系（10 μL）見表4，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD19-T-BMEI0580。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并在氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行陽性篩選，通過菌液PCR和雙酶切鑒定陽性克隆，并將提取的質(zhì)粒送上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

表2 PCR反應(yīng)體系

表3 PCR反應(yīng)條件

表4 連接體系

1.4 構(gòu)建BMEI0580基因原核表達(dá)載體

將送公司測(cè)序正確的質(zhì)粒pMD19-T-BMEI0580和pET-28a載體用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段和酶切后的線性pET-28a載體。將目的片段和線性pET-28a載體在T4連接酶的作用下16℃水浴連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)卡那抗性的LB固體培養(yǎng)基篩選陽性克隆，進(jìn)行菌液PCR和酶切鑒定。

1.5 重組蛋白表達(dá)及表達(dá)條件的優(yōu)化

將篩選出的陽性克隆菌在LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200r/min搖床中培養(yǎng)過夜，將過夜菌按1∶100的比例接種至新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min培養(yǎng)1 h左右使其OD值為0.4～0.6，在其他條件不變的情況下，按照不同的誘導(dǎo)劑濃度（終濃度為0.1 mM，0.2 mM，0.6 mM，1 mM）、誘導(dǎo)不同時(shí)間(0 h，4 h，6 h)后收集菌體。取1 mL菌液離心后，棄掉上清，并在離心管中加適量的經(jīng)過稀釋的1×SDS蛋白上樣緩沖液,并在振蕩器上震蕩使菌體和蛋白上樣液充分混勻，在金屬加熱器上100℃加熱 10 min,取20 μL樣品進(jìn)行15%SDS蛋白電泳。觀察電泳結(jié)果。篩選目的基因的最佳表達(dá)條件，并以最佳的誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)，采用AKTA蛋白純化系統(tǒng)純化后進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定。

1.6 重組蛋白的Western-Blot檢測(cè)

篩選出最佳表達(dá)條件后，以最佳誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，并對(duì)該蛋白進(jìn)行純化，經(jīng)SDS-PAGE后，將蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上，以200 mA的電流轉(zhuǎn)膜1h。將膜放入預(yù)先用 TBST緩沖液洗滌后的雜交瓶中，37℃封閉1 h，用TBST緩沖液洗滌NC膜3次，每次10 min。加入1∶200比例稀釋的經(jīng)石河子大學(xué)動(dòng)物疾病防控兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鑒定的羊種布魯氏菌陽性血清，4℃過夜孵育，用TBST緩沖液洗滌NC膜3次，每次10 min，后加入1∶5000比例稀釋的辣根過氧化氫酶標(biāo)記的兔抗羊I gG，37℃孵育1 h，TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min。ECL顯色后拍照。

1.7 細(xì)胞因子的檢測(cè)

將儲(chǔ)存在液氮中的HPT-8細(xì)胞取出，使其在37℃溫水中迅速融化，并轉(zhuǎn)移至預(yù)先加有3 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，800 r/min離心5 min，棄上清，并用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37℃含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)至約90%時(shí)，將細(xì)胞傳至六孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，更換細(xì)胞培養(yǎng)液，并加入已純化的蛋白至終濃度60 ug/mL，作用24 h后取上清[10]，用酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞因子IL-1、IL-10和TNF-α的含量，并用SPSS軟件進(jìn)行方差分析處理，繪制圖形，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因的擴(kuò)增及酶切鑒定

NCBI上羊種布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)株16M的BMEI0580基因片段大別為1416bp，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，與預(yù)期的大小一致，如圖1所示。用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶（BamHⅠ/XhoⅠ）進(jìn)行雙酶切后，用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，得到大小與預(yù)期結(jié)果相符的基因條帶，表明羊種布魯氏菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)蛋白BMEI0580基因已成功插入pET-28a表達(dá)載體中，如圖2所示。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳圖

圖2 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定

2.2 重組蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化

為尋找重組蛋白表達(dá)的最佳誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)劑濃度，分別在誘導(dǎo)劑濃度不變的前提下，設(shè)置時(shí)間梯度篩選最佳誘導(dǎo)時(shí)間；在誘導(dǎo)時(shí)間不變的前體下，設(shè)置誘導(dǎo)劑濃度梯度，篩選最佳誘導(dǎo)劑濃度，進(jìn)而篩選出最佳的誘導(dǎo)條件。結(jié)果顯示誘導(dǎo)劑IPTG的終濃度為0.1 mmol/L誘導(dǎo)6 h時(shí)重組蛋白表達(dá)量最高，如圖3所示。蛋白大量誘導(dǎo)表達(dá)后經(jīng)AKTA蛋白純化系統(tǒng)純化，SDS-PAGE分析表明純化后的蛋白條帶清晰，雜帶較少，表明純化效果較好，結(jié)果如圖4所示。

2.3 western-Blot檢測(cè)

對(duì)誘導(dǎo)6 h后的重組蛋白純化后進(jìn)行Western-Blot檢測(cè)，200 mA恒流電流下轉(zhuǎn)膜1 h，觀察結(jié)果，可見明顯的陽性條帶，結(jié)果表明，誘導(dǎo)得到的重組蛋白能被HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG抗體識(shí)別，且大小與pET-28分子質(zhì)量加上目標(biāo)分子蛋白質(zhì)量的重組蛋白總分子質(zhì)量相符，結(jié)果如圖5所示。

圖3 重組蛋白在IPTG誘導(dǎo)不同時(shí)間的SDS-PAGE結(jié)果

圖4 SDS-PAGE電泳檢測(cè)純化后重組蛋白

圖5 表達(dá)產(chǎn)物的Western blot分析

2.4 細(xì)胞因子的表達(dá)

細(xì)胞因子IL-1、IL-10和TNF-α的含量結(jié)果如圖6所示，加入BMEI0580重組蛋白后IL-1、IL-10和TNF-α的表達(dá)與PBS對(duì)照組相比均無明顯變化（P＞0.05）。

3 討 論

在我國(guó)，布魯氏菌病被列為二類動(dòng)物傳染病，疫苗免疫預(yù)防和檢疫凈化是防控布魯氏菌病的關(guān)鍵[4]。雖然目前國(guó)內(nèi)現(xiàn)用的疫苗有一定的免疫效果，但是就其免疫效果來看，并未達(dá)到我們所期望的結(jié)果，而且，部分疫苗難以區(qū)分疫苗免疫和自然野毒株菌感染，為檢疫凈化帶來諸多困難[11]。

圖6 細(xì)胞因子分泌量

在布魯氏菌侵染主要宿主細(xì)胞—巨噬細(xì)胞和胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞的過程中，粘附在細(xì)胞表面的絕大部分細(xì)菌被巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞殺死，然而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的布魯氏菌不僅可以逃過宿主細(xì)胞的免疫清除機(jī)制，而且還可以調(diào)控宿主細(xì)胞的自噬和抑制宿主細(xì)胞的凋亡，從而提高細(xì)菌在宿主細(xì)胞內(nèi)的存活率，雖然目前有人正在研究布魯氏菌侵染細(xì)胞過程中涉及到的各種作用機(jī)制，但是其具體的免疫逃逸機(jī)制目前仍不清楚。

自2002年羊種布魯氏菌16M參考基因組測(cè)序完成以來，已經(jīng)有300多株布魯氏菌基因組完成了測(cè)序，其中有16株基因組已經(jīng)完成了精細(xì)物理圖譜的繪制[12]。雖然部分布魯氏菌株的基因組序列測(cè)序已經(jīng)完成，使我們?cè)诜肿訉用嫔蠈?duì)布魯氏菌的致病機(jī)理有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)，但是有關(guān)方面的研究相對(duì)較少。隨著基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等學(xué)科的產(chǎn)生和發(fā)展，我們對(duì)蛋白質(zhì)的功能有了進(jìn)一步的了解，但是大部分蛋白質(zhì)的功能還不為人知。本文以布魯氏菌的分泌蛋白BMEI0580為研究對(duì)象，研究其對(duì)細(xì)胞因子表達(dá)量的影響，為進(jìn)一步解釋布魯氏菌蛋白質(zhì)功能提供數(shù)據(jù)。

有研究表明IV型分泌系統(tǒng)(type IV secretion system,T4SS)在布魯氏菌的侵入機(jī)體或細(xì)胞的過程中起著重要的作用。與細(xì)菌所具有的其他幾種分泌系統(tǒng)相比，T4SS不但可以轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)，還可以轉(zhuǎn)運(yùn)一些核糖核蛋白復(fù)合物[13]。細(xì)菌的分泌系統(tǒng)能將部分蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到胞質(zhì)外環(huán)境，從而有利于細(xì)菌的胞內(nèi)生存。對(duì)于致病性細(xì)菌而言，分泌性的蛋白不僅能夠在細(xì)菌粘附、定殖和侵入宿主細(xì)胞等過程中發(fā)揮重要的作用，而且能夠調(diào)理宿主細(xì)胞的免疫活性，從而幫助細(xì)菌逃脫細(xì)胞的免疫殺傷作用[14]。在本研究中，布魯氏菌重組蛋白感染細(xì)胞后，細(xì)胞因子IL-1、IL-10和TNF-α的表達(dá)量與PBS對(duì)照組相比都沒有發(fā)生明顯的變化。目前雖有關(guān)于T4SS、自噬和凋亡的研究，但是它們之間的相互關(guān)系還不清楚。本文選取布魯氏菌的分泌蛋白BMEI0580，通過原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出了該蛋白并初步研究了免疫特性，測(cè)定了重組蛋白對(duì)三種細(xì)胞因子表達(dá)量的影響，為進(jìn)一步研究IV型分泌系統(tǒng)蛋白在布魯氏菌侵染細(xì)胞過程中的作用提供了參考。

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Prokaryotic Expression of BrucellaⅣSecretion System Protein BMEI0580 Gene

LIU Lai-zheng,SUN Zhi-hua,LIU Juan,SHI Jing-xue,CHEN Chuang-fu,ZHANG Hui*
(Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Disease,College of Animal Science&Technology,Shihezi University,Shihezi 832003,China)

[Objective]To construct a prokaryotic expression vector for BrucellaⅣ secretion system protein BMEI0580 gene,analyze effect of protein to the expression of Embryonic trophoblast’s cytokines.[Methods] In this study,the BMEI0580 gene was obtained from Brucella melitensis 16M genome,connected to the vector of pMD19-T,cloned to expression vector pET-28a and constructed recombinant plasmids pET-28a-BMEI0580 to be expressed in E.coli BL21(DE3),and analysised by Western-Blot,then detected cytokines levels.[Results]It suggests that got recombinant plasmids pET-28a-BMEI0580,and it has expressed into protein.The SDS-PAGE showed a protein band with relative molecular weight of 57kDa,the Western-Blot test showed that it had immunological characteristics.[Conclusion]The study has successfully expressed the BrucellaⅣsecretion system protein BMEI0580 gene，it laid the foundation for further study its immunity and protection.

brucella；BMEI0580 gene；prokaryotic expression

S855.1+2

：A

：1003－6377（2015）05－0020-06

國(guó)家自然科學(xué)基金（31460650）

劉來珍(1988-)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)椴剪斒暇虏C(jī)制的研究，E-mail:liu859LSQC@163.com

張輝（1978-），男，副教授，從事傳染病診斷與致病機(jī)制的研究，E-mail:allanzhh@yahoo.com

2015-06-18，

2015-06-29