孫 慧，谷亞冰，馬麗媛，肖云花，梁伊麗，劉學(xué)端

（1．中南大學(xué) 生物冶金教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410083；2．中南大學(xué) 資源加工與生物工程學(xué)院，湖南 長沙 410083）

我國有色金屬礦產(chǎn)資源品位低，組成復(fù)雜，難于處理，常規(guī)選冶成本較高，易造成環(huán)境污染等問題。生物冶金技術(shù)可以利用微生物將硫化礦等礦物中的非水溶性有價(jià)金屬轉(zhuǎn)變成可溶形式加以回收，是低品位硫化礦選冶的重要技術(shù)［1］。

生物冶金系統(tǒng)中，微生物的作用有非接觸機(jī)制和接觸機(jī)制。非接觸機(jī)制是指浮游細(xì)菌將浸出體系或硫化礦氧化過程中產(chǎn)生的Fe2＋氧化成Fe3＋，F(xiàn)e3＋作為強(qiáng)氧化劑進(jìn)一步氧化分解硫化礦，從而浸出有價(jià)金屬；而接觸機(jī)制是指浸礦微生物吸附于礦物表面，產(chǎn)生相關(guān)的酶（如鐵氧化酶和硫氧化酶），直接將硫化礦氧化分解為金屬離子和硫，細(xì)菌進(jìn)一步將硫氧化為硫酸［2］。研究發(fā)現(xiàn)，生物浸出過程中，微生物及其分泌的胞外多聚物（extracellular polymeric substances，EPS）以生物膜的形式吸附在礦物表面，營造自身生長的微環(huán)境，在有價(jià)金屬浸出過程中發(fā)揮重要作用［3］。

生物膜是與浮游生長相對應(yīng)的一種生長方式。生物膜內(nèi)的細(xì)胞相互協(xié)調(diào)，以多細(xì)胞群體形式組成復(fù)雜結(jié)構(gòu)，其形成是十分復(fù)雜的生物學(xué)、化學(xué)過程，且受環(huán)境因素影響［4］。對生物冶金體系中生物膜的形成及其與礦物之間的作用機(jī)制的研究尚處于起步階段。本文綜述了近年來生物冶金體系中生物膜的組成、生物膜的形成過程及與礦物浸出的關(guān)系，以及生物膜調(diào)控機(jī)制方面的最新進(jìn)展。

1 浸礦微生物生物膜的組成

生物冶金體系中，吸附在礦物表面的微生物本身及其分泌的EPS，以及部分浸出產(chǎn)物如單質(zhì)硫、非水溶性多硫化合物、鐵礬、硫酸鉛等在礦物表面與溶液之間組成生物膜［5-6］。生物膜中的胞外多聚物主要包括多糖、蛋白質(zhì)、核酸和脂類，它們介導(dǎo)微生物礦物表面的附著，形成一個(gè)具有三維結(jié)構(gòu)的聚合物網(wǎng)絡(luò)，保證生物膜的機(jī)械穩(wěn)定性；此外，作為一個(gè)外部消化系統(tǒng)，胞外多聚物使胞外酶能夠接近細(xì)胞，代謝可溶性、膠體或固體的生物物質(zhì)［7］。

近年來，隨著熒光標(biāo)記、共聚焦激光掃描顯微鏡、原子力顯微鏡、基因組學(xué)和蛋白組學(xué)等新興技術(shù)的發(fā)展，浸礦菌中新的生物膜組分相繼被發(fā)現(xiàn)［8］。S．Bellenberg等［9］利用熒光標(biāo)記的伴刀豆凝集素發(fā)現(xiàn)以亞鐵為能源培養(yǎng)的acidithiobacillus ferrooxidans ATCC 23270生物膜中含少量的莢膜多糖（capsular polysaccharides，CPS），將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到黃鐵礦中培養(yǎng)，24h后產(chǎn)生大量CPS。在培養(yǎng)基中補(bǔ)充葡萄糖或半乳糖可以誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生CPS，而酪蛋白氨基酸不能誘導(dǎo)產(chǎn)生CPS［9］。蛋白組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，acidithiobacillus thiooxidans生物膜中含有一種新的脂蛋白licanantase，該蛋白屬于OMP40類蛋白，能夠促使細(xì)胞吸附到礦物表面的疏水區(qū)域，參與電子傳遞，有利于細(xì)菌定植和氧化礦物［10］。以硫?yàn)槟茉磁囵B(yǎng) A．ferrooxidans細(xì)胞，蛋白組學(xué)技術(shù)分析表明，EPS中的蛋白質(zhì)含有豐富的巰基和CXXC結(jié)構(gòu)域，可以通過Pr-SH與硫元素結(jié)合，直接參與對硫的代謝。近年來，在多種微生物中發(fā)現(xiàn)一種類似菌毛的蛋白質(zhì)細(xì)絲——納米線。納米線是生物膜的重要組分，具有獨(dú)特的胞外電子轉(zhuǎn)移能力。A．ferrooxidans的Ⅳ型菌毛（TFP）具有導(dǎo)電能力，電子經(jīng)氧化還原蛋白之間的電子傳遞反應(yīng)沿TFP傳導(dǎo)，在礦物、可溶性電子傳遞中間體和外膜細(xì)胞色素間形成電流，加快生物膜上電子傳遞速率，形成細(xì)胞表面和Fe（Ⅱ）氧化物之間的電子傳遞通路。TFP的結(jié)構(gòu)域蛋白由保守氨基酸序列組成，有2個(gè)基因pilV和pilW編碼。pilV是吸附基因，而pilW是用于編碼TFP的主要蛋白質(zhì)［11-14］。

浸礦微生物的胞外多聚物主要由中性糖、糖醛酸和脂肪酸組成，由于生長基質(zhì)、菌種類型及培養(yǎng)時(shí)間不同，生物膜的組成和含量也不同［15］。由亞鐵或黃鐵礦培養(yǎng)的A．ferrooxidans和leptospirillum ferrooxidans等鐵氧化菌的EPS中普遍存在巖藻糖、鼠李糖、葡萄糖和糖醛酸；而以硫?yàn)槟茉磁囵B(yǎng)的浸礦微生物，如A．thiooxidans的EPS中糖的含量相對較少，主要成分是葡萄糖，且未檢測到糖醛酸［15］。生物膜中脂類物質(zhì)主要為脂多糖、脂肪酸和脂蛋白，脂多糖在培養(yǎng)中期較多，脂肪酸的主要成分包括二十二烷酸、十八烷酸和十六烷酸等［2-3］。此外，在含鐵能源培養(yǎng)的微生物胞外多聚物中檢測到三價(jià)鐵離子，糖醛酸等胞外多聚物通過絡(luò)合鐵離子影響界面浸出過程。分別以A．ferrooxidans、L．ferrooxidans和 L．ferriphilum氧化黃鐵礦，發(fā)現(xiàn)EPS中鐵含量與氧化活性成正比［16-18］。

2 生物膜的形成與礦物浸出

浸礦微生物能分泌各種胞外物質(zhì)，通過形成生物膜吸附在礦物表面，形成一個(gè)10～100nm的反應(yīng)空間，使礦物逐步溶解［18］。細(xì)菌生物膜增殖的程度及其吸附率與生物膜的活性緊密相關(guān)［16，19］。

用原子力顯微鏡、拉曼光譜和熒光標(biāo)記技術(shù)對黃鐵礦浸出時(shí)生物膜的狀況的研究表明，浸礦微生物形成單層生物膜，培養(yǎng)初期細(xì)胞開始吸附到礦物表面，吸附力是弱的非共價(jià)作用力；浸出中期吸附的細(xì)胞數(shù)量達(dá)到最大值；后期隨著生物氧化時(shí)間增加，礦物表面生物膜逐漸減少。結(jié)果顯示，在黃鐵礦表面生物氧化S0的過程中，細(xì)菌分泌較多的EPS，而EPS緊密吸附在黃鐵礦表面，F(xiàn)e（Ⅲ）通過接觸機(jī)制氧化礦物，這表明EPS在微生物和礦物表面相互作用中扮演重要角色［20-21］。

對黃銅礦表面及溶液中微生物的分布規(guī)律的研究表明：生物浸出前期，生物膜通過富集鐵離子氧化分解礦物；浸出中期，當(dāng)生物膜的量達(dá)到最大時(shí)，溶液中的游離微生物大量生長，促進(jìn)鐵的氧化還原和可溶性硫的氧化；浸出后期，黃鉀鐵礬的形成抑制礦物表面微生物和營養(yǎng)物的流動(dòng)及相應(yīng)的反 應(yīng)，從而阻礙黃銅礦的浸 出［22-25］。N．A．Olivera等［26］首次利用二維不均勻的生物膜模型研究生物浸出時(shí)的生化反應(yīng)，結(jié)果表明，隨浸出的進(jìn)行，礦物表面形成不滲透固體層，這個(gè)固體鈍化層阻礙 O2、CO2、Cu2＋和Fe2＋的擴(kuò)散，而這些物質(zhì)決定細(xì)菌和礦物反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)?；茏责B(yǎng)微生物形成的生物膜能夠通過形成腐蝕坑、硫溶解增加固體層孔隙率來延遲鈍化。與較厚的生物膜相比，平坦的生物膜更有利于生物浸出，因它更利于硫的溶解而不是鐵的氧化。

在生物浸礦過程中，礦物表面的形態(tài)轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)生物膜的結(jié)構(gòu)變化。J．V．García-Meza等［27］利用拉曼光譜、EPS生化分析和熒光顯像技術(shù)研究了A．thiooxidans氧化塊狀黃銅礦電極（massive chalcopyrite electrodes，MCE）過程中礦物表面Sn2-／S0的動(dòng)態(tài)變化和生物膜的轉(zhuǎn)變。最初，MCE的表面包含具有活性的二級Sn2-和S0的混合物，微生物形成厚的單層生物膜。隨著細(xì)菌對S0／Sn2-的不斷氧化，礦物表面形成穩(wěn)定的CuS和S0簇狀物，而生物膜中脂質(zhì)和蛋白質(zhì)逐漸增多，降低了細(xì)胞和礦物表面的界面張力，克服細(xì)胞與礦物表面間的屏障，有利于細(xì)胞和礦物直接接觸進(jìn)行氧化反應(yīng)，這為后期生物膜的分層提供了有利條件。

3 浸礦微生物生物膜的調(diào)控

生物膜是細(xì)胞間相互協(xié)調(diào)，以多細(xì)胞群體形式組成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，它的形成受環(huán)境因子、細(xì)胞密度和信號分子的調(diào)控。

群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）是依賴細(xì)胞密度的一種細(xì)胞間的信號機(jī)制，由可擴(kuò)散的自誘導(dǎo)物（autoinducers，AIs）介導(dǎo)細(xì)胞間的信號傳遞，可與影響生物膜結(jié)構(gòu)的因素相互作用，影響生物膜的形成和功能。薄層色譜法分析結(jié)果表明，A．ferrooxidans和A．thiooxidans菌株都能夠產(chǎn)生?；呓z氨酸內(nèi)酯 （acyl-homoserine lactone，AHL）信號分子，但L．ferrooxidans菌株不能。AHL具有不同長度的?；?，AHL混合物抑制細(xì)胞吸附到黃鐵礦等礦物表面，而具有長?；湥?2或14個(gè)碳）的單一信號分子可以增強(qiáng)吸附。這些發(fā)現(xiàn)有利于控制酸性礦山廢水（AMD）污染和改善生物浸礦過程，為研究生物冶金開拓了新的視角［28］。

與其他革蘭氏陰性菌一樣，A．ferrooxidans的官能團(tuán)AI-1型QS系統(tǒng)由4個(gè)分子元件組成：AHL合成酶（由AfeI編碼），結(jié)合信號分子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子（AfeR），二元配合物［AfeR-AHL］作用的Afe-盒，不同的高絲氨酸內(nèi)酯（AHL）信號分子［29］。當(dāng)細(xì)菌密度或營養(yǎng)條件變化時(shí)，AfeI就會合成AHL信號分子，這些分子具有不同的C-3基團(tuán)（氧或羥基），其?；溨刑荚訑?shù)為8～16個(gè)。AfeR基因和群體感應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白能夠識別具有不同長度酰基鏈的信號分子。信號分子隨細(xì)菌數(shù)目的增加而增加，達(dá)到一定濃度后，細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)外就會感知并引發(fā)一系列反應(yīng)，調(diào)節(jié)生物膜的形成［30-31］。此外，相比于鐵培養(yǎng)的細(xì)胞，在高能固體底物如硫中生長的細(xì)胞，AfeI基因具有更高的轉(zhuǎn)錄水平［32-33］。

除 AHL信號分子外，A．ferrooxidans ATCC 23270具有編碼第二信使環(huán)二鳥苷酸（c-di-GMP）相關(guān)的酶系，調(diào)控生物膜的形成和胞外多糖的生成［34］。環(huán)二鳥苷酸（c-di-GMP）在細(xì)胞中的量取決于二鳥苷酸環(huán)化酶（DGCS，具有GGDEF結(jié)構(gòu)域）和磷酸二酯酶（PDE，具有EAL或 HD-GYP結(jié)構(gòu)域）的活性。A．ferrooxidans ATCC 23270的基因組序列分析確定了5個(gè)編碼DGC和PDE——類似蛋白的開放閱讀框：其中，AFE＿0053，AFE＿1360，AFE＿1373和 AFE＿1379具有GGDEF和EAL結(jié)構(gòu)域，編碼雙功能蛋白；AFE＿1852只有一個(gè)EAL結(jié)構(gòu)域［35］。A．ferrooxidans生物膜細(xì)胞中c-di-GMP的量明顯高于浮游細(xì)胞，其浸礦效率也更高。此外，與亞鐵中浮游細(xì)胞相比，吸附在硫鐵礦表面的細(xì)胞的c-di-GMP水平更高，說明具有GGDEF／EAL結(jié)構(gòu)域的蛋白在鐵氧化菌的生物膜中優(yōu)先表達(dá)［36］。

4 展望

生物膜是微生物營造自身生長微環(huán)境的主要物質(zhì)，在完善生物膜組分的基礎(chǔ)上，深入研究各種浸礦微生物生物膜的特性、生物膜形成與細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化、細(xì)胞代謝過程及浸礦環(huán)境參數(shù)之間的動(dòng)態(tài)聯(lián)系，可逐步了解微生物浸礦規(guī)律。隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，在基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等水平上研究生物膜的形成與調(diào)控機(jī)制，建立有效消除鈍化膜的關(guān)鍵技術(shù)，對提高生物冶金細(xì)菌浸出速率和金屬回收率有重要意義。

［1］Takakuwa S，F(xiàn)ujimori T，Iwasaki H．Some Properties of Cell-sulfur Adhesion in Thiobacillus Thiooxidans［J］．Journal of General Applied Microbiology，1979，25：21-29．

［2］Sand W，Gehrke T．Extracellular Polymeric Substances Mediate Bioleaching via Interfacial Processes Involving Iron（Ⅲ）Ions and Acidophilic Bacteria［J］．Research in Microbiology，2006，157（1）：49-56．

［3］Zeng W M，Qiu G Z，Zhou H B，et al．Characterization of Extracellular Polymeric Substances Extracted During the Bioleaching of Chalcopyrite Concentrate［J］．Hydrometallurgy，2010，100（3）：177-180．

［4］Liang Y，Gao H，Chen J，et al．Pellicle Formation in Shewanella Oneidensis［J］．BMC Microbiology，2010，10（1）：291-301．

［5］Sampson M I，Phillips C V，Blake R C．Influence of the Attachment of Acidophilic Bacteria During the Oxidation of Mineral Sulfides［J］．Minerals Engineering，2000，13（4）：373-389．

［6］Sand W，Gehrke T．Extracellular Polymeric Substances Mediate Bioleaching via Interfacial Processes Involving Iron（Ⅲ）Ions and Acidophilic Bacteria［J］．Research in Microbiology，2006，157（1）：49-56．

［7］Flemming H C，Wingender J．The Biofilm Matrix［J］．Nature Reviews Microbiology，2010，8（9）：623-633．

［8］Jerez C A．The Use of Genomics，Proteomics and Other OMICS Technologies for the Global Understanding of Bio-mining Microorganisms［J］．Hydrometallurgy，2008，94（1）：162-169．

［9］Bellenberg S，Leon-Morales C F，Sand W，et al．Visualization of Capsular Polysaccharide Induction in Acidithiobacillus Ferrooxidans［J］．Hydrometallurgy，2012，129：82-89．

［10］Fazzini R A B，Levican G，Parada P．Acidithiobacillus Thiooxidans Secretome Containing A Newly Described Lipoprotein Licanantase Enhances Chalcopyrite Bioleaching Rate［J］．Applied Microbiology and Biotechnology，2011，89（3）：771-780．

［11］Strycharz-Glaven S M，Snider R M，Guiseppi-Elie A，et al．On the Electrical Conductivity of Microbial Nanowires and Biofilms［J］．Energy ＆ Environmental Science，2011，4（11）：4366-4379．

［12］El-Naggar M Y，Wanger G，Leung K M，et al．Electrical Transport along Bacterial Nanowires From Shewanella Oneidensis MR-1［J］．Proceedings of the National Academy of Sciences，2010，107（42）：18127-18131．

［13］Nielsen L P，Risgaard-Petersen N，F(xiàn)ossing H，et al．Electric Currents Couple Spatially Separated Biogeochemical Processes in Marine Sediment［J］．Nature，2010，463（7284）：1071-1074．

［14］Li Y，Li H．TypeⅣ Pili of Acidithiobacillus Ferrooxidans Can Transfer Electrons From Extracellular Electron Donors［J］．Journal of Basic Microbiology，2014，54（3）：226-231．

［15］Harneit K，G ksel A，Kock D，et al．Adhesion to Metal Sulfide Surfaces by Cells of Acidithiobacillus Ferrooxidans，Acidithiobacillus Thiooxidans and Leptospirillum Ferrooxidans［J］．Hydrometallurgy，2006，83（1）：245-254．

［16］Africa C J，van Hille R P，Sand W，et al．Investigation and in Situ Visualisation of Interfacial Interactions of Thermophilic Microorganisms With Metal-sulphides in A Simulated Heap Environment［J］．Minerals Engineering，2013，48：100-107．

［17］Kinzler K，Gehrke T，Telegdi J，et al．Bioleaching：A Result of Interfacial Processes Caused by Extracellular Polymeric Substances（EPS）［J］．Hydrometallurgy，2003，71（1）：83-88．

［18］Vera M，Schippers A，Sand W．Progress in Bioleaching：Fundamentals and Mechanisms of Bacterial Metal Sulfide Oxidation：Part A［J］．Applied Microbiology and Biotechnology，2013，97（17）：7529-7541．

［19］Africa C J，Harrison S T L，Becker M，et al．In Situ Investigation and Visualisation of Microbial Attachment and Colonisation in A Heap Bioleach Environment：The Novel Biofilm Reactor［J］．Minerals Engineering，2010，23（6）：486-491．

［20］González D M，Lara R H，Alvarado K N，et al．Evolution of Biofilms During the Colonization Process of Pyrite by Acidithiobacillus Thiooxidans［J］．Applied Microbiology and Biotechnology，2012，93（2）：763-775．

［21］Lara R H，Valdez-Pérez D，Rodr Guez A G，et al．Interfacial Insights of Pyrite Colonized by Acidithiobacillus Thiooxidans Cells Under Acidic Conditions［J］．Hydrometallurgy，2010，103（1）：35-44．

［22］Devasia P，Natarajan K A，Sathyanarayana D N，et al．Surface Chemistry of Thiobacillus Ferrooxidans Relevant to Adhesion on Mineral Surfaces［J］．Applied and Environmental Microbiology，1993，59（12）：4051-4055．

［23］Crundwell F K．How do Bacteria Interact With Minerals［J］．Hydrometallurgy，2003，71（1）：75-81．

［24］Beech I B，Sunner J．Biocorrosion：Towards Understanding Interactions Between Biofilms and Metals［J］．Current O-pinion in Biotechnology，2004，15（3）：181-186．

［25］Zeng W，Tan S，Chen M，et al．Detection and Analysis of Attached Microorganisms on the Mineral Surface During Bioleaching of Pure Chalcopyrite With Moderate Thermophiles［J］．Hydrometallurgy，2011，106（1）：46-50．

［26］Olivera N A，Picioreanu C，Asenjo J A．Non-homogeneous Biofilm Modeling Applied to Bioleaching Processes［J］．Biotechnology and Bioengineering，2010，106（4）：660-676．

［27］García-Meza J V，F(xiàn)ernández J J，Lara R H，et al．Changes in Biofilm Structure During the Colonization of Chalcopyrite by Acidithiobacillus Thiooxidans［J］．Applied Microbiology and Biotechnology，2013，97（13）：6065-6075．

［28］Ruíz L M，Valenzuela S，Castro M，et al．AHL Communication is A Widespread Phenomenon in Biomining Bacteria and Seems to be Involved in Mineral-adhesion Efficiency［J］．Hydrometallurgy，2008，94（1）：133-137．

［29］González A，Bellenberg S，Mamani S，et al．AHL Signaling Molecules With A Large Acyl Chain Enhance Biofilm Formation on Sulfur and Metal Sulfides by the Bioleaching Bacterium Acidithiobacillus Ferrooxidans［J］．Applied Microbiology and Biotechnology，2013，97（8）：3729-3737．

［30］Davies D G，Parsek M R，Pearson J P，et al．The Involvement of Cell-to-cell Signals in the Development of A Bacterial Biofilm［J］．Science，1998，280（5361）：295-298．

［31］Hardie K R，Heurlier K．Establishing Bacterial Communities by＇Word of Mouth＇：LuxS and Autoinducer 2in Biofilm Development［J］．Nature Reviews Microbiology，2008，6（8）：635-643．

［32］Ruíz L M，Gonzalez A，F(xiàn)rezza M，et al．Is the Quorum Sensing Type AI-1System of Acidithiobacillus Ferrooxidans Involved in Its Attachment to Mineral Surfaces［J］．Advanced Materials Research，2007，20／21：345-349．

［33］González A，Bellenberg S，Mamani S，et al．AHL Signaling Molecules With A Large Acyl Chain Enhance Biofilm Formation on Sulfur and Metal Sulfides by the Bioleaching Bacterium Acidithiobacillus Ferrooxidans［J］．Applied Microbiology and Biotechnology，2013，97（8）：3729-3737．

［34］Ruíz L M，Castro M，Barriga A，et al．The Extremophile Acidithiobacillus Ferrooxidans Possesses A c-di-GMP Signalling Pathway That Could Play A Significant Role During Bioleaching of Minerals［J］．Letters in Applied Microbiology，2012，54（2）：133-139．

［35］Ruíz L M，Sand W，Jerez C A，et al．C-di-GMP Pathway in Acidithiobacillus Ferrooxidans： Analysis of Putative Diguanylate Cyclases （DGCs）and Phosphodiesterases（PDEs）Bifunctional Proteins［J］．Advanced Materials Research，2007，20／21：551-555．

［36］Ruíz L M，Castro M，Barriga A，et al．The Extremophile Acidithiobacillus Ferrooxidans Possesses A C-di-GMP Signalling Pathway That Could Play A Significant Role during Bioleaching of Minerals［J］．Letters in Applied Microbiology，2012，54（2）：133-139．