邱錫爾 朱冬發(fā) 周彥琦 柳志業(yè) 謝熙

（寧波大學(xué)海洋學(xué)院，寧波 315211）

甲殼動(dòng)物RNAi技術(shù)研究與應(yīng)用進(jìn)展

邱錫爾 朱冬發(fā) 周彥琦 柳志業(yè) 謝熙

（寧波大學(xué)海洋學(xué)院，寧波 315211）

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是指由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘發(fā)的一種使特定基因沉默的現(xiàn)象。作為一種研究基因功能、發(fā)現(xiàn)新基因和抗病毒的新型手段，近年來(lái)RNAi技術(shù)在昆蟲(chóng)、真菌、植物和哺乳動(dòng)物等的研究中已被廣泛應(yīng)用，但是在甲殼動(dòng)物研究中尚處于起步階段。對(duì)甲殼動(dòng)物RNAi技術(shù)實(shí)施方法做了簡(jiǎn)要介紹；著重綜述了RNAi技術(shù)在甲殼動(dòng)物CHH家族神經(jīng)肽類(lèi)基因功能、蛻皮和生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制、配子及性腺發(fā)育調(diào)控和甲殼動(dòng)物抗病毒機(jī)制研究上的應(yīng)用進(jìn)展。

RNAi；甲殼動(dòng)物；基因功能；抗病毒

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是指由內(nèi)源或外源雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘發(fā)轉(zhuǎn)錄后相應(yīng)mRNA水平下降，是一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制（post-transcriptional gene silencing，PTGS）［1］。自Fire等［2］在1998年提出RNAi概念，并在2006獲得諾貝爾獎(jiǎng)至今，RNAi技術(shù)已成為一種研究基因功能、調(diào)控機(jī)制、發(fā)現(xiàn)新基因、抗病毒和傳染病治療的有效新方法，在昆蟲(chóng)、真菌、植物、哺乳動(dòng)物等生物中獲得廣泛應(yīng)用［3-5］。

蝦蟹類(lèi)等甲殼動(dòng)物具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，研究其功能基因的調(diào)控機(jī)制和抗病毒機(jī)制等對(duì)于開(kāi)發(fā)甲殼動(dòng)物資源具有深遠(yuǎn)意義，但是直到2005年才有文獻(xiàn)描述RNAi技術(shù)在甲殼動(dòng)物研究上的應(yīng)用［6，7］。本文對(duì)甲殼動(dòng)物RNAi技術(shù)實(shí)施方法做簡(jiǎn)要介紹，并著重綜述RNAi技術(shù)在甲殼動(dòng)物CHH家族神經(jīng)肽類(lèi)基因功能、蛻皮和生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制、配子及性腺發(fā)育調(diào)控和甲殼動(dòng)物抗病毒機(jī)制研究上的應(yīng)用進(jìn)展。

1 甲殼動(dòng)物RNAi的實(shí)施方法

1.1 注射法

注射法是實(shí)驗(yàn)室研究甲殼動(dòng)物RNAi最常用技術(shù)，一般將dsRNA或siRNA直接注射到甲殼動(dòng)物血淋巴、肌肉（局部組織）或卵粒中，使dsRNA或siRNA迅速到達(dá)靶組織，該方法干擾效率最高［8］。目前制備dsRNA 的方法主要有體外轉(zhuǎn)錄和載體構(gòu)建表達(dá)。體外轉(zhuǎn)錄法用RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄合成單鏈的RNA，再互補(bǔ)成dsRNA；體內(nèi)載體表達(dá)通過(guò)構(gòu)建質(zhì)粒，在細(xì)菌內(nèi)表達(dá)獲得大量dsRNA［8，9］。siRNA 的設(shè)計(jì)和篩選較dsRNA較為繁瑣，目前合成siRNA 的方法包括體外轉(zhuǎn)錄、Dicer 酶切割、PCR 擴(kuò)增和質(zhì)?；虿《颈磉_(dá)siRNA等［10］。已證明注射siRNA也能有效引起基因沉默。例如，給斑節(jié)對(duì)蝦（Penaeus monodon）和日本囊對(duì)蝦（Marsupenaeus Japonicus）注射siRNA均能夠引發(fā)抗白斑綜合癥病毒（white spot syndrome virus，WSSV）作用［10，11］。

1.2 離體培養(yǎng)法

由于甲殼動(dòng)物缺乏研究用的細(xì)胞系或細(xì)胞株，一般直接采用動(dòng)物組織與雙鏈RNA進(jìn)行離體培養(yǎng)。例如，研究者解剖獲取活體斑節(jié)對(duì)蝦的眼柄神經(jīng)節(jié)（剪碎成0.8-1 cm），在M199培養(yǎng)液中加入100 μg/mL青霉素，于24孔培養(yǎng)板在20-24℃條件下震蕩培養(yǎng)3 h和6 h，每孔加入1.5 mL 培養(yǎng)液。同一只對(duì)蝦左側(cè)眼柄用于陰性對(duì)照，與非特異性綠色熒光蛋白雙鏈RNA（dsGFP）共同培養(yǎng)作為對(duì)照組；右側(cè)眼柄分別與3 μg GIH dsRNA共同培養(yǎng)作為實(shí)驗(yàn)組。半定量結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組GIH表達(dá)量下降［12］。

1.3 飼喂法

昆蟲(chóng)RNAi試驗(yàn)多用飼喂法［13］，而甲殼動(dòng)物受生活環(huán)境所限制，飼喂法基因沉默的效率遠(yuǎn)低于注射法。但是注射法耗時(shí)耗力，對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物造成一定傷害；且單次注射的dsRNA 數(shù)量有限。若能解決飼喂手段誘導(dǎo)RNAi效率不高的問(wèn)題，有希望應(yīng)用于大型商業(yè)養(yǎng)殖中，實(shí)現(xiàn)甲殼動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育的人工調(diào)控和抗病毒防治。Treerattrakool等［14］通過(guò)制備能夠高效表達(dá)GIH dsRNA的大腸桿菌E. coli，以成體豐年蟲(chóng)為中間載體喂食給斑節(jié)對(duì)蝦，但RNAi效果明顯不如注射法，有待進(jìn)一步完善。

2 甲殼動(dòng)物RNAi技術(shù)的應(yīng)用

2.1 CHH家族神經(jīng)肽基因功能的研究

甲殼動(dòng)物眼柄中的X-器竇腺?gòu)?fù)合體（X-organsinus gland，XO-SG）合成并分泌甲殼動(dòng)物高血糖激素家族（crustacean hyplyeemic hormone family，CHH家族）激素，包括高血糖激素（crustacean hyperglyeemie hormone，CHH）、蛻皮抑制激素（molt-inhibiting hormone，MIH）、性腺抑制激素（gonad/vitellogenesis-inhibiting hormone，GIH/VIH）等肽類(lèi)激素，這些激素統(tǒng)稱(chēng)為CHH家族神經(jīng)肽，調(diào)控甲殼動(dòng)物糖類(lèi)代謝、蛻皮、繁殖等生理生化過(guò)程［15，16］。

2.1.1 高血糖激素CHH CHH肽類(lèi)激素主要功能是調(diào)控甲殼動(dòng)物體內(nèi)的血糖水平，維持能量供應(yīng)［17］。2006年，Lugo等［18］將CHH dsRNA注射到南方濱對(duì)蝦（Litopenaeus schmitti）的腹部血淋巴，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在24 h 內(nèi)CHH表達(dá)和相應(yīng)血淋巴中的血糖濃度均下降，驗(yàn)證了CHH具有使血糖升高的功能，也說(shuō)明RNAi技術(shù)在甲殼動(dòng)物上應(yīng)用的可行性。

2.1.2 蛻皮抑制激素MIH 甲殼動(dòng)物的蛻皮過(guò)程主要由MIH與Y器分泌的蛻皮激素通過(guò)拮抗作用來(lái)調(diào)節(jié)［19］。Tiu等［20］以雌性刀額新對(duì)蝦（Metapenaeus ensis）為研究對(duì)象，注射MeMIH-B dsRNA后發(fā)現(xiàn)胸腺神經(jīng)節(jié)和眼柄組織中的MeMIH表達(dá)水平下降，且肝胰腺和卵巢組織中卵黃蛋白（vitellogenin，Vg）基因的表達(dá)也隨之下降，證明MeMIH除了抑制蛻皮外，很可能還具有促進(jìn)性腺發(fā)育的功能。向紅螯螯蝦（Cherax quadricarinatus）注射MIH dsRNA可以促進(jìn)其蛻皮的發(fā)生［21］。這些研究結(jié)果驗(yàn)證了MIH激素是調(diào)控甲殼動(dòng)物蛻皮的關(guān)鍵因子，還很有可能參與卵巢發(fā)育的調(diào)控。

2.1.3 性腺抑制激素GIH/VIH GIH/VIH是調(diào)控甲殼動(dòng)物性腺發(fā)育的主要激素［22］。Treerattrakool等［12］在2008年將GIH dsRNA與斑節(jié)對(duì)蝦組織進(jìn)行離體培養(yǎng)試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，雌性對(duì)蝦眼柄和腹部神經(jīng)節(jié)組織中GIH表達(dá)水平降低；將GIH dsRNA注射雌性對(duì)蝦體內(nèi)，結(jié)果顯示卵巢中的Vg表達(dá)水平顯著上升，說(shuō)明GIH對(duì)Vg具有明顯的抑制作用。切除眼柄可以促進(jìn)克氏原螯蝦（P. clarkii）和日本囊對(duì)蝦等多種甲殼動(dòng)物的親本卵巢成熟［23，24］，Treerattrakool等［25］在2011年的研究進(jìn)一步說(shuō)明RNAi技術(shù)可以替代傳統(tǒng)的單側(cè)眼柄切除，有效抑制GIH表達(dá)，從而促進(jìn)卵巢成熟和排卵。隨后，Treerattrakool等［14］嘗試?yán)蔑曃狗ㄌ娲鷇sRNA注射法，結(jié)果顯示GIH表達(dá)水平有明顯下降，但是與注射法結(jié)果相比，誘導(dǎo)基因沉默的效果仍有較大差距。以上研究結(jié)果表明GIH激素很有可能是通過(guò)抑制卵黃蛋白原Vg的生成來(lái)調(diào)節(jié)甲殼動(dòng)物性腺發(fā)育。

2.2 甲殼動(dòng)物蛻皮和生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制的研究

維甲酸類(lèi)X受體（retinoid X receptor，RXR）已證明與甲殼動(dòng)物蛻皮、代謝調(diào)節(jié)、附肢再生等多種生理生化過(guò)程相關(guān)［26，27］。RXR通過(guò)與蛻皮激素受體（ecdysone receptor，EcR）形成二聚體復(fù)合物EcR /RXR，再與蛻皮激素應(yīng)答元件結(jié)合，調(diào)控下游基因E75等轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)相關(guān)生理過(guò)程［28］；也有研究顯示RXR可能是甲殼動(dòng)物激素MF的受體［29］。

Priya等［30］向中國(guó)對(duì)蝦（Fenneropenaeus chinensis）體內(nèi)注射RXR dsRNA，干擾效應(yīng)在48 h達(dá)到高峰，且RXR調(diào)控的下游基因FcE75和兩種幾丁質(zhì)酶（chitinase）基因FcChi和FcChi-1表達(dá)水平均顯著下降。研究已證明，甲殼動(dòng)物幾丁質(zhì)酶能夠降解外骨骼中的幾丁質(zhì)，其水解產(chǎn)物會(huì)重新進(jìn)入到新表皮的合成中，且?guī)锥≠|(zhì)酶受到蛻皮激素調(diào)控，與蛻皮密切相關(guān)［31］。說(shuō)明RXR參與了甲殼動(dòng)物的蛻皮激素信號(hào)通路、調(diào)控下游基因E75和幾丁質(zhì)酶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)［31，32］。隨后Priya等［33］為進(jìn)一步研究E75的功能，通過(guò)持續(xù)注射FcE75 dsRNA誘導(dǎo)E75沉默，阻礙中國(guó)對(duì)蝦蛻皮的發(fā)生并最終導(dǎo)致試驗(yàn)對(duì)象死亡，結(jié)果說(shuō)明E75很可能與蛻皮調(diào)控密切相關(guān)且是中國(guó)對(duì)蝦生長(zhǎng)所必須的基因。

甲基法尼酯（methyl farnesoate，MF）是一種類(lèi)倍半萜烯激素，是甲殼動(dòng)物體內(nèi)一種重要的內(nèi)分泌調(diào)控激素，與生長(zhǎng)繁育、形態(tài)建成、蛻皮、滲透壓調(diào)節(jié)等多種生理過(guò)程有關(guān)［34-37］。FAMeT是MF合成路線(xiàn)中最后階段的關(guān)鍵酶，Hui等［38］為研究FAMeT的功能，向凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）注射LvFAMeT dsRNA，檢測(cè)到眼柄中FAMeT表達(dá)水平明顯下降，與蛻皮有關(guān)的組織蛋白酶-L（cathepsin-L，LvCat-L）和血藍(lán)蛋白（hemocyanin，LvHemo）表達(dá)受到影響，試驗(yàn)對(duì)象蛻皮失敗并最終死亡。研究者推測(cè)FAMeT在MF合成中具有不可替代的作用，LvFAMeT的沉默使MF合成受到阻礙，從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)對(duì)象的生理調(diào)控?zé)o法正常進(jìn)行。該研究結(jié)果顯示FAMeT在凡納濱對(duì)蝦的蛻皮調(diào)控和生長(zhǎng)發(fā)育中起到了重要作用。

已有報(bào)道RXR與甲殼動(dòng)物附肢再生有關(guān)［26，27］。Das等［39］先后切除招潮蟹（Uca pugilator）眼柄和三條步行足、大螯，等待其完全自切殘肢后，在大螯和第三步行足基部早期附肢芽膜內(nèi)注射EcR dsRNA和RXR dsRNA混合物。結(jié)果顯示，招潮蟹再生附肢的生長(zhǎng)速度和形態(tài)均受到明顯影響，EcR與RXR表達(dá)水平顯著下降。通過(guò)顯微鏡切片觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)對(duì)象再生附肢的表皮生長(zhǎng)不良；細(xì)胞增殖試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這些再生失敗的附肢芽中幾乎不存在分裂細(xì)胞；且蛻皮酮類(lèi)激素水平下降，未注射部位附肢也無(wú)法正常再生，說(shuō)明該RNAi實(shí)驗(yàn)并不單是在局部起作用，而是能夠引發(fā)系統(tǒng)性基因沉默（systemic gene silencing）。長(zhǎng)期觀(guān)察發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)對(duì)象多數(shù)蛻皮失敗或死亡，說(shuō)明RNAi實(shí)驗(yàn)對(duì)生物體具長(zhǎng)期影響。

2.3 甲殼動(dòng)物配子發(fā)生和性腺發(fā)育調(diào)控機(jī)制研究

甲殼動(dòng)物的促雄腺（androgenic gland，AG），又稱(chēng)造雄腺、促雄性腺，只存在于雄性個(gè)體中，其功能與甲殼動(dòng)物性腺發(fā)育和性別分化有密切關(guān)系［40］。研究證明，破壞AG對(duì)中國(guó)對(duì)蝦雄性第二特征發(fā)育產(chǎn)生抑制作用，影響交接器生長(zhǎng)；切除和移植AG能誘導(dǎo)多種甲殼動(dòng)物性反轉(zhuǎn)的發(fā)生［41-43］。Rosen等［44］發(fā)現(xiàn)促雄腺特異性類(lèi)胰島素（AG specific insulin-like，IAG）基因在紅螯螯蝦的促雄腺 cDNA消減文庫(kù)中具高效表達(dá)，說(shuō)明可能與AG的特殊生理功能有關(guān)。研究者注射IAG dsRNA來(lái)研究該基因的功能［45］，雄性試驗(yàn)幼體出現(xiàn)雌性性征，精子數(shù)量減少，精巢開(kāi)始退化；促雄腺細(xì)胞過(guò)度膨大，可能是體內(nèi)雄性激素水平低下的反饋?zhàn)饔盟鶎?dǎo)致。說(shuō)明IAG與紅螯螯蝦雄激素生成有關(guān)，其性腺的發(fā)育可能依賴(lài)于該類(lèi)基因的調(diào)控。馬文明等［46］發(fā)現(xiàn)注射促雄腺提取物會(huì)抑制雌性羅氏沼蝦卵巢發(fā)育，顯微觀(guān)察無(wú)卵母細(xì)胞；將促雄腺激素類(lèi)似物的dsRNA通過(guò)心臟注射到性腺發(fā)育成熟雄性個(gè)體后，檢測(cè)到壺腹中MAL表達(dá)量顯著下降，但是對(duì)實(shí)驗(yàn)體表型未產(chǎn)生明顯的影響，推測(cè)RNAi不容易使性腺發(fā)育成熟的沼蝦發(fā)生第二性征退化或性反轉(zhuǎn)。

Kazal型蛋白酶抑制劑（KPI）屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族，MRPINK是一種具有兩個(gè)Kazal型結(jié)構(gòu)域的蛋白酶抑制劑。在羅氏沼蝦中MRPINK可以特異性地抑制精子明膠酶（MSG）的活性，然而MSG在羅氏沼蝦生殖過(guò)程中的生理功能尚不明確。錢(qián)葉青等［47］利用RNAi技術(shù)進(jìn)一步研究MSG在受精過(guò)程中的功能，將MSG dsRNA注射到成熟雄性羅氏沼蝦體內(nèi)。結(jié)果表明，發(fā)生MSG沉默的羅氏沼蝦精子在形態(tài)上未異常，但是精子的明膠水解活性下降，與對(duì)照組相比無(wú)法形成降解圈，說(shuō)明經(jīng)RNAi后的精子在體外存在一定的功能缺陷。隨后發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)雄蝦與正常雌蝦交配受精能正常進(jìn)行，推測(cè)MSG在精子的蛋白水解活性方面存在重要作用，且雌蝦可能會(huì)分泌某些物質(zhì)來(lái)彌補(bǔ)MSG功能缺失。

卵黃磷蛋白是一種高密度糖脂蛋白，是所有卵生動(dòng)物卵黃的主要成分及胚胎和幼體早期發(fā)育主要的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源。卵黃蛋白原（vitellogenin，Vg）是卵黃蛋白的前體。卵黃蛋白原的合成和積累對(duì)于雌性個(gè)體卵母細(xì)胞的發(fā)育和卵子的數(shù)量和質(zhì)量密切相關(guān)，但是Vg的合成部位尚存在爭(zhēng)議。據(jù)現(xiàn)有研究顯示，甲殼動(dòng)物的Vg合成分為內(nèi)源性和外源性?xún)煞N，外源性合成是指卵黃蛋白在卵母細(xì)胞以外的部位合成后通過(guò)血淋巴運(yùn)輸?shù)铰殉玻?8，49］。Tiu等［50］以斑節(jié)對(duì)蝦為研究對(duì)象注射VgR dsRNA來(lái)沉默卵黃蛋白原受體（vitellogenin receptor，VgR）基因，檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)雌蝦卵巢中VgR蛋白含量減少，相反在血淋巴中Vg水平上升。所以該項(xiàng)研究結(jié)果說(shuō)明斑節(jié)對(duì)蝦的Vg合成很可能通過(guò)外源性而來(lái)，其VgR很可能是游離存在于血淋巴中，與肝胰腺等部位合成的卵黃蛋白結(jié)合后運(yùn)輸?shù)铰殉仓械穆涯讣?xì)胞內(nèi)。

RXR在脊椎動(dòng)物的繁殖過(guò)程中起到重要作用［51］，但是 RXR在甲殼動(dòng)物繁殖中的具體功能尚不明確。Nagaraju等［52］發(fā)現(xiàn)在普通濱蟹（Carcinus maenas）的卵黃發(fā)育不同階段，肝胰腺中RXR表達(dá)水平有顯著上升，卵巢中RXR表達(dá)水平只在第三階段略有上升，說(shuō)明RXR與卵巢發(fā)育有關(guān)。離體培養(yǎng)結(jié)果顯示在與MF共同培養(yǎng)的肝胰腺和卵巢組織中，RXR和Vg表達(dá)水平比對(duì)照組顯著上升。體內(nèi)注射RXR dsRNA后，RXR和Vg表達(dá)水平均下降，血淋巴中MF含量也隨之下降。以上結(jié)果說(shuō)明普通濱蟹RXR可能直接參與或與MF共同調(diào)控卵巢發(fā)育過(guò)程。

2.4 甲殼動(dòng)物抗病毒機(jī)制的研究

已證實(shí)RNAi在線(xiàn)蟲(chóng)、果蠅、蚊和植物等生物中是一種天然的抗病毒機(jī)制［5，13］，所以在甲殼動(dòng)物中RNAi很可能是一種對(duì)抗病毒的新型技術(shù)手段。RNAi技術(shù)通過(guò)干擾特定的病毒基因，阻礙病毒復(fù)制，提高實(shí)驗(yàn)對(duì)象存活率。根據(jù)現(xiàn)有的研究，一般認(rèn)為注射病毒特異性siRNA、dsRNA會(huì)明顯抑制病毒的繁殖，注射非特異性siRNA、dsRNA可以誘發(fā)甲殼動(dòng)物體內(nèi)先天抗病毒免疫機(jī)制的發(fā)生，但是抗病毒效果不如特異性雙鏈RNA，且目前對(duì)蝦類(lèi)研究較多。例如，Tirasophon等［53］發(fā)現(xiàn)在斑節(jié)對(duì)蝦體內(nèi)注射dsRNA能誘導(dǎo)抗黃頭病毒（yellow head virus，YHV）的發(fā)生，且病毒特異性dsRNA誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗病毒效果要好于非特異dsRNA。VP15和VP28分別是病毒的一種核衣殼蛋白和囊膜蛋白，在病毒增殖過(guò)程中具有潛在的重要功能。張衡等［54］分別將vp15 基因的特異性dsRNA（vp15-dsRNA）和非特異性dsRNA（gfp-dsRNA）與WSSA病毒共同注射到克氏原螯蝦（P. clarkia）體內(nèi)，結(jié)果顯示vp15-dsRNA能特異性敲除vp15 的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，有效抑制了WSSV病毒粒子的增值，進(jìn)一步揭示vp15蛋白在WSSV增殖以及在病毒裝配過(guò)程中的重要性。Westenberg等［55］發(fā)現(xiàn)給斑節(jié)對(duì)蝦注射病毒VPl5、VP28特異性siRNA和非特異性的siRNA（綠色熒光蛋白GFP）均能引發(fā)特異的抗WSSV作用，但是后者的抗病毒作用不如特異性siRNA顯著。斑節(jié)對(duì)蝦抗菌肽penaeidin5（PenmonPEN5）可能是一種病毒應(yīng)答基因，為研究其具體的功能，Woramongkolchai等［56］發(fā)現(xiàn)PenmonPEN5在斑節(jié)對(duì)蝦血細(xì)胞中表達(dá)量最高；預(yù)先在斑節(jié)對(duì)蝦體內(nèi)注射PenmonPEN5 dsRNA，對(duì)照組注射poly（GC）或NaCl 溶液，隨后分別將WSSV病毒與PenmonPEN5 dsRNA，poly（GC）或NaCl共同注射，實(shí)驗(yàn)組對(duì)蝦血細(xì)胞中VP28表達(dá)顯著上升，說(shuō)明PenmonPEN5在斑節(jié)對(duì)蝦抗病毒機(jī)制中具有重要作用。整合蛋白（integrin）是細(xì)胞黏附受體超家族的成員，已證明可能在細(xì)胞吞噬和附著中具有重要重用，也可以促進(jìn)細(xì)胞增殖和生存。Lin等［57］發(fā)現(xiàn)integrinβ幾乎在凡納濱對(duì)蝦所有組織中表達(dá)，在血細(xì)胞中表達(dá)量特別高；注射integrin β dsRNA后，發(fā)現(xiàn)integrinβ發(fā)生沉默，對(duì)蝦體內(nèi)透明細(xì)胞、顆粒細(xì)胞數(shù)目，血細(xì)胞計(jì)數(shù)和溶菌酶等活性下降，說(shuō)明integrin β參與凡納濱對(duì)蝦的細(xì)胞吞噬過(guò)程，在對(duì)蝦的免疫防御機(jī)制中具有重要地位。這些研究結(jié)果對(duì)于深入了解甲殼動(dòng)物病毒防治具有重要的意義。

但也有研究顯示非特異性雙鏈RNA對(duì)于抗病毒并無(wú)明顯作用。肖瑾［58］用siRNA、dsRNA和幾種免疫刺激物，注射到凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)，研究其引發(fā)的RNAi作用以及非特異性dsRNA可能引起的先天免疫反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，特異性的siRNA能顯著的降低目的基因的表達(dá)量和對(duì)蝦白斑綜合癥病毒（WSSV）的擴(kuò)增速度，在一定程度上能延緩對(duì)蝦的死亡時(shí)間，效果隨著注射量的增加而加強(qiáng)；而非特異性的siRNA對(duì)于抗WSSV并無(wú)作用。Tirasophon等［59］向感染黃頭病毒YHV 的斑節(jié)對(duì)蝦注射YHV蛋白特異性dsRNA發(fā)現(xiàn)，病毒的復(fù)制被明顯抑制，但注射非特異性GFP dsRNA 不能抑制病毒復(fù)制，說(shuō)明只有病毒特異性序列才能誘導(dǎo)RNAi的發(fā)生。這些研究結(jié)果說(shuō)明非特異性雙鏈RNA能否誘導(dǎo)RNAi或甲殼動(dòng)物體內(nèi)先天免疫機(jī)制的發(fā)生可能存在物種差異性，需要進(jìn)一步的研究來(lái)探討。

3 展望

目前，RNAi在甲殼動(dòng)物的相關(guān)研究中有了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。RNAi作為一種新型技術(shù)可以通過(guò)dsRNA高效抑制或阻斷特異性靶基因表達(dá)，代替了傳統(tǒng)的眼柄或組織切除手術(shù)，有效減少實(shí)驗(yàn)體的損傷并提高實(shí)驗(yàn)對(duì)象的存活率。該技術(shù)很可能在今后作為甲殼動(dòng)物研究的一個(gè)突破口，在新基因的發(fā)現(xiàn)、基因功能的研究、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的闡明中發(fā)揮重大作用。由于甲殼動(dòng)物體內(nèi)只有非序列特異性的先天免疫防御應(yīng)答，缺少脊椎動(dòng)物的獲得性免疫應(yīng)答反應(yīng)，且目前對(duì)甲殼動(dòng)物的病毒防御機(jī)制尚未研究透徹，在養(yǎng)殖業(yè)中（特別是對(duì)蝦養(yǎng)殖）缺乏有效的防治病毒的技術(shù)手段。所以RNAi被認(rèn)為是一種具有廣闊實(shí)用前景的新型抗病毒技術(shù)，未來(lái)可能在甲殼動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)的抗病毒中發(fā)揮重要作用。雖然近幾年的研究已經(jīng)表明特異性雙鏈RNA對(duì)于抗病毒具有明顯作用，但是基本采用直接注射的方法。注射法高效誘導(dǎo)特異性RNAi的發(fā)生，但每次注射體積有限，若要大批量應(yīng)用或持續(xù)注射，會(huì)耗費(fèi)大量時(shí)間和人力。若能在今后建立一個(gè)有效的飼喂方式，通過(guò)簡(jiǎn)單的喂食將雙鏈RNA導(dǎo)入試驗(yàn)對(duì)象體內(nèi)，或是能在甲殼動(dòng)物體內(nèi)構(gòu)建一種長(zhǎng)期性表達(dá)病毒特異性雙鏈RNA的體系，有望大批量用于實(shí)踐養(yǎng)殖中，促進(jìn)甲殼動(dòng)物的研究和經(jīng)濟(jì)蝦蟹類(lèi)物種的養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展。

此外，由于甲殼動(dòng)物方面的RNAi研究基礎(chǔ)相對(duì)較為薄弱且研究物種較單一，目前缺乏體外培養(yǎng)用細(xì)胞系。為了今后甲殼動(dòng)物的分子研究、抗病毒和資源利用的進(jìn)一步發(fā)展，有必要盡快開(kāi)展細(xì)胞培養(yǎng)研究和建立甲殼動(dòng)物細(xì)胞系。

綜上所述，隨著對(duì)甲殼動(dòng)物RNAi 研究的不斷深入，相信RNAi技術(shù)將在甲殼動(dòng)物的功能基因組學(xué)、基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制及信號(hào)傳導(dǎo)通路、病毒防治等方面發(fā)揮重要的作用，大力推動(dòng)甲殼動(dòng)物研究進(jìn)展。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Progress of Research and Application of the RNA Interference Technology in Crustacean

Qiu Xier Zhu Dongfa Zhou Yanqi Liu Zhiye Xie Xi
（School of Marine Sciences，Ningbo University，Ningbo 315211）

RNA interference（RNAi）is a phenomenon that the gene is post-transcriptionally inhibited by using specific double-stranded RNA（dsRNA）， gene silencing will be happened eventually. As a new technology， RNAi contributes to the understanding of the the functions and mechanisms of genes. RNAi is widely used in insects， fungus， plants and mammals， however， the reseachs on the crustacean are relatively less than the former. This review highlights the advancements of RNAi in crustaceans， including the study of methods， gene functions about CHH family， mechanisms of molting and gonadal regulation. In addition， RNAi plays an important role in an antiviral defense in crustacean.

RNA interference；crustacean；gene function；antiviral defense

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.008

2014-06-06

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（41376152），浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（LY13C190006）

邱錫爾，女，碩士研究生，研究方向：甲殼動(dòng)物發(fā)育生物學(xué)；E-mail：qxe2013@yeah.net

朱冬發(fā)，男，教授，研究方向：發(fā)育生物學(xué)和遺傳育種學(xué)；E-mail：zhudongfa@nbu.edu.cn