陳杰楊靜龍勝賢肖慈平楊昌義黃清忠王維

（1.貴州省黔東南州煙草公司，凱里 556000；2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草研究室，廣州 510642）

SSR分子標(biāo)記在煙草研究中的應(yīng)用進(jìn)展

陳杰1楊靜1龍勝賢1肖慈平1楊昌義1黃清忠1王維2

（1.貴州省黔東南州煙草公司，凱里 556000；2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草研究室，廣州 510642）

SSR分子標(biāo)記技術(shù)作為最常用的分子標(biāo)記技術(shù)之一，該標(biāo)記技術(shù)重復(fù)性好，結(jié)果可靠，近年來在煙草遺傳育種中展示了廣闊的應(yīng)用前景，是應(yīng)用潛力較大的分子標(biāo)記技術(shù)。介紹了SSR分子標(biāo)記的原理及其分布特征，對其在煙草基因定位及分子標(biāo)記輔助選擇、種質(zhì)資源研究、遺傳圖譜構(gòu)建及種子純度及真?zhèn)舞b定研究中的應(yīng)用等方面進(jìn)行了綜述，并探討了SSR分子標(biāo)記技術(shù)在煙草遺傳育種中的應(yīng)用前景，以期為煙草SSR分子標(biāo)記技術(shù)的研究提供參考。

煙草；分子標(biāo)記；SSR；遺傳育種

在生物個體間，最本質(zhì)的差異是DNA分子水平間的差異，DNA分子標(biāo)記技術(shù)是對遺傳物質(zhì)本身差異的直接檢測，能準(zhǔn)確地反映動植物遺傳組成全貌，因此DNA是最為可靠的遺傳標(biāo)記。DNA分子標(biāo)記能對不同發(fā)育時期的個體、任何組織甚至器官作檢測，其具有數(shù)量豐富、涉及全基因組、遺傳穩(wěn)定、多態(tài)性高、不受外界環(huán)境影響、無上位性作用等一系列顯著優(yōu)點(diǎn)［1］，DNA分子標(biāo)記技術(shù)自誕生之日起，就引起了生物科學(xué)家們極大的興趣。自1974年，Grozdicker等［2］利用限制性內(nèi)切酶酶解后得到的DNA片段的差異鑒定溫度敏感表型的腺病毒DNA突變體，首創(chuàng)了DNA分子標(biāo)記技術(shù)以來，DNA分子標(biāo)記技術(shù)日趨成熟、完善［3］。目前最常用的分子標(biāo)記有RFLP、RAPD、AFLP、SSR和ISSR 等。與其他幾種常用的分子標(biāo)記技術(shù)相比，SSR標(biāo)記具有信息量更高、多等位點(diǎn)、共顯性、穩(wěn)定可靠及操作簡便等顯著優(yōu)點(diǎn)，在基礎(chǔ)理論研究和實際應(yīng)用等方面取得了巨大的成績，廣泛地應(yīng)用于遺傳育種、物種親緣關(guān)系鑒別、基因組作圖、基因定位、基因庫構(gòu)建和基因克隆等方面。

1 SSR分子標(biāo)記技術(shù)的原理和特點(diǎn)

簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR），又稱微衛(wèi)星DNA（micro-satellite DNA），是指以少數(shù)幾個核苷酸（1-6個）為單位多次串聯(lián)重復(fù)的DNA序列，重復(fù)次數(shù)一般為10-50，亦稱簡單序列長度多態(tài)性（simple sequence length polymorphism，SSLP）。同一類微衛(wèi)星DNA可分布在基因組的不同位置上，由于基本單元重復(fù)次數(shù)的不同，而形成SSR座位的多態(tài)性。每個SSR座位兩側(cè)一般是相對保守的單拷貝序列，因此可根據(jù)兩側(cè)序列設(shè)計一對特異引物來擴(kuò)增SSR序列，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，比較擴(kuò)增帶的遷移距離，從而獲知不同個體在某個SSR座位上的多態(tài)性。

這種重復(fù)序列存在于幾乎所有真核生物的基因組中，含量豐富，且呈隨機(jī)均勻分布。微衛(wèi)星由核心序列和兩側(cè)的保守側(cè)翼序列構(gòu)成，保守的側(cè)翼序列使微衛(wèi)星特異地定位于染色體某一區(qū)域，核心序列重復(fù)數(shù)的差異則形成微衛(wèi)星的高度多態(tài)性。近年來，SSR分子標(biāo)記技術(shù)成為種群研究和進(jìn)化生物學(xué)最常用的分子標(biāo)記之一，廣泛地應(yīng)用于種群遺傳多樣性分析、基因定位及分子標(biāo)記輔助選擇、遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建［4］。與其他作物相比，煙草SSR標(biāo)記開發(fā)研究起步較晚。近年來，隨著煙草基因組計劃取得的巨大成就，SSR分子標(biāo)記技術(shù)在煙草遺傳育種中運(yùn)用越來越廣泛及深入。

2 煙草EST-SSR分布特征

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的高速發(fā)展，植物表達(dá)序列標(biāo)簽（expressed sequence tags，ESTs）得到大量測定，EST數(shù)據(jù)的快速增長為SSR標(biāo)記的開發(fā)提供了豐富的序列資源，使得基于EST序列進(jìn)行SSR標(biāo)記開發(fā)的能力大大增強(qiáng)。

王衛(wèi)鋒等［5］通過對絨毛狀煙草基因組中SSR位點(diǎn)的信息分析發(fā)現(xiàn)，A/T堿基出現(xiàn)的頻率顯著高于G/C，二、三堿基重復(fù)基元的SSR占SSR總體的94.8%，出現(xiàn)頻率最高。而（CG）n、（GTG）n、（GTC）n、（GCA）n、（CGC）n這些重復(fù)單元的SSR在絨毛狀煙草基因組中非常少見，分別只出現(xiàn)了1次，得出煙草SSR序列顯示出顯著的堿基偏好性的結(jié)論。薛金愛等［6］對GenBank上公布的158 098條EST序列及10 647條GSS序列進(jìn)行大規(guī)模微衛(wèi)星位點(diǎn)搜索，在EST和GSS中搜索到的重復(fù)單元中二核苷酸發(fā)生的次數(shù)最多，在EST中TC發(fā)生的頻率最高，在GSS中出現(xiàn)最多的是TA；其次是三核苷酸，其中發(fā)生次數(shù)最多的分別是TGA和CAA。李緒英等［7］對煙草葉綠體和線粒體基因組數(shù)據(jù)中的SSR信息進(jìn)行了分析，分別獲得186和578個SSR位點(diǎn)，且這些SSR重復(fù)堿基類型絕大部分為二、三堿基重復(fù)。

在大多數(shù)植物中，EST-SSR分布以二、三核苷酸重復(fù)類型為主，而且在二核苷酸重復(fù)的EST-SSRs中，含AG/TC的重復(fù)單元最多，煙草EST-SSR的分布特征與其他大多數(shù)植物基本一致［8-15］。

3 SSR標(biāo)記在煙草遺傳育種中的應(yīng)用

3.1 基因定位及分子標(biāo)記輔助選擇

傳統(tǒng)的煙草育種主要依賴于植株表型選擇和抗性鑒定，要求育種者須有豐富的經(jīng)驗，育種周期也較長，且極易受到病蟲害發(fā)生狀況及氣候條件的限制，導(dǎo)致鑒定結(jié)果出現(xiàn)偏差，甚至造成優(yōu)良抗性基因的丟失，選擇效率較低［16，17］。因此，如何快速選育抗病優(yōu)質(zhì)煙草新品種是廣大煙草育種工作者面臨的主要問題之一。分子標(biāo)記輔助選擇（molecular marker-assisted selection，MAS）利用與目標(biāo)性狀相連鎖的分子標(biāo)記可以對育種材料從DNA水平上進(jìn)行高效選擇，從而對作物產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性等性狀進(jìn)行改良，同時因其不受基因效應(yīng)和環(huán)境因素的影響，選擇結(jié)果可靠性比較高，從而解決了育種年限長的問題，大大提高育種進(jìn)程［17］。SSR分子標(biāo)記輔助選擇近年來在煙草上得到了越來越多的應(yīng)用。

范靜苑、文軻等［18，19］利用抗CMV的烤煙品種臺煙8號構(gòu)建分離群體進(jìn)行遺傳分析，分別篩選到一個與抗性基因相關(guān)的SSR標(biāo)記，并探討了煙草CMV的抗性遺傳規(guī)律，認(rèn)為臺煙8號對CMV的抗性由多基因控制。同時范靜苑等還篩選到一個與來源于鐵把子的與CMV抗性基因相關(guān)的SSR標(biāo)記。吳海喬［20］利用1 152對SSR標(biāo)記對煙草青枯病抗病品種巖煙97與感病品種紅花大金元構(gòu)建的F2群體進(jìn)行分析，篩選出4個在抗、感池間表現(xiàn)差異的標(biāo)記。范江等［21］以抗青枯病的煙草品種‘Oxford207'與感病品種紅花大金元為親本構(gòu)建群體，從800多條SSR引物中篩選出3個在抗感池之間有多態(tài)性的引物，并得出來自‘Oxford207'的青枯病抗性基因?qū)儆诩有曰蚩刂频慕Y(jié)論。蔣彩虹等［22］在篩選到的一個與凈葉黃抗赤星病基因的遺傳距離為9.37 cM標(biāo)記的基礎(chǔ)上，在該標(biāo)記的兩側(cè)10 cM范圍內(nèi)分別選擇15對SSR引物對抗病親本凈葉黃與感病親本NC82的雜交F2進(jìn)行SSR標(biāo)記分析，篩選到一個與來源于凈葉黃的赤星病抗性基因間的遺傳距離為4 cM的標(biāo)記。牟建英等［23］從2 317對SSR引物中篩選得到61對多態(tài)穩(wěn)定的引物，用其對臺煙7號（♀）×NC89（♂）構(gòu)建的285株F2群體進(jìn)行分析，檢測到1個與煙草白粉病抗性基因緊密連鎖的SSR標(biāo)記。

分子標(biāo)記輔助選擇育種的關(guān)鍵是尋找與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，兩者連鎖越緊密，則標(biāo)記與目的基因的重組率越低，選擇效率也就越高。分子標(biāo)記輔助選擇將現(xiàn)代分子生物學(xué)與傳統(tǒng)育種學(xué)結(jié)合，為植物育種工作提供不受環(huán)境影響、可量化的標(biāo)準(zhǔn)方法，使作物遺傳育種進(jìn)入了一個嶄新的階段。近年來，利用SSR分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)已在水稻、小麥、玉米、棉花和番茄等作物的抗病性育種中取得了巨大的成就，并且通過分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)將多個抗病基因進(jìn)行有效聚合，培育出廣譜抗性持久、穩(wěn)定的品種，解決了利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行抗性育種耗時、成本昂貴，基因沉默、遺傳不夠穩(wěn)定及安全性等問題［24-29］。然而，分子標(biāo)記輔助選擇聚合育種在煙草育種中還未見相關(guān)報道，這主要可能是由于目前在煙草的抗性基因定位中還沒有找到一個與目的基因緊密連鎖的標(biāo)記造成的。

3.2 煙草分類及遺傳多樣性研究

DNA多樣性是遺傳多樣性的本質(zhì)，種質(zhì)資源遺傳多樣性的發(fā)展經(jīng)歷了形態(tài)學(xué)標(biāo)記（morphological markers）、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記（cytological markers）、生物化學(xué)標(biāo)記（biochemical markers）和分子標(biāo)記（molecular markers）4個主要階段。由于分子標(biāo)記技術(shù)不受環(huán)境、季節(jié)的影響，與其他遺傳標(biāo)記相比，更適合用于動、植物分類和遺傳多樣性研究。劉勝傳、葉蘭欽和李文平等［30-32］分別應(yīng)用SSR分子標(biāo)記技術(shù)分析了部分煙草種質(zhì)的遺傳多樣性，都得出了煙草品種間遺傳差異較小的結(jié)論。聶瓊等［33］利用從番茄、辣椒的SSR引物中篩選出8對重復(fù)性好、多態(tài)性高的同源性SSR引物對24份烤煙材料進(jìn)行遺傳差異性分析得出，同科植物的SSR引物也能夠較好地揭示煙草種質(zhì)資源遺傳背景和親緣關(guān)系，可應(yīng)用于煙草品種資源的遺傳差異分析的結(jié)論。徐軍等［34］利用SSR標(biāo)記構(gòu)建了80份普通煙草種質(zhì)的指紋圖譜。王曼等［35］利用10對SSR引物對吉林省11份曬煙種質(zhì)和2份烤煙種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性與親緣關(guān)系進(jìn)行分析，得出不同煙草類型種間遺傳差異明顯，而種內(nèi)遺傳基礎(chǔ)相對狹窄的結(jié)論。黃莉莎等［36］從62對SSR引物中篩選出21對多態(tài)性高、穩(wěn)定性好的核心引物對9份煙草主栽品種進(jìn)行DNA指紋圖譜構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)9個品種間遺傳關(guān)系較近。楊柳等［37］利用14對多態(tài)性好、條帶清晰的煙草SSR引物，對25份煙草種質(zhì)資源親緣關(guān)系進(jìn)行分析，其研究認(rèn)為25份普通煙草種質(zhì)間的遺傳差異與其品種特性、調(diào)制類型、地理來源的差異沒有必然聯(lián)系，但較好地反映了煙草種質(zhì)間親緣關(guān)系。

遺傳多樣性不僅反映出物種變異水平的高低，而且能體現(xiàn)變異的分布格局，準(zhǔn)確反映物種的血緣關(guān)系、育種背景和利用價值，對優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源的保護(hù)、育種潛力的發(fā)掘利用、雜交種的選配、育種效率的提高具有重要意義［38，39］。對煙草種質(zhì)資源親緣關(guān)系的研究表明，我國煙草品種間遺傳距離較窄，煙草育種工作面臨親本匱乏，主體親本使用過度、重復(fù)性大等問題，因此在今后的育種工作中要積極引入外源基因，加大優(yōu)質(zhì)野生種質(zhì)資源的利用，拓寬種質(zhì)的遺傳基礎(chǔ)［40，41］。

3.3 遺傳圖譜的構(gòu)建及種子純度和真?zhèn)舞b定

擁有一張高密度分子標(biāo)記遺傳圖譜是開展分子標(biāo)記輔助選擇以及基因定位工作的基礎(chǔ)，1978年Donis-Keller等［42］首次利用RFLP標(biāo)記構(gòu)建了人類的第一張基因連鎖圖譜，從此DNA分子標(biāo)記技術(shù)就開始廣泛地應(yīng)用于各種動、植物遺傳圖譜的構(gòu)建中。目前，在水稻、小麥、玉米和番茄等作物中已經(jīng)擁有了高密度甚至飽和的遺傳連鎖圖譜［43-46］。近年來，隨著SSR分子標(biāo)記的大量開發(fā)，SSR分子標(biāo)記技術(shù)越來越多地應(yīng)用到煙草遺傳連鎖圖譜的繪制。

2001年，Lin等［47］利用RFLP標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建了第一張煙草分子標(biāo)記遺傳連鎖圖譜。肖柄光等［48］以烤煙品種雜交得到的137個DH系為作圖群體，利用ISSR和RAPD標(biāo)記的遺傳連鎖分析構(gòu)建了包括27個連鎖群在內(nèi)的國內(nèi)外第一張烤煙分子標(biāo)記遺傳連鎖圖譜。Bindler等［49］利用Hicks Broad Leaf和Red Russian雜交產(chǎn)生的186個F2單株作為作圖群體，構(gòu)建了第一張煙草SSR標(biāo)記遺傳連鎖圖，之后Bindler等［50］在2007年工作的基礎(chǔ)上，利用已經(jīng)公開發(fā)表的1379 067個煙草原始基因序列（GSS）和55 411個表達(dá)序列（ESTs）設(shè)計出5 500個SSR引物，從這5 500個引物中篩選出2 317個多態(tài)性、重復(fù)性好，條帶清晰的SSR標(biāo)記，利用Hicks Broad Leaf和Red Russian雜交產(chǎn)生的186個F2單株作為作圖群體，構(gòu)建了包括2317個SSR標(biāo)記，2 363個位點(diǎn)在內(nèi)的24個連鎖群，總遺傳長度為3 267 cM，標(biāo)記間的平均距離小于1.5 cM。這是目前包含標(biāo)記位點(diǎn)最廣、標(biāo)記密度最大、平均圖距最小的煙草分子連鎖圖譜。

隨著我國煙草育種研究的不斷深入，越來越多的優(yōu)良、抗逆性強(qiáng)的品種被選育和引進(jìn)，為解決我國煙草品種單一問題提供了有力的支撐，然而同時也增大了品種混雜的可能性。煙草種子純度和真實性是優(yōu)良品種生產(chǎn)的保證。建立快速、準(zhǔn)確的煙草種子純度鑒定技術(shù)是對規(guī)范我國煙草種子市場和促進(jìn)我國煙草產(chǎn)業(yè)發(fā)展的迫切需要。隨著科技進(jìn)步，分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)開始用于作物種子純度的鑒定。利用SSR標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建指紋圖譜鑒定種子純度和真?zhèn)卧谒尽⒂衩?、棉花和油菜?1-54］等作物中具有較多的研究，但在煙草種子方面的應(yīng)用很少有文獻(xiàn)報道。

總體上，煙草分子標(biāo)記遺傳圖譜構(gòu)建及在種子純度和真?zhèn)舞b定等研究中的應(yīng)用程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于其他作物，這可能是由于栽培種煙草屬于異源四倍體，有48條染色體，全長約4 600 Mb，約為人類基因組全長的1.5倍，基因組巨大和分子標(biāo)記在煙草中開發(fā)利用較少造成的［55］。

4 前景

加強(qiáng)作物育種，必須加大對分子育種技術(shù)的應(yīng)用。近年來，育種學(xué)家對利用分子生物學(xué)手段進(jìn)行作物育種表現(xiàn)出濃厚的熱情，但目前煙草SSR標(biāo)記的開發(fā)遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于其他作物。煙草染色體數(shù)目較多，基因組龐大，包含大量的重復(fù)序列，這給煙草基因組物理圖譜的構(gòu)建和測序造成了極大的困難。因此到目前為止可利用的分子標(biāo)記數(shù)量也十分有限，難以構(gòu)建高密度的煙草遺傳連鎖圖譜，無法篩選到與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。將與目標(biāo)基因連鎖的分子標(biāo)記運(yùn)用于遺傳育種的早期輔助選擇，仍停留在基礎(chǔ)理論研究階段，目前還沒有通過有利基因聚合的分子育種煙草產(chǎn)品的報道［56］，尤其是在煙草抗旱、耐寒、抗早花基因篩選方面缺乏相關(guān)研究。近年來，煙草單染色體分離擴(kuò)增技術(shù)在煙草中開始有研究，對于煙草這類大基因組的物種而言，構(gòu)建高覆蓋率的單染色體文庫能夠解決高密度煙草遺傳圖譜的繪制和煙草基因組測序的難題［57］。

目前煙草基因組計劃（TGI）已取得巨大進(jìn)展，近幾年各國啟動的煙草基因組計劃將煙草基礎(chǔ)研究推向了高潮。據(jù)報道，我國現(xiàn)已成功完成絨毛狀煙草與林煙草全基因組序列圖譜，這是全球第一套煙草全基因組序列（http：//scitech.people.com. cn/GB/16572602.html）。同時基因比較作圖研究也成為國際研究熱點(diǎn)，SSR標(biāo)記同源性、通用性的研究也在煙草中展開［58，59］。這些技術(shù)的發(fā)展及取得的成果為煙草ESTs數(shù)量迅速增加、SSR標(biāo)記的開發(fā)和高密度的分子連鎖圖譜的構(gòu)建提供重要的依據(jù)，為獲得與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記、基因的精確定位、分子標(biāo)記輔助選擇提供重要前提，從而達(dá)到簡化傳統(tǒng)育種方法的目的。在未來，利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)開展煙草分子設(shè)計育種一定會成為煙草育種的熱點(diǎn)。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Advance of the Application of SSR Molecular Markers in Tobacco Research

Chen Jie1Yang Jing2Long Shengxian1Xiao Ciping1Yang Changyi1Huang Qingzhong1Wang Wei2
（1. Qiandong-nan Tobacco Company in Guizhou Province，Kaili 556000；2. Tobacco Laboratory，College of Agriculture，South China Agricultural University，Guangzhou 510642）

SSR molecular marker technology as one of the most commonly used molecular markers， the marker technique result is reliable and good repeatability. In recent years， SSR marker shows a broad application prospect in tobacco genetic breeding， is a large potential for application of molecular markers. This paper introduced the principle and distribution characteristics of SSR molecular marker， and summarized the study of gene location and molecular marker-assisted selection， germplasm research， the construction of molecular genetic maps and the seed purity identification and authenticity of tobacco， and analysed the application prospect of molecular markers in tobacco genetic breeding. The main aim is to supply useful information so as to promote the development of SSR molecular marker technology research in tobacco.

tobacco；molecular marker；SSR；genetic breeding

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.006

2014-7-30

國家煙草專賣局重點(diǎn)項目（110200902043）

陳杰，男，碩士研究生，研究方向：煙葉生產(chǎn)及科技推廣應(yīng)用；E-mail：hnchenjie002@126.com

王維，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：煙草栽培與生理；E-mail：wangwei@scau.edu.cn