伍新齡，王鳳玲，*，關(guān)文強(qiáng)

（1.天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300134；2.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津300134）

植物油脂肪酸甲酯化方法比較與含量測(cè)定

伍新齡1，2，王鳳玲1，2，*，關(guān)文強(qiáng)1，2

（1.天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300134；2.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津300134）

通過比較不同甲酯化方法、氣相色譜升溫程序，確定了植物油中脂肪酸成分的氣相色譜分析方法，并對(duì)5種食用植物油的主要脂肪酸含量進(jìn)行了分析和比較。結(jié)果表明：三氟化硼-甲醇快速甲酯化法具有操作簡(jiǎn)單、時(shí)間短、甲酯化率高的優(yōu)點(diǎn)。利用CP-Sill88高極性氣相色譜柱，優(yōu)化的升溫程序?yàn)椋撼跏紲囟?70℃，保持1m in，以10℃/min升溫速率升至200℃，再以1℃/m in升溫速率升至220℃，保持3m in，20min內(nèi)即可有效分離6種脂肪酸。用建立的方法測(cè)定5種食用植物油6種脂肪酸的含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)性好，相關(guān)系數(shù)范圍為0.999 4～0.999 9，檢出限低。

食用植物油；脂肪酸；甲酯化；氣相色譜

食用植物油的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值在很大程度上取決于油脂中脂肪酸的組成和配比[1-4]。棕櫚酸（C16：0）、硬脂酸（C18：0）、花生酸（C20：0）、油酸（C18：1）、亞油酸（C18：2）、亞麻酸（C18：3）6種脂肪酸含量總和占總脂肪酸95%以上[5-7]。利用氣相色譜法的FID檢測(cè)器對(duì)食用植物油中脂肪酸進(jìn)行定性、定量分析，具有非常高的靈敏度，是脂肪酸含量測(cè)定最常用的分析手段[8-12]。但由于脂肪酸極性較強(qiáng)且高溫下易發(fā)生聚合、脫羧、裂解等副反應(yīng)，不能直接進(jìn)行氣相色譜分析，須先將其衍生為易揮發(fā)的甲酯[13-14]，因此，甲酯化方法選擇直接影響其真實(shí)含量的測(cè)定。目前研究氣相色譜法分析食用植物油中脂肪酸時(shí)采用的甲酯化方法主要有5%硫酸-甲醇溶液法、氫氧化鉀-甲醇溶液法、酸堿結(jié)合法[15-20]，但這些方法存在甲酯化效果差、用時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn)。

本研究比較了5%硫酸-甲醇溶液法、氫氧化鉀-甲醇溶液法、酸堿結(jié)合法及本課題組優(yōu)化建立的三氟化硼-甲醇快速甲酯化法等4種方法的甲酯化效果，優(yōu)化出最佳的食用植物油中脂肪酸的甲酯化方法；進(jìn)一步利用氣相色譜分析方法對(duì)5種食用植物油的脂肪酸組成進(jìn)行分析和比較，為油脂的營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)和膳食的合理搭配提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生油、玉米油、大豆油、橄欖油、調(diào)和油均購(gòu)于超市。

硬脂酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品、油酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品、亞油酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品、花生酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品、亞麻酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)NU-CHEK公司；棕櫚酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品 中國(guó)食品藥品檢定研究院；正庚烷和甲醇均為色譜純，14%三氟化硼-甲醇溶液、氯化鈉、硫酸、氫氧化鉀、無水硫酸鈉試劑均為優(yōu)級(jí)純。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A氣相色譜儀（FID檢測(cè)器）美國(guó)安捷倫科技有限公司；CPA225D型電子天平 德國(guó)賽多利斯公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；AS10200A超聲波振蕩器 天津奧特賽恩斯儀器有限公司。

1.3 不同脂肪酸甲酯混合標(biāo)樣的氣相色譜分析方法

將不同脂肪酸甲酯標(biāo)樣溶于正庚烷中制成不同濃度的適合氣相色譜分析的混合標(biāo)樣。氣相色譜柱：CP-Sil88（100m×0.25mm×0.2μm）強(qiáng)極性毛細(xì)管柱；進(jìn)樣口溫度：250℃；FID檢測(cè)器溫度：260℃；進(jìn)樣量：1.0μL；分流比：30∶1；載氣：高純氮?dú)?。流速?.0mL/min。升溫程序的優(yōu)化與確定：在150、170、220℃的初始柱溫，1、5、10℃/min的初始升溫速率，1、3℃/min的二次升溫速率條件下，以分離度為指標(biāo)，確定適宜的升溫程序。

1.4 樣品甲酯化處理方法

稱取50.00mg（精確到0.01mg）植物油于25mL的容量瓶中，按下述甲酯化方法（1.4.1至1.4.4）進(jìn)行甲酯化后，加入適量的飽和氯化鈉溶液和4.0mL正庚烷，振搖，靜置10min。取上層正庚烷液，加少許的無水硫酸鈉脫水，過0.45μm有機(jī)濾膜后用于氣相色譜分析。

1.4.1 5%硫酸-甲醇溶液法

油樣中加入2.0mL 5%硫酸-甲醇溶液，70℃水浴60min。

1.4.2 氫氧化鉀-甲醇溶液法

油樣中加入1.0mL 1mol/L的氫氧化鉀-甲醇溶液，40℃水浴30min。

1.4.3 酸堿結(jié)合法

油樣中加入1.0mL 1mol/L的氫氧化鉀-甲醇溶液，40℃水浴45min，水浴蒸干，加入2.0mL 5%硫酸-甲醇溶液，70℃水浴60min。

1.4.4 三氟化硼-甲醇快速甲酯化方法

油樣中加入0.5 mol/L的氫氧化鈉-甲醇溶液1.5 mL，超聲10min，40℃水浴10min，待溶液呈透明狀后置水浴上沸騰5min，冷卻后加入5.0mL三氟化硼-甲醇溶液，水浴沸騰2min。

1.5 數(shù)據(jù)分析

植物油甲酯化后，氣相色譜法分析得到脂肪酸甲酯色譜圖，利用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)相對(duì)保留時(shí)間定性，峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪酸最佳測(cè)定條件

2.1.1 氣相色譜程序升溫適宜條件

通過比較6個(gè)不同升溫程序下混合標(biāo)準(zhǔn)品及調(diào)和油（經(jīng)1.4.4中方法甲酯化）中脂肪酸甲酯的分離度、響應(yīng)值與峰形、保留時(shí)間，確定最佳色譜柱升溫程序?yàn)椋?70℃保留1min，10℃/min升溫至200℃，1℃/min升溫至220℃保留3min。在此條件下，6種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液和調(diào)和油樣品溶液的氣相色譜分析結(jié)果分別見圖1、圖2。

2.1.2 不同脂肪酸甲酯標(biāo)樣的標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)、檢出限

采用不同濃度范圍的脂肪酸甲酯標(biāo)樣配成的混標(biāo)進(jìn)行氣相色譜分析，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線及其相關(guān)系數(shù)、檢出限見表1。

由表1可以看出6種脂肪酸的線性相關(guān)方程的相關(guān)系數(shù)都在0.999以上，相關(guān)性較好，檢出限低，檢測(cè)靈敏度高，說明建立的脂肪酸測(cè)定方法可行。

2.2 甲酯化方法的選擇

按1.4中的4種方法對(duì)調(diào)和油進(jìn)行甲酯化處理，并利用優(yōu)化后的氣相色譜條件分析其脂肪酸含量，結(jié)果見表2。

對(duì)于同一種植物油，酯化方法不同，測(cè)出其脂肪酸含量有較大差異，脂肪酸含量越高說明甲酯化效果越好。從表2可以看出，酯化效果最好的是三氟化硼-甲醇快速甲酯化法，其次分別為酸堿結(jié)合法、氫氧化鉀-甲醇溶液法和5%硫酸-甲醇溶液法。

酸法測(cè)出6種脂肪酸的含量均較低，是由于硫酸作催化劑發(fā)生甲醇脫水生成甲醚的副反應(yīng)，導(dǎo)致甲酯化不完全，反應(yīng)溫度高且耗時(shí)長(zhǎng)，不適宜測(cè)定植物油中脂肪酸的含量；堿法發(fā)生酯交換反應(yīng)，條件比較溫和，反應(yīng)時(shí)間短，但是在堿性條件下反應(yīng)同時(shí)存在產(chǎn)物的水解，影響甲酯化效果；根據(jù)酯化反應(yīng)機(jī)理，酸堿結(jié)合形成的RO-的親核能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于ROH，促使反應(yīng)加速進(jìn)行，又有酸性催化劑，使油脂的甲酯化既快又完全。但當(dāng)H2SO4作酸性催化劑時(shí)，脂肪酸與甲醇發(fā)生酯化反應(yīng)，體系中水的存在抑制了反應(yīng)進(jìn)一步發(fā)生；三氟化硼-甲醇快速甲酯化法中，先用堿中和了非中性的游離脂肪酸，同樣也存在RO-的親核反應(yīng)，而且BF3作酸性催化劑，能夠消耗體系中存在的水形成硼酸，進(jìn)一步促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行，實(shí)現(xiàn)結(jié)合態(tài)、游離態(tài)脂肪酸樣品有效甲酯化，不破壞不飽和脂肪酸，反應(yīng)時(shí)間短，且反應(yīng)溫度適中，脂肪酸甲酯化完全[18-20]。

三氟化硼-甲醇快速甲酯化法利用超聲波技術(shù)的空化作用和機(jī)械傳質(zhì)作用促進(jìn)了醇油的相互混合，在40℃下，加速了甲醇和油脂之間的醇解反應(yīng)[21]，使脂肪酸鹽直接轉(zhuǎn)化成脂肪酸甲酯減少酸化步驟，防止常規(guī)法皂化時(shí)所引起的異構(gòu)化。花生油、大豆油、玉米油、橄欖油和調(diào)和油的酸值均在0.5以下[22-24]，符合醇解反應(yīng)最適條件。該法適用于大多數(shù)植物油脂甲酯化，用時(shí)短且測(cè)出的脂肪酸含量較高。

2.3 植物油脂肪酸含量測(cè)定

利用三氟化硼-甲醇快速甲酯化法對(duì)5種植物油進(jìn)行甲酯化，按1.4的色譜條件對(duì)脂肪酸進(jìn)行分析，所得的脂肪酸含量見表3。

由表3可以看出，棕櫚酸、硬脂酸在5種植物油中含量差別不大，油酸在橄欖油中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，亞油酸在玉米、大豆等油脂中的含量高，花生酸和亞麻酸在調(diào)和油中含量較高，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.2%和1.0%，而在其他油中兩種脂肪酸均低于1.0%。

2.4 回收率實(shí)驗(yàn)

調(diào)和油中分別添加3個(gè)不同濃度脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.4.4步驟對(duì)樣品進(jìn)行甲酯化，按采用優(yōu)化的氣相色譜條件進(jìn)行測(cè)定，棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、花生酸、亞麻酸的平均回收率分別為88.75%、89.21%、89.31%、87.95%、88.40%、89.15%。

3 結(jié)論

本研究通過對(duì)5種植物油的甲酯化分析，得出了優(yōu)化后的三氟化硼-甲醇快速甲酯化法在氣相色譜法的酯化效果最好，測(cè)出的脂肪酸含量最高。選用適宜的升溫程序，6種脂肪酸的分離度R>1.5，定性準(zhǔn)確，可以較準(zhǔn)確地測(cè)定脂肪酸的百分含量。為植物油的定性定量提供依據(jù)，對(duì)于食用植物油檢測(cè)有較好的參考價(jià)值。

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Methods of Methyl Esterification and Gas Chromatography Analysis of Fatty Acids in EdibleVegetable Oil

WU Xin-ling1，2，WANG Feng-ling1，2，*，GUANWen-qiang1，2
（1.Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology，Tianjin 300134，China；2.College of Biotechology and Food Sciences，Tianjin University of Commerce，Tianjin 300134，China）

Different methods of methyl esterification and heating program of gas chromatography （GC） werecompared， and optimal parameters for GC analysis of fatty acid in vegetable oil was determined. The content ofessential fatty acids in 5 kinds of vegetable oil was also analyzed and compared. The results showed that borontrifluoride-methanol esterification was the optimal method for fatty acid analysis， which had advantages such aseasy operation， accurate results with a high methyl esterification efficiency. A highly polar capillary column（100 m×0.25 mm i.d.×0.2 mm film thickness） of CP-Sil88 （Varian， USA） was used to separate the fatty acidmethyl esters， the optimized heating program was as follows： 1） 170 ℃ for 1 min； 2） increase to 200 ℃ at arate of 10 ℃/min； 3） increase to 220 ℃ at a rate of 10 ℃/min； 4）220 ℃ for 3 min， and 6 kinds of fatty acidscan be effectively separated within 20 min. Determination of five kinds of edible vegetable oil 6 kinds of fattyacids by the established method showed a good linear ranges which correlation coefficient was from 0.999 4 to0.999 9 and a low limit of detection.

edible vegetable oil； fatty acid； methyl esterification； gas chromatograph

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.07.022

2014-08-04

伍新齡（1989—），女（漢），碩士研究生，研究方向：食品加工和保鮮新技術(shù)。

*通信作者：王鳳玲（1965—），女（漢），碩士，研究方向：食品質(zhì)量與安全。