徐曉菲，張雯柯，王莉，李娜，劉迎玉，李敏，張翊昕，范俊梅，姚元慶＊

（1，中國人民解放軍總醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 100853；2，第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院婦產(chǎn)科，西安 710038；3，天津南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院研究生處，天津 300071）

植入前遺傳學(xué)診斷（PGD）主要指對通過體外受精（IVF）獲得的胚胎在植入子宮前進(jìn)行的遺傳學(xué)檢測，檢出攜帶致病基因和核型異常的胚胎，選擇正常胚胎植入子宮內(nèi)，從而獲得健康胎兒的診斷方法。PGD 是輔助生殖與遺傳學(xué)診斷相結(jié)合而形成的一種孕前檢測技術(shù)，為高風(fēng)險生育遺傳缺陷患兒的夫婦選擇性植入正常胚胎，一方面阻斷了遺傳性疾病的垂直傳播，減輕社會及家庭的負(fù)擔(dān)；另一方面，避免了傳統(tǒng)產(chǎn)前診斷遺傳性疾病進(jìn)行的治療性流產(chǎn)，羊膜腔穿刺等操作對孕婦帶來的身心傷害，更加適用于合并生育障礙的患者。目前，PGD 主要應(yīng)用于單基因遺傳病及染色體異常的檢測。

乳腺癌是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，其死亡率在大多數(shù)國家占女性各類腫瘤首位。近年來其發(fā)病率在我國逐漸上升并呈年輕化趨勢。人類乳腺 癌 易 感 基 因（breast cancer susceptibility gene 1／2，BRCA1／2）是目前已知的乳腺癌高外顯率易感基因，與家族性、遺傳性的乳腺癌、卵巢癌密切相關(guān)。BRCA1／2基因同為抑癌基因，主要參與DNA 損傷修復(fù)及維護(hù)基因組完整。近年來對乳腺癌、卵巢癌高發(fā)家族分析表明，約5%～10%患者的發(fā)病與易感基因相關(guān)［1-2］，其中，遺傳性乳腺癌和卵巢癌患者中約有60%～75%伴有BRCA1／2基因的突變［3-5］，其突變屬于常染色體不完全顯性遺傳［6］。研究表明，BRCA1／2基因突變的攜帶者發(fā)生乳腺癌和卵巢癌的終身累計風(fēng)險分別達(dá)到40%～87%及16%～64%［7-10］。除此之外，近年來許多相關(guān)研究同樣表明，BRCA1／2基因的突變與結(jié)腸癌、胰腺癌、前列腺癌等其他癌癥的發(fā)病相關(guān)聯(lián)［11］。

對BRCA1／2基因突變進(jìn)行檢測，尋找其致病性的突變位點(diǎn)，及時篩選出高危病患，有助于風(fēng)險評估和早期預(yù)防。另外，因突變?yōu)槌Ｈ旧w遺傳，雜合患者有50%的可能性將突變基因遺傳給后代，如生育攜帶BRCA1／2 突變基因的胎兒，是否選擇妊娠終止將會是家庭難以解決的問題，這一做法在許多國家無法獲得法律的許可。針對突變基因攜帶者選擇性進(jìn)行第三代試管嬰兒-植入前遺傳學(xué)診斷（PGD）能夠避免這一問題的發(fā)生，從根本上有效地阻斷遺傳性乳腺癌、卵巢癌的垂直傳播。

一、BRCA1／2植入前遺傳學(xué)診斷應(yīng)用回顧

BRCA1／2基因的發(fā)現(xiàn)是乳腺癌臨床基因篩查的一個重要轉(zhuǎn)折點(diǎn)，自此之后，越來越多存在乳腺癌／卵巢癌家族史的婦女開始尋求基因咨詢。1989年，Handyside等［12］成功運(yùn)用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)對高風(fēng)險傳遞X-連鎖隱性遺傳病的夫婦成功分析了卵裂球的性別構(gòu)成，并于1990年誕生了首例經(jīng)PGD 的健康嬰兒。隨著這一技術(shù)的逐漸穩(wěn)定，PGD 已逐步應(yīng)用于200多種單基因遺傳性疾?。?3］。目前，運(yùn)用PGD 方法使BRCA1／2突變攜帶者避免下一代高危易感基因風(fēng)險的技術(shù)方法已成功建立并證實(shí)可行。在以色列、比利時、西班牙、荷蘭等國家的生殖醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室陸續(xù)開展了遺傳性乳腺癌／卵巢癌的PGD 相關(guān)研究［14-15］。相關(guān)法律法規(guī)逐漸建立并支持該研究的發(fā)展。2003 年歐洲人類生殖及胚胎學(xué)會（ESHRE）的法律及倫理工作小組放寬了PGD 指征：可以接受對于BRCA1／2基因突變一類的遲發(fā)性疾病執(zhí)行PGD［16］；2006年5月，英國人類受精和胚胎學(xué)管理局（HFEA）準(zhǔn)許PGD 應(yīng)用于低外顯率遲發(fā)性遺傳性癌癥易感疾病，例如遺傳性乳腺癌卵巢癌綜合征（HBOC）［17］。社會學(xué)、倫理學(xué)家對BRCA1／2 基因植入前遺傳學(xué)診斷的遲發(fā)性、不完全外顯率以及倫理道德等各方面問題進(jìn)行了一系列 的 討 論，2007 年，Menon 等［18］通 過 調(diào) 查52 名BRCA 基因突變攜帶者稱，其中39人（75%）認(rèn)為可以接受并支持執(zhí)行PGD，贊同HFEA 的決議。

盡管越來越多的人們關(guān)注這一技術(shù)的發(fā)展，贊成其應(yīng)用，到目前僅有較少數(shù)對于BRCA 基因突變攜帶者PGD 的報道。2008 年，澳大利亞報道了第一例行BRCA1 基因突變PGD 后出生的健康男嬰［19］；2009年，Sagi等［14］對10名以色列婦女進(jìn)行了植入前遺傳學(xué)咨詢（包括7 名無癥狀攜帶者及3名乳腺癌攜帶者），其中5名選擇執(zhí)行PGD，最終3位成功受孕。近期，荷蘭Derks-Smeets等［15］報道稱，對70對夫妻進(jìn)行了乳腺癌易感基因的PGD，其中包括男性攜帶者、無癥狀女性攜帶者以及乳腺癌患者，共720個胚胎在體外受精后進(jìn)行基因檢測，其中294（40.7%）個胚胎不攜帶BRCA1 或BRCA2突變，適合移植，最終有38名健康胎兒出生。然而，兩名攜帶BRCA1突變的婦女在PGD 后不久診斷為乳腺癌。輔助生殖-PGD 使用激素后的母體安全仍需要進(jìn)一步討論。

迄今為止，國內(nèi)雖已開展了許多單基因遺傳病PGD 相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究，但尚未有BRCA1／2基因的臨床植入前遺傳學(xué)診斷的報道。

二、BRCA1／2基因突變PGD 技術(shù)

（一）遺傳咨詢及突變檢測

希望行BRCA1／2 突變基因PGD 的夫妻大多由于家庭成員中至少一人已發(fā)生乳腺癌或卵巢癌，或夫妻雙方至少有一人已檢測到BRCA1／2基因突變，因此，確定BRCA1／2基因突變攜帶者突變位點(diǎn)是進(jìn)一步遺傳診斷的前提。同時，應(yīng)盡可能對其他家庭成員進(jìn)行遺傳檢測，以明確基因相關(guān)聯(lián)的遺傳標(biāo)記，提高PGD 診斷準(zhǔn)確性。

（二）活檢單細(xì)胞來源

進(jìn)行單基因疾病PGD 活檢建議選用ICSI受精，這一過程可以避免透明帶上粘附的其他精子導(dǎo)致的潛在污染［20］。PGD 的另一個重要環(huán)節(jié)是更加積極的卵巢刺激，通過控制性超排卵（COH）在超聲引導(dǎo)下提取大量成熟卵泡。ESHRE 數(shù)據(jù)顯示，在PGD 循環(huán)過程中，提取卵細(xì)胞的平均數(shù)量為15個［21］。Vandervorst等［22］建議，當(dāng)提取卵泡數(shù)不足6個時，應(yīng)適當(dāng)考慮取消PGD。根據(jù)ESHRE 提示，在診斷單基因遺傳病所進(jìn)行的PGD 活檢中，首選非接觸性激光法打開透明帶，避免化學(xué)方法對活檢可能產(chǎn)生的影響［23］。取材之后需將其在室溫下停留時間控制到最少，進(jìn)行單胚胎培養(yǎng)。

活檢一般選取第3天或6～8細(xì)胞期的卵裂球，此時細(xì)胞仍具有全能分化潛質(zhì)，分析卵裂球DNA可以同時獲取來自父母雙方的遺傳信息，現(xiàn)已成為大部分PGD 中心的主要取材途徑。研究表明，活檢1～2個卵裂球不會影響胚胎發(fā)育［24］。除此之外，囊胚及極體活檢已成功應(yīng)用于如囊性纖維化、地中海貧血等多種單基因病的PGD［25］。對于BRCA1／2基因的其他活檢來源有待進(jìn)一步的研究。

（三）診斷方法

1.巢氏PCR：PCR 是最早應(yīng)用于分析單細(xì)胞DNA 以診斷胚胎單基因遺傳性疾病的技術(shù)。巢氏PCR 具有內(nèi)外兩對引物，分兩步進(jìn)行反應(yīng)，同時，外側(cè)產(chǎn)物能夠作為內(nèi)側(cè)引物PCR 所需模板，從而使內(nèi)側(cè)PCR 過程得以重復(fù)進(jìn)行，目的基因產(chǎn)量進(jìn)一步增加。Danuta 等［26］對 巢 氏PCR 及 全 基 因 組 擴(kuò) 增（whole genome amplification，WGA）用于BRCA1基因突變的PGD 檢測方法進(jìn)行了比較，結(jié)果提示巢氏PCR 靈敏度、特異度更高，而WGA 相對可重復(fù)性較低。

2.多重PCR：是指針對基因組多位點(diǎn)采用相互之間無作用的多對引物進(jìn)行混合，在同一PCR 反應(yīng)中可以同時擴(kuò)增。該方法同樣適用于非整倍體的檢測，已成為各PGD 中心主要采用的方法。通過同時分析多個短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat，STR）進(jìn)行連鎖分析，可以有效降低等位基因脫扣（allele dropout，ADO），提高PGD 準(zhǔn)確率。

多態(tài)性連鎖標(biāo)記是指位于目的基因內(nèi)部或外部與基因緊密連鎖的短串聯(lián)重復(fù)序列，標(biāo)記的選擇需要對夫妻雙方以及其他家人（特別是患病家屬）進(jìn)行遺傳性分析。Ramon等［27］的研究運(yùn)用兩個標(biāo)記點(diǎn)對一個BRCA1 基因特異突變進(jìn)行了PGD；Drüsedau等［28］分 別 設(shè) 計 了6 個（BRCA1）和8 個（BRCA2）微衛(wèi)星標(biāo)記對突變攜帶者進(jìn)行檢測分析，對30對夫妻進(jìn)行了共47次PGD 周期，并有8人妊娠。研究表明，同時分析兩個連鎖基因位點(diǎn)可以把ADO 降 低 為 3.5%，同 時 分 析 三 個 可 降至1.5%［29］。

3.全基因組擴(kuò)增（WGA）：PCR 技術(shù)以單細(xì)胞為模板，DNA 量少，擴(kuò)增效率低。WGA 旨在非選擇性的擴(kuò)增單細(xì)胞全部基因組，為遺傳檢測提供足量的樣本。在PGD 中最常用的是引物延伸預(yù)擴(kuò)增（primer extension preamplification，PEP）。PEP采用隨機(jī)組成的15 個堿基引物序列對基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，為實(shí)現(xiàn)微量DNA 多基因位點(diǎn)分析和重復(fù)檢測提供了可能。1998年Wells等［30］研究表明，PEP能擴(kuò)增90%以上的基因組序列。目前，WGA技術(shù)已在假肥大性肌營養(yǎng)不良（DMD）、甲型血友病、囊性纖維化病等單基因遺傳病中成功應(yīng)用。

4.新 一 代 測 序 技 術(shù)（next-generation sequencing，NGS）：DNA 測序技術(shù)的高速發(fā)展使得測序廣泛應(yīng)用于生物信息等各個研究領(lǐng)域，NGS主要通過將基因組DNA 分切為小片段DNA，在這些小片段DNA 分子末端連接測序接頭制備文庫，隨后通過對圖像采集分析獲得測序結(jié)果。單細(xì)胞全基因組測序正逐步應(yīng)用于植入前胚胎單基因遺傳病的篩查。

三、BRCA1／2的PGD 存在的問題及解決方案

1.擴(kuò)增失敗：PGD 過程中，擴(kuò)增失敗率高是最主要的缺陷之一。單細(xì)胞PCR 有限的遺傳物質(zhì)數(shù)量要求研究人員必須盡可能優(yōu)化反應(yīng)條件，以增加擴(kuò)增準(zhǔn)確性。

2.污染：污染是PCR 反應(yīng)中的常見問題，PGD-PCR 中因模板量少需增加循環(huán)次數(shù)，這一過程使得污染問題更為顯著。污染主要來自于活檢材料本身以及PCR 過程中使用到的設(shè)備和試劑。為減少污染所帶來的誤診風(fēng)險，每一樣本均需設(shè)立嚴(yán)格的陰性對照；卵裂球活檢在移入PCR 管前建議反復(fù)洗脫；配備專用器材；所有操作限定在無菌層流條件下進(jìn)行，盡可能地閉管操作以消除外源性污染。

3.等位基因脫扣（ADO）：活檢胚胎中有一個等位基因未能完成擴(kuò)增，即出現(xiàn)ADO 現(xiàn)象，尤其是對于BRCA1／2基因一類的常染色體顯性遺傳，ADO的發(fā)生使得異常突變不能被檢出，將導(dǎo)致假陰性結(jié)果。多態(tài)性連鎖標(biāo)記是最常見規(guī)避ADO 的方法。除此之外，熒光PCR［31］、提高變性溫度、同時檢測兩個卵裂球均有報道可以降低ADO 率［32］。只有擴(kuò)增效率大于90%、ADO 率小于10%的PGD 技術(shù)才可以考慮應(yīng)用于臨床［28］。

4.針對BRCA1／2基因診斷的限制因素及個性化方案：BRCA1／2突變基因攜帶者雖然乳腺癌的終身發(fā)病率高，但關(guān)于攜帶者進(jìn)行PGD 的爭議仍然存在。因其遲發(fā)性及不完全顯性等問題，攜帶者可以對后代進(jìn)行定期檢查、盡早治療等措施干預(yù)，限制了PGD 這一過程的選擇。另外，由于IVF存在妊娠率降低、卵巢刺激以及伴隨產(chǎn)生的高額費(fèi)用等問題，PGD 更加適用于并存不孕問題的攜帶者，以及在乳腺癌患者化療前進(jìn)行。有報道稱，攜帶BRCA1 突變的女性在PGD 后診斷為乳腺癌，PGD 周期期間對母體使用激素后的安全性問題不容忽視，有待進(jìn)一步完善［33］。

鑒于PGD 中單細(xì)胞遺傳物質(zhì)較少，單基因檢測要求敏感度更高的實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。單細(xì)胞多重PCR 結(jié)合多態(tài)性連鎖標(biāo)記的方法能夠最大程度地提高擴(kuò)增效率，降低擴(kuò)增失敗、等位基因缺失等帶來的陰性風(fēng)險，是檢測BRCA1／2基因的理想方法，已被廣泛用于BRCA1／2基因PGD［27-29］。因PGD 技術(shù)的局限性以及無可避免存在一定比例的誤診，進(jìn)行植入前診斷需保證患者知情同意，醫(yī)患雙方共同承擔(dān)診療選擇和決定的風(fēng)險，從而使PGD 技術(shù)遵循倫理學(xué)基本原則［34］。

四、BRCA1／2的PGD 應(yīng)用前景

近十幾年來我國乳腺癌發(fā)病率逐年上升，尤其在京津滬等大中城市，乳腺癌已居女性惡性腫瘤的首位且發(fā)病年齡趨于年輕［35］。隨著輔助生殖技術(shù)的逐漸推廣，能夠從植入前水平減少基因類疾病的遺傳，實(shí)現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育，減輕家庭及社會負(fù)擔(dān)。PGD對BRCA1／2基因突變遺傳預(yù)防具有重要的臨床意義。PGD 技術(shù)需要在不損害胚胎發(fā)育潛能的前提下，在有限的材料上進(jìn)行遺傳性分析，最終將檢測后無基因突變的胚胎植入適合妊娠的子宮中。這一復(fù)雜過程需要醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)家、分子生物學(xué)家以及生殖醫(yī)學(xué)臨床專家的共同協(xié)作。目前，國外已有BRCA1／2基因突變攜帶者通過PGD 誕生無突變基因的健康胎兒的報道［19］，而我國PGD 研究更是具有很大潛力。我們期待隨著分子生物學(xué)、生殖遺傳學(xué)、組織胚胎學(xué)等技術(shù)的不斷發(fā)展，建立起成熟準(zhǔn)確的BRCA1／2突變基因的PGD 技術(shù)。

［1］ Gabai-Kapara E，Lahad A，Kaufman B，et al.Populationbased screening for breast and ovarian cancer risk due to BRCA1and BRCA2 ［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2014，111：14205-14210.

［2］ Claus EB，Schildkraut JM，Thompson WD，et al.The genetic attributable risk of breast and ovarian cancer［J］.Cancer，1996，77：2318-2324.

［3］ Levy-Lahad E，F(xiàn)riedman E.Cancer risks among BRCA1and BRCA2mutation carriers［J］.Br J Cancer，2007，96：11-15.

［4］ Ford D，Easton DF，Stratton M，et al.Genetic heterogeneity and penetrance analysis of the BRCA1and BRCA2genes in breast cancer families［J］.Am J Hum Genet，1998，62：676-689.

［5］ Antoniou A，Pharoah PD，Narod S，et al.Average risks of breast and ovarian cancer associated with BRCA1or BRCA2 mutations detected in case Series unselected for family history：a combined analysis of 22studies［J］.Am J Hum Genet，2003，72：1117-1130.

［6］ Hall JM，Lee MK，Newman B，et al.Linkage of early-onset familial breast cancer to chromosome 17q21［J］.Science，1990，250（4988）：1684-1689.

［7］ Easton DF，F(xiàn)ord D，Bishop DT.Breast and ovarian cancer incidence in BRCA1-mutation carriers［J］.Am J Hum Genet，1995，56：265-271.

［8］ Ford D，Easton DF，Bishop DT，et al.Risks of cancer in BRCA1-mutation carriers［J］.Lancet，1994，343：692-695.

［9］ Botkin JR，Croyle RT，Smith KR，et al.A model protocol for evaluating the behavioral and psychosocial effects of BRCA1 testing［J］.J Natl Cancer Inst，1996，88：872-882.

［10］ Friedman E，Kotsopoulos J，Lubinski J，et al.Spontaneous and therapeutic abortions and the risk of breast cancer among BRCA mutation carriers［J］.Breast Cancer Res，2006，8：R15.

［11］ Mersch J，Jackson MA，Park M，et al.Cancers associated with BRCA1and BRCA2 mutations other than breast and ovarian［J］.Cancer，2015，121：269-275.

［12］ Handyside AH，Pattinson JK，Penketh RJ，et al.Biopsy of human preimplantation embryos and sexing by DNA amplification［J］.Lancet，1989，1（8634）：347-349.

［13］ Simpson JL.Preimplantation genetic diagnosis at 20years［J］.Prenat Diagn，2010，30：682-695.

［14］ Sagi M，Weinberg N，Eilat A，et al.Preimplantation genetic diagnosis for BRCA1／2-a novel clinical experience［J］.Prenat Diagn，2009，29：508-513.

［15］ Derks-Smeets IA，de Die-Smulders CE，Mackens S，et al.Hereditary breast and ovarian cancer and reproduction：an observational study on the suitability of preimplantation genetic diagnosis for both asymptomatic carriers and breast cancer survivors［J］.Breast Cancer Res Treat，2014，145：673-681.

［16］ Shenfeld F，Pennings G，Devroey P，et al.Preimplantation genetic diagnosis［J］.Hum Reprod，18：649-651.

［17］ HFEA.Authority decision on PGD policy （http：／／www.hfea.gov.uk／cps／rde／xchg／SID-3F57D79B-D0A79FB／hfea／hs.xsl／1124.html），2006.

［18］ Menon U，Harper J，Sharma J，et al.Views of BRCA gene mutation carriers on preimplantation genetic diagnosis as a reproductive option for hereditary breast and ovarian cancer［J］.Hum Reprod，2007，22：1573-1577.

［19］ Jasper MJ，Liebelt J，Hussey ND.Preimplantation genetic diagnosis for BRCA1 exon 13 duplication mutation using linked polymorphic markers resulting in a live birth［J］.Prenat Diagn，2008，28：292-298.

［20］ ESHRE PGD Consortium Steering Committee.ESHRE PGD Consortium data collection III（May 2001）［J］.Hum Reprod，2002，17：233-246.

［21］ ESHRE PGD Consortium Steering Committee.ESHRE PGD Consortium data collection IV：May-December 2001［J］.Hum Reprod，2005，20：19-34.

［22］ Vandervorst M，Liebaers I，Sermon K，et al.Successful preimplantation genetic diagnosis is related to the number of available cumulus-oocyte complexes［J］.Hum Reprod，1998，13：3169-3176.

［23］ ESHRE PGD Consortium Steering Committee.ESHRE PGD Consortium data collection VI：cycles from January to December 2003 with pregnancy follow-up to October 2004［J］.Hum Reprod，2007，22：323-336.

［24］ Van de Velde H，De Vos A，Sermon K，et al.Embryo implantation after biopsy of one or two cells from cleavagestage embryos with a view to preimplantation genetic diagnosis［J］.Prenat Diagn，2000，20：1030-1037.

［25］ 黃錦，劉平.單基因疾病的植入前遺傳學(xué)診斷研究進(jìn)展［J］.中國婦產(chǎn)科臨床雜志，2007，8：238-240.

［26］ Danuta M，Kinga J，Joanna L，et al.Comparison of whole genome amplification and nested-PCR methods for preimplantation genetic diagnosis for BRCA1gene mutation on unfertilized oocytes-apilot study［J］.Hered Cancer Clin Pract，2013，11：10.

［27］ Ramon YCT，Polo A，Martinez O，et al.Preimplantation genetic diagnosis for inherited breast cancer：first clinical application and live birth in Spain［J］.Fam Cancer，2012，11：175-179.

［28］ Drüsedau M，Dreesen JC，Derks-Smeets I，et al.PGD for hereditary breast and ovarian cancer：the route to universal tests for BRCA1and BRCA2 mutation carriers［J］.Eur J Hum Genet，2013，21：1361-1368.

［29］ Fiorentino F，Biricik A，Nuccitelli A，et al.Strategies and clinical outcome of 250 cycles of Preimplantation Genetic Diagnosis for single gene disorders［J］.Hum Reprod，2006，21：670-684.

［30］ Wells D，Sherlock JK.Strategies for preimplantation genetic diagnosis of single gene disorders by DNA amplification［J］.Prenat Diagn，1998，18：1389-1401.

［31］ Sherlock J，Cirigliano V，Petrou M，et al.Assessment of diagnostic quantitative fluorescent multiplex polymerase chain reaction assays performed on single cells［J］.Ann Hum Genet，1998，62：9-23.

［32］ Piyamongkol W，Bermúdez MG，Harper JC，et al.Detailed investigation of factors influencing amplification efficiency and allele drop-out in single cell PCR：implications for preimplantation genetic diagnosis［J］.Mol Hum Reprod，2003，9：411-420.

［33］ Spits C，De Rycke M，Van Ranst N，et al.Preimplantation genetic diagnosis for cancer predisposition syndromes［J］.Prenat Diagn，2007，27：447-456.

［34］ 黃文，陳松林.Duchenne型肌營養(yǎng)不良癥植入前遺傳學(xué)診斷研究進(jìn)展［J］.國外醫(yī)學(xué)婦幼保健分冊，2003，14：129-131.

［35］ 解云濤.家族性乳腺癌BRCA1、2基因突變檢測及臨床應(yīng)用［J］.中國實(shí)用外科雜志，2013，33：233-235.