劉媛，李博，陳書強(qiáng)，王東，孫惠君，董杰，周晶，郭雯娓，王曉紅

（第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院婦產(chǎn)科，西安 710038）

復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)（RSA）指連續(xù)發(fā)生3次或者以上自然流產(chǎn)［1］。其發(fā)病率占到不孕不育人群的10%～15%［2-3］，引起RSA 的病因各異，如染色體異常、內(nèi)分泌異常、免疫因素感染因素和解剖因素等，但約有50%RSA 原因不明［4］，因此治療效果欠佳，嚴(yán)重影響了廣大婦女的生殖健康。微小RNA 分子（microRNA，miRNA）是廣泛分布于動(dòng)植物細(xì)胞體內(nèi)，是一類內(nèi)源性非編碼的小分子RNA。我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，人絨毛組織中miR-133a的高表達(dá)與RSA 的發(fā)生顯著相關(guān)［5］，但具體的調(diào)控機(jī)制仍有待進(jìn)一步證實(shí)。本文擬研究miR-133a對(duì)HTR8-SVneo細(xì)胞黏附和侵襲能力的影響，為臨床干預(yù)提供理論依據(jù)和新的靶點(diǎn)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

1.細(xì)胞系：人類滋養(yǎng)層細(xì)胞系HTR8-SVneo由本實(shí)驗(yàn)室保存。

2.主要試劑及儀器：miR-133a的mimics、inhibitor、無義序列（上海吉瑪），脂質(zhì)體Lipfectamine 3000（Invitrogen，美國），DMEM／F12（1：1）培養(yǎng)基（Hyclone，美國），胎牛血清（Gibco，美國），Matrigel膠（BD，美國），光學(xué)顯微鏡、酶標(biāo)儀、熒光定量PCR分析儀（伯樂，美國）。

二、研究方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：HTR8-SVneo 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM／F12（1：1）培養(yǎng)基中，細(xì)胞置于5%CO2、95%濕度、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組：按照Lipfectamine 3000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前1d接種適量HTR8-SVneo細(xì)胞于6孔板中，細(xì)胞融合度達(dá)到50%～70%時(shí)轉(zhuǎn)染miR-133a的mimics、inhibitor、無義序列。以無義序列為空白對(duì)照。miR-133a的mimics序列為 5’-UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUG-3’，miR-133a 的 inhibitor 序 列 為 5 ’-CAGCUGGUUGAAGGGGACCAAA-3’，無義序列 為：5’-U UGUACUACACAAAAGUACUG-3’。轉(zhuǎn)染48h后，收集各組HTR8-SVneo細(xì)胞進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

3.實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 技術(shù)檢測(cè)各組HTR8-SVneo中miR-133a的表達(dá)：轉(zhuǎn)染后48h 后，采用miRNA 提取試劑盒（lifetechnologes，美國）提取各組細(xì)胞的總RNA，紫外分光光度儀測(cè)定RNA 濃度后，按照RT 試劑（上海吉瑪）說明書合成cDNA。miR-133a的引物序列，以U6 為內(nèi)參，引物序列見表1。引物由上海吉瑪公司合成。參照實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 試劑盒（上海吉瑪）說明書配制實(shí)時(shí)定量PCR 反應(yīng)體系，每個(gè)體系為20μl。PCR 反應(yīng)條件如下：95 ℃，3min；95 ℃12s，60 ℃40s，40個(gè)循環(huán)。具體操作按說明書進(jìn)行。以2△△t方法計(jì)算目的基因的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 PCR 實(shí)驗(yàn)引物序列

4.MTT 法檢測(cè)細(xì)胞黏附能力：鋪每孔2μg層粘連蛋白（LN）于96 孔板中，室溫干燥后，用2%BSA 的磷酸鹽緩沖液（PBS）20μl 37 ℃封閉1h，PBS洗3 次，每孔加入5×104個(gè)轉(zhuǎn)染后48h 的HTR8-SVneo細(xì)胞，5%CO2、95%濕 度、37 ℃培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)1.5h后，PBS輕輕洗2次，洗去未黏附細(xì)胞，棄去殘余PBS，每孔加入20μl MTT（5mg／ml），于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清，每孔加入150μl二甲基亞砜（DMSO）溶液，震蕩混勻后，于酶標(biāo)儀上測(cè)定550nm 處OD 值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。按下式計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率（IR）：

IR（%）＝（1—實(shí)驗(yàn)組平均OD 值／對(duì)照組平均OD 值）×100%。黏附率＝（1-抑制率）×100%。

5.Transwell法測(cè)細(xì)胞侵襲能力：Transwell小室的上下室之間以孔徑為8μm 的聚碳酸酯膜孔分隔開，濾膜上層鋪蓋人工基底膠（Matrigel，BD，美國）。室溫過夜干燥。在小室中加入100 μl 的DMEM 培養(yǎng)液，置于孵箱中孵育2h，使Matrigel水化。用0.25% 胰蛋白酶消化預(yù)先轉(zhuǎn)染48h 的HTR8-SVneo細(xì)胞，800r／min離心5 min，收集細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞2次，最后用2% DMEM 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×105個(gè)／ml。吸出小室內(nèi)的培養(yǎng)基，洗去500μl含10%血清的DMEM于下室中作為趨化因子，加100μl細(xì)胞懸液于內(nèi)室中，5%CO2、95% 濕度、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。取出Transwell小室，吸除培養(yǎng)基，用棉簽擦拭凈Transwell小室濾膜上層的Matrigel及未穿過濾膜的細(xì)胞。將小室侵入4% 的多聚甲醛中固定10min，風(fēng)干后于蘇木素染色液中染色20 min，采用蒸餾水沖洗，實(shí)驗(yàn)中每組每次同時(shí)做3個(gè)重復(fù)小室，顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，取平均值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、轉(zhuǎn)染后各組miR-133a表達(dá)

運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)各組轉(zhuǎn)染后miR-133a的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)染mimics的上調(diào)組miR-133a的表達(dá)明顯高于對(duì)照組（NC），轉(zhuǎn)染inhibitor的下調(diào)組miR-133a的表達(dá)明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖1）。

圖1 轉(zhuǎn)染后各組miR-133a的表達(dá)

二、MTT 法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞黏附能力的變化

轉(zhuǎn)染mimics的上調(diào)組細(xì)胞黏附能力較對(duì)照組顯著降低（P＜0.05），轉(zhuǎn)染inhibitor的下調(diào)組細(xì)胞的黏附能力較對(duì)照組顯著升高（P＜0.05）（表2）。

表2 miR-133a對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞黏附能力的影響［（

三、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞侵襲力的變化

通過比較各組細(xì)胞穿過人基質(zhì)膠細(xì)胞數(shù)量的多少，評(píng)估各組細(xì)胞的侵襲能力，每組取5個(gè)高倍鏡視野。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染mimics的上調(diào)組細(xì)胞侵襲能力較對(duì)照組顯著降低（P＜0.01），轉(zhuǎn)染inhibitor的下調(diào)組細(xì)胞的侵襲能力較對(duì)照組顯著升高（P＜0.01）（圖2）。

圖2 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞侵襲能力的變化。A、B、C分別為NC、inhibitor、mimics各組光學(xué)顯微鏡下觀察圖像 蘇木素染色 ×200；D：各組細(xì)胞侵襲能力統(tǒng)計(jì)學(xué)直方圖。

討 論

妊娠過程中，胎盤絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞在囊胚著床后便開始分化遷移，向子宮脫膜層和基層血管侵襲，啟動(dòng)螺旋動(dòng)脈的重塑過程［6］，這一過程是建立母胎循環(huán)的關(guān)鍵。絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞具有的侵襲功能是保證子宮螺旋動(dòng)脈重塑和妊娠順利完成的重要基礎(chǔ)。滋養(yǎng)層是獨(dú)特的上皮細(xì)胞，滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵潤能力與其粘附能力是緊密關(guān)聯(lián)［7］。miRNAs作為生物體重要的基因調(diào)控分子，在不同生理、病理期以及不同的組織細(xì)胞類型中，miRNAs的表達(dá)豐度不同［8］。miRNAs的異常表達(dá)可能與多種疾病的發(fā)生相關(guān)［9-14］。

前期研究提示：miR-133a在RSA 患者流產(chǎn)絨毛中表達(dá)量顯著上調(diào)。但是其具體的表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本研究首先采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染降調(diào)或者上調(diào)滋養(yǎng)層細(xì)胞系中miR-133a的表達(dá)，并通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)其轉(zhuǎn)染結(jié)果，采用MTT 法研究miR-133a對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞粘附，同時(shí)利用Transwell方法檢測(cè)miR-133a對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲的影響，結(jié)果顯示下調(diào)miR-133a的表達(dá)，能增強(qiáng)HTR8-SVneo細(xì)胞的黏附能力，以及侵襲能力。而上調(diào)miR-133a的表達(dá)，細(xì)胞的黏附能力和侵襲能力均降低。體外實(shí)驗(yàn)與前期的研究結(jié)果分析，說明復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)患者可能存在某種機(jī)制致使滋養(yǎng)層細(xì)胞中miR-133a表達(dá)量上調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞粘附及侵襲功能降低，而導(dǎo)致流產(chǎn)。

綜上所述，miR-133a在調(diào)控滋養(yǎng)層細(xì)胞粘附和侵襲方面發(fā)揮重要作用，很可能成為復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)侵襲的新的調(diào)節(jié)基因，為復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)臨床基因治療提供新的靶點(diǎn)。

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