馬曉勇 馬玉寶 楚國慶 丁玉梅 李建紅 金建寧

(寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院中醫(yī)科，寧夏 銀川 750004)

慢性胃炎是消化系統(tǒng)常見病，在我國人群中發(fā)病率高，其發(fā)病除了受外界環(huán)境因素刺激外，還與個(gè)體基因遺傳差異有關(guān)。目前，國內(nèi)外很多研究已證實(shí)環(huán)氧化酶－2(COX－2)基因多態(tài)性與慢性胃炎發(fā)病有關(guān)，但關(guān)于COX－2基因多態(tài)性與慢性胃炎中醫(yī)辨證分型研究卻不多見。隨著分子生物學(xué)技術(shù)和生物信息學(xué)發(fā)展，對(duì)慢性胃炎易感基因研究已成為該病發(fā)病機(jī)制研究熱點(diǎn)之一。目前，慢性胃炎中醫(yī)發(fā)病研究多采用辨病與辨證相結(jié)合模式，但若在病證結(jié)合基礎(chǔ)上探討慢性胃炎中醫(yī)辨證分型與基因多態(tài)性的相關(guān)性，將有利于中醫(yī)辨證分型客觀化和規(guī)范化，有利于進(jìn)一步提高慢性胃炎中醫(yī)辨證分型論治水平和臨床療效。我們應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)－限制性片段長度多態(tài)性(PCR－RFLP)方法檢測(cè)400例慢性胃炎中醫(yī)辨證分型患者COX－2－765G/C位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性(SNP)，并進(jìn)行基因分型，旨在探討慢性胃炎中醫(yī)證型與COX－2基因多態(tài)性的相關(guān)性，為慢性胃炎診治提供中西醫(yī)結(jié)合理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本組400例均為寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院中醫(yī)科2009－01—2013－10住院(226例)及門診(174例)患者，近3年居住生活在寧夏，男243例，女157例;年齡12～20歲5例，20～60歲295例，60～86歲100例。

1.2 病例選擇

1.2.1 診斷標(biāo)準(zhǔn) 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病學(xué)分會(huì)制訂的“中國慢性胃炎共識(shí)意見”［1］。中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》(試行)［2］可將慢性胃炎分為肝胃不和、脾胃虛弱、脾胃濕熱、胃陰不足、胃絡(luò)瘀血5種證型。

1.2.2 納入標(biāo)準(zhǔn) 符合慢性胃炎西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn);符合慢性胃炎中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn);年齡18～85歲之間，性別不限。

1.2.3 排除標(biāo)準(zhǔn) 慢性萎縮性胃炎伴重度異型增生、上消化道出血、消化道潰瘍、胃腸道腫瘤者;消化系統(tǒng)器質(zhì)性病變(如慢性胰腺炎、肝硬化等)，或有影響消化道動(dòng)力的全身疾病(如甲狀腺功能亢進(jìn)癥、糖尿病、慢性腎功能不全、精神和神經(jīng)系統(tǒng)病變等);伴有心、肝、腎等主要臟器嚴(yán)重病變、造血系統(tǒng)疾病以及腫瘤等患者;孕婦及哺乳期婦女;有神經(jīng)系統(tǒng)及精神疾病史。

1.3 觀察指標(biāo)及方法

1.3.1 一般記錄項(xiàng)目 收集所有患者臨床信息，包括年齡、性別、民族、癥狀、個(gè)人史、職業(yè)史、既往疾病史、家族史、吸煙史、飲食習(xí)慣、胃鏡檢查、Hp感染史及中醫(yī)辨證分型等。

1.3.2 觀察項(xiàng)目 對(duì)所有患者行中醫(yī)辨證分型并檢測(cè)COX－2基因表型分布和等位基因頻率。

1.3.3 標(biāo)本收集 抽取患者外周血作為檢測(cè)樣本，所有研究對(duì)象均于上午空腹抽取靜脈血標(biāo)本5 mL，然后注入含肝素抗凝劑的真空管中混勻，－80℃冰柜保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 基因檢測(cè) 運(yùn)用PCR－RFLP技術(shù)檢測(cè)COX－2－765G/C位點(diǎn)SNP并進(jìn)行基因分型?；驒z測(cè)與分型由寧夏醫(yī)科大學(xué)分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室專人負(fù)責(zé)完成。基因多態(tài)性分析的主要步驟包括:①全部患者均取外周靜脈血5 mL，采用基因組脫氧核糖核酸(DNA)快速提純?cè)噭┖?DNA Extractor WB－ Rapid Kit，WaKo code No 293－54803 200exp，日本W(wǎng)aKo pure化學(xué)有限公司)抽提基因組DNA，溶于TE(Tris+EDTA)緩沖液，－20℃保存?zhèn)溆谩＂贑OX－2－765G/C基因片段的擴(kuò)增;③限制性內(nèi)切酶消化擴(kuò)增片段COX－2－765G/C;④凝膠電泳;⑤基因分型。篩查出的COX－2－765G/C多態(tài)位點(diǎn)的PCR引物及其基因型分析均按文獻(xiàn)［3］進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn);基因型與疾病的危險(xiǎn)程度用比值比(OR)及95%可信區(qū)間(95%CI)來表示;多組用方差分析，F(xiàn)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 辨證分型情況 本組400例，肝胃不和型32例(8%)，脾胃虛弱型110例(27.5%)，脾胃濕熱型200例(50%)，胃陰不足型38例(9.5%)，胃絡(luò)瘀血型20例(5%)。表明辨證分型以脾胃濕熱型、脾胃虛弱型為主。

2.2 中醫(yī)證型COX－2－765G/C位點(diǎn)－分布情況 見表1。

表1 中醫(yī)證型COX－2－765G/C位點(diǎn)基因分布情況 例(%)

由表1可見，不同中醫(yī)證型檢測(cè)出基因表型比例不一，COX－2－765G/C位點(diǎn)基因型中，GG基因型以脾胃濕熱型為主，占45%，表明在GG基因型中脾胃濕熱型與其他各型比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。CC基因型以脾胃虛弱型為主，占17.5%，表明在CC基因型中脾胃虛弱型與其他各型比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 中醫(yī)虛證、實(shí)證COX－2－765G/C位點(diǎn)基因表現(xiàn)分布 見表2。

表2 中醫(yī)虛證、實(shí)證COX－2－765G/C位點(diǎn)基因表現(xiàn)分布 例(%)

由表2比較，實(shí)證組以GG為主，GG與GC、CC比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，GC與CC比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。虛證組以CC為主，CC與GG、GC比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，GG與GC比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

3 討論

3.1 COX－2基因多態(tài)性與慢性胃炎的相關(guān)性

環(huán)氧化酶(COX)又稱前列腺素內(nèi)氧化酶還原酶，是一種雙功能酶，具有環(huán)氧化酶和過氧化氫酶活性，是催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素的關(guān)鍵酶，從而在機(jī)體的生理和病理過程中發(fā)揮作用。COX包括COX－1和COX－2 2種異構(gòu)體，它們分別有不同的基因編碼。人類COX－1基因位于9號(hào)染色體，COX－2基因位于1號(hào)染色體。基因結(jié)構(gòu)不同決定了兩者結(jié)構(gòu)和功能差異。COX－1和COX－2在氨基酸水平上有60%一致性，盡管兩者有相似酶活性，但其生物學(xué)功能卻不同［4－6］。COX－1為結(jié)構(gòu)型表達(dá)基因，主要存在于血管、胃、腎等組織中，參與血管舒縮、血小板聚集、胃黏膜血流、胃黏液分泌及腎功能等調(diào)節(jié)，其功能與保護(hù)胃腸黏膜、調(diào)節(jié)血小板聚集、調(diào)節(jié)外周血管阻力和調(diào)節(jié)腎血流量分布有關(guān)［7］。COX－2是誘導(dǎo)型酶，參與病理?xiàng)l件下應(yīng)激反應(yīng)［8］。人類COX－2基因定位于染色體1q25.2－25.3，全長約8.3 kb，由10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，轉(zhuǎn)錄后形成4.5 kbmRNA，編碼604個(gè)氨基酸的開放閱讀框架，含有17個(gè)氨基酸殘基，在SDS－聚丙烯酰胺(SDS－PAGE)凝膠電泳上呈現(xiàn)2條帶，分子量為 72 000 和 74 000［9－10］，其中上游 5＇非翻譯區(qū)長約0.8 kb，含有一些與COX－2啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄激活密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，相關(guān)的順式作用元件主要有CRE/Ebox重疊區(qū)域(259/249)，NF/IL26結(jié)合位點(diǎn)(2132/124)和2個(gè)NF－κB結(jié)合位點(diǎn)(2445/2427和2223/2214)。生理狀態(tài)下，COX－2基因在絕大多數(shù)組織細(xì)胞中不表達(dá)，僅在腎和腦的部分組織中可見，只有在細(xì)胞內(nèi)外廣泛的刺激下才誘導(dǎo)性表達(dá)。刺激COX－2表達(dá)的因素主要包括:生長因子和細(xì)胞因子［如分類血小板衍生因子(PD－GF)、腫瘤壞死因子(TNF)、表皮生長因子(EGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(BFGF)等］、血清、促腫瘤劑、癌基因(如ras、V－rsc)及一氧化氮等。如在各種急性和慢性炎癥條件下，巨嗜細(xì)胞、單核細(xì)胞、上皮細(xì)胞、滑膜細(xì)胞和癌細(xì)胞呈COX－2陽性。COX－2表達(dá)的調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平上，即細(xì)胞受到生長因子和細(xì)胞因子、脂多糖、癌基因(如ras、KRAS)等各種刺激，經(jīng)過一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，如G蛋白偶聯(lián)機(jī)制、組織型纖溶酶原激活劑(TPA)活化的蛋白激酶C介導(dǎo)的通路以及生長因子受體、Src活化的酪氨酸激酶介導(dǎo)的通路，而作用于COX－2的5＇端的調(diào)控序列，促進(jìn)COX－2轉(zhuǎn)錄，從而誘導(dǎo)COX－2的表達(dá)［11］。目前，一些相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)COX－2蛋白在慢性胃炎、腸組織轉(zhuǎn)化和不典型性增生均有過度表達(dá)［12］。本研究發(fā)現(xiàn)COX－2啟動(dòng)子區(qū)存在765G/C單核苷酸變異，這些變異可能與慢性胃炎發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。但需進(jìn)一步證明攜帶765G/C等位基因COX－2表達(dá)量。

3.2 COX－2基因多態(tài)性與慢性胃炎中醫(yī)證型的相關(guān)性 證候研究一直是中醫(yī)領(lǐng)域研究熱點(diǎn)，有學(xué)者對(duì)中醫(yī)證候與基因多態(tài)性相關(guān)性進(jìn)行理論研究［13－15］。證作為機(jī)體對(duì)致病因素作出反應(yīng)后所處一種功能狀態(tài)，與致病因素性質(zhì)及強(qiáng)弱有關(guān)，即中醫(yī)所謂同病異證、異病同證?；蚪M學(xué)認(rèn)為，基因表達(dá)差異及基因序列多態(tài)性決定個(gè)體差異，個(gè)體體質(zhì)多樣性決定了個(gè)體對(duì)內(nèi)外環(huán)境的影響，從而表現(xiàn)出各種證的差異性，故我們認(rèn)為基因多態(tài)性與中醫(yī)證候之間存在必然聯(lián)系。觀察結(jié)果顯示，COX－2－765G/C、基因型頻率在中醫(yī)各證型中存在差異，COX－2－765G/C基因多態(tài)性與慢性胃炎脾胃濕熱型、脾胃虛弱型發(fā)生有相關(guān)性，在脾胃濕熱型慢性胃炎患者中以GG基因型為主，脾胃虛弱型患者中以CC基因型為主;實(shí)證與虛證比較發(fā)現(xiàn)，實(shí)證組GG基因頻率明顯增高，虛證組CC基因頻率明顯增高。提示通過COX－2基因多態(tài)性檢測(cè)，為慢性胃炎中醫(yī)辨證分型及虛實(shí)證提供理論依據(jù)。基因變異可能是慢性胃炎中醫(yī)虛實(shí)證發(fā)生過程的重要遺傳因素;COX－2－765G/C位點(diǎn)GG、CC基因頻率可能與慢性胃炎虛實(shí)辨證相關(guān)。

綜上所述，研究了 COX－2啟動(dòng)子區(qū)－765G/C基因型與慢性胃炎中醫(yī)辨證分型間的聯(lián)系，但是否依據(jù)COX－2基因多態(tài)性作為慢性胃炎中醫(yī)分型依據(jù)或標(biāo)準(zhǔn)，以及不同COX－2基因表型對(duì)中醫(yī)辨證施治能否作為指導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)，還需要進(jìn)一步研究證實(shí)，假如成立，這樣就會(huì)對(duì)慢性胃炎給予早期預(yù)防和干預(yù)治療，對(duì)提高人民群眾健康水平具有重大社會(huì)意義。

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